异基因骨髓移植小鼠联合输注IL-3/IL-6双基因转导的骨髓基质细胞促进造血恢复

探讨用逆转录病毒载体转入IL 3和IL 6双基因的骨髓基质细胞系QXMSC1IL 3/IL 6对异基因骨髓移植小鼠造血功能的促进作用。用逆转录病毒载体 (含小鼠IL 3cDNA ,人IL 6cDNA)分别转导到骨髓基质细胞系QXMSC1(H 2 d) ,构建骨髓基质细胞系QXMSC1IL 3/IL 6。供体小鼠BALB/c(H 2 d)骨髓去除骨髓中T细胞 ,受体小鼠C57BL/6(H 2 b)经γ射线致死量照射后 ,输入去除T细胞的供体骨髓 (1× 1 0 7/鼠 )的同时输入骨髓基质细胞QXMSC1IL 3/IL 6(5× 1 0 5/鼠 )。在骨髓移植后 2 0和 40天 ,分别检测骨髓移植小鼠外周血RBC ,WBC和骨髓有核细胞数及骨髓中CFU S ,CFU GM ,CFU E和CFU GEMM数。结果 :异基因骨髓移植共输入QXMSC1IL 3/IL 6基质细胞系可使异基因骨髓移植小鼠外周血RBC ,WBC数明显恢复 ,骨髓中有核细胞数 ,CFU S ,CFU GM ,CFU E和CFU GEMM明显增加。基质细胞系QXMSC1可作为有效的基因载体促进骨髓移植后造血功能重建。结论 :基质细胞转入细胞因子IL 3或IL 6基因可以进一步促进骨髓移植后造血功能重建 ,联合转导IL 3和IL 6有协同作用     

转染IL-3基因的骨髓基质细胞促进骨髓移植小鼠造血功能重建

为了探讨可调控表达IL 3基因的骨髓基质细胞系对异基因骨髓移植小鼠造血功能重建的促进作用 ,建立了可诱导表达IL 3基因的工程化骨髓基质细胞系QXMSC1tet on +IL 3,加入多西环素 (Dox)诱导骨髓基质细胞系表达IL 3并检测其活性。C5 7BL/ 6 (H 2 b)小鼠经γ射线致死剂量照射后 ,输入供体BALB/C(H 2 d)小鼠去除T细胞的骨髓细胞 1× 10 7/只 ,同时输注骨髓基质细胞QXMSC1tet on +IL 35× 10 5/只 ,并灌服多西环素诱导IL 3表达。在第 30天 ,6 0天检测骨髓移植小鼠外周血红细胞 ,白细胞数 ,骨髓有核细胞数 ,骨髓CFU S ,CFU GM ,CFU E和CFU GEMM数。结果表明 :成功建立可诱导表达IL 3基因的骨髓基质细胞系QXMSC1tet on +IL 3,异基因骨髓移植共输注基质细胞系QXMSC1tet on +IL 3可使异基因骨髓移植小鼠外周血红细胞、血小板、白细胞明显恢复 ,骨髓中有核细胞数 ,CFU S ,CFU GM ,CFU E ,CFU GMEE明显增加。结论 :输注基因工程化基质细胞 ,并诱导细胞因子IL 3基因表达可以进一步促进异基因骨髓移植小鼠造血功能重建     

小鼠IL-3 cDNA转染的骨髓基质细胞促进造血的实验研究

骨髓基质细胞是造血微环境中的重要组成部分。我们借助逆转录病毒载体将小鼠白细胞介素 3(ＩＬ 3)ｃＤＮＡ导入小鼠骨髓基质细胞 ,利用聚合酶链反应 (ＰＣＲ)检测基质细胞是否导入外源性ＩＬ 3基因 ,并观察其对造血细胞增殖活性的影响。材料和方法1　材料　逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ及ｐＵＣ ＩＬ 3质粒由刘昕博士馈赠 ,工具酶购自宝灵曼及新英格兰公司 ,ＢＡＬＢ ｃ小鼠购自本校动物中心。2　重组ＩＬ 3ｃＤＮＡ的构建[1 ] 　用ＸｈｏⅠ将载体ｐＬＸＳＮ线性化并将ＩＬ 3ｃＤＮＡ由ｐＵＣ ＩＬ 3质粒上切下 (片段约 1.2ｋｂ) ,经Ｖ型槽回收…     

IL-6基因转染的骨髓基质细胞系对骨髓移植小鼠造血功能恢复的促进作用

目的:探讨白细胞介素6(IL-6)基因转染的骨位基质细胞系QXMSC, IL6对骨髓移植后造血功能的重建作用。方法:将骨髓造血细胞和骨髓基质细胞系一起经尾静脉注射给同系小鼠,建立骨髓移植(BMT)模型。小鼠的造血功能用脾结节(CFU-S)、粒-单系祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU-E、BFU-E)测定及外周血各项血液学指标来确定。结果:QXMSC_1 IL-6转基因骨髓基质细胞可明显增强BMT小鼠形成的CFU-S、CFU-GM、CFU-E和BFU-E数,促进外周血象的恢复。结论:QXMSC_1 IL-6细胞可明显促进小鼠骨髓移植后早期造血功能重建。     

PCR－DNA指纹图识别异基因骨髓移植后重建造血的细胞起源

用多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增多态性小卫星ＤＮＡ的３３．１，３３．６位点，联合地高辛标记寡核苷酸探针杂交方法，以小卫星ＤＮＡ的ＰＣＲ－ＤＮＡ指纹图为特异性遗传标志，识别２例慢性粒细胞白血病患者接受同胞供髓的骨髓移植后造血重建的细胞起源。结果显示均有供者源性造血细胞植活。该方法灵敏度高，特异性强，无同位素污染，尤其适用于同性别、同血型、ＨＬＡ全相合的异基因骨髓移植植活指标的监测。     

供体TReg细胞对小鼠异基因骨髓移植后GVHD和造血重建的影响

本研究探讨供体CD4^＋CD25^＋调控T细胞（regulatoryTcell,TReg）输注对异基因骨髓移植（allo-BMT）后小鼠移植物抗宿主病（GVHD）和造血重建的影响。建立C57BL/6→BALB/c小鼠allo-BMT模型,体外磁珠分离纯化供鼠外周血CD4＋CD25＋TReg细胞,接受移植的小鼠随机分为3组,在移植骨髓后6-8小时分别予尾静脉输注CD4^＋CD25^＋T细胞、CD4^＋CD25^-T细胞和RPMI1640培养液（空白对照）。以移植后GVHD表现,肝、脾、小肠组织病理形态、生存期及白细胞（WBC）、血小板（Plt）的重建为观察指标并进行组间比较。结果显示：TReg阳性细胞移植组,TReg阴性细胞移植组和空白对照组小鼠WBC〉1.0×10^9/L的时间分别为（8.14±3.26）天、（17.62±5.71）天、（19.81±6.77）天;Plt〉20.0×10^9/L的时间分别为（5.29±1.34）天、（8.97±3.44）天、（9.52±3.92）天,TReg阳性细胞移植组WBC和Plt恢复时间比TReg阴性组与空白对照组快（P〈0.05）。3组小鼠在移植后15天GVHD评分为（1.33±0.58）、（1.80±0.27）、（1.93±0.45）,TReg阳性细胞移植组小鼠与TReg阴性细胞移植组、空白对照组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。移植后（25-30天）的TReg阳性细胞移植组小鼠肝、脾、小肠GVHD病理损害较同期TReg阴性细胞移植组与空白对照组小鼠有一定程度的减轻。3组小鼠移植后平均存活时间分别为（41.45±17.88）天、（18.75±14.39）天和（25.67±16.84）天,TReg阳性细胞移植组小鼠平均存活时间较TReg阴性细胞、空白对照组小鼠延长（P〈0.05）。结论：小鼠allo-BMT后输注供体TReg细胞可以减轻移植后GVHD程度,延长小鼠生存期,促进造血重建。     

白细胞介素3基因疗法对同基因骨髓移植造血重建的影响

以大剂量化疗后进行同基因骨髓移植小鼠为实验模型，观察了成纤维细胞介导的白细胞介素３（ＩＬ－３）基因疗法对骨髓移植后造血重建的影响。结果表明，ＩＬ－３基因疗法能显著升高骨髓移植后外周血白细胞及血小板水平，显著促进骨髓ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｍｅｇ、ＣＦＵ－Ｅ集落形成，证明ＩＬ－３基因疗法能显著加快骨髓移植后造血重建过程，从而为提高骨髓移植的成功率提出了新的方法。     

IL—6基因转染的骨髓基质细胞系对骨髓移植小鼠造血功能恢复？…

目的：探讨白细胞介素６（ＩＬ－６）基因转染的骨髓基质细胞系ＱＸＭＳＣ１ＩＬ－６对骨髓移植后造血功能的重建作用。方法：将骨髓造血细胞和骨髓基质细胞系一起经尾静脉注射给同系小鼠，建立骨髓移植（ＢＭＴ）模型。小鼠的造血功能用脾结节（ＣＦＵ－Ｓ）、粒－单系祖细胞（ＣＦＵ－ＧＭ）、红系祖细胞（ＣＦＵ－Ｅ、ＢＦＵ－Ｅ）测定及外周血各项血液学指标来确定。结果：ＷＸＭＳＣ１ＩＬ－６转基因骨髓基质细胞可明显增强ＢＭ     

多西环素诱导表达下IL-3基因转染小鼠骨髓基质细胞促进造血

本研究探讨用多西环素调控IL-3基因表达的小鼠骨髓基质细胞系对小鼠造血干细胞增殖分化的促进作用。构建含小鼠IL-3基因逆转录病毒载体系统，转染小鼠骨髓基质细胞系，获得QXMSClTet-on-IL-3；体外加入多西环素诱导IL-3基因表达并检测IL-3表达活性；观察细胞培养条件上清液对造血祖细胞集落形成单位的作用及QXMSClTet-on-IL-3与骨髓细胞共培养对造血干细胞增殖分化的影响。结果表明：多西环素提高了QXMSClTet-on-IL-3细胞系IL-3的表达，促进骨髓造血祖细胞克隆形成数；与骨髓细胞共培养可促进造血干细胞的增殖分化。结论：应用多西环素诱导外源基因转染的骨髓基质细胞IL-3的表达，可促进造血。     

NK细胞对异基因骨髓移植中移植排斥和造血及免疫重建的影响

本研究探讨自然杀伤（NK）细胞在小鼠异基因骨髓移植（allo—BMT）中对移植排斥、造血及免疫重建的影响。以C57BL／6（H-2^b）小鼠为供鼠、BALB／c（H-2^d）小鼠为受鼠，分别在致死剂量和非致死剂量（≤7．0Gy）全身照射（TBI）的预处理条件下进行allo—BMT，移植同时输注供鼠外周T细胞和（或）NK细胞，移植后不同时间检测受鼠外周血白细胞、骨髓CD34^＋细胞数和外周血淋巴细胞中CD3^＋细胞、CD19^＋细胞及供鼠来源的H-2K^b＋细胞表达的百分率，并对不同移植组的存活率、植入与排斥、造血及免疫重建进行比较。结果表明：在致死剂量TBI预处理的移植中，输注NK细胞与不输注NK细胞的移植组比较，存活率显著增高（60天存活率为70％vs 0．0％）；白细胞数、CD19^＋细胞表达及骨髓CD34^＋细胞数恢复快；H-2K^b＋细胞的表达水平高[（86．68±4．45）％vs（4．68±0．32）％]。移植后28天输注NK细胞组CD3^＋细胞表达水平明显低于不输注NK细胞组[（33．69±3．36）％们（50．40±5．06）％，P〈0．01]，移植后60天两组比较差异无显著性（P〉0．05）。在非致死剂量TBI预处理的移植中，移植后30天．异基因骨髓移植组H-2K^b＋细胞表达率明显下降，移植后60天已下降至移植前水平；而输注高浓度和低浓度NK细胞的两组在移植后60天仍能检测到80％以上的H-2^b＋细胞表达。结论：在小鼠allo—BMT中，同种异基因反应性NK细胞可以抑制移植排斥，提高造血干细胞的植入水平，促进造血及免疫重建并增加移植受鼠的生存率。     

促血小板生成素基因转染小鼠骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨促血小板生成素（TPO）基因修饰的小鼠骨髓基质细胞（BMSCs）对TPO基因的表达的影响。方法用脂质体lipofectamine^TM2000将TPO cDNA真核表达质粒转染至骨髓基质细胞（BMSCs），RT—PCR方法检测TPO mRNA的表达，免疫组化法测定TPO的表达。结果转染TPO基因的BMSCs TPO mRNA及TPO表达量明显高于空载体组（P〈0．01）及未转染组（P〈0．01）。结论阳离子脂质体能有效介导TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs，且转染后BMSCs中TPO mRNA及TPO的表达显著上调。     

川芎嗪对BMT后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达水平的影响

本研究探讨川芎嗪对骨髓移植（BMT）后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达水平的影响及其促进骨髓造血重建的机制。取健康BALB／c小鼠，随机分为3组：正常组（不做处理），BMT＋生理盐水组（简称生理盐水组）和BMT＋川芎嗪治疗组（简称川芎嗪组）。生理盐水组和川芎嗪组分别胃饲生理盐水0．2毫升／只和川芎嗪注射液每次2毫克／只，2次／天，直至处死为止。在BMT后第7、14、21、28天处死小鼠，用RT—PCR和Western blot方法检测骨髓基质细胞bFGF mRNA及其蛋白表达水平。结果表明：BMT后第7、14、21天川芎嗪组和生理盐水组骨髓基质细胞bFGF mRNA及其蛋白的表达均明显低于正常组（P〈0．01或P〈0．05），但川芎嗪组明显高于生理盐水组（P〈0．01或P〈0．05），到第28天，川芎嗪组bFGF mRNA及其蛋白的表达已恢复正常，而生理盐水组仍未恢复正常，两组之间有显著性差异（P〈0．01）。结论：川芎嗪可能通过增加bFGF的表达水平而促进骨髓微环境的修复，加速BMT后骨髓的造血重建。     

LAK细胞和活化NK细胞对小鼠骨髓造血功能影响的实验研究

目的 探讨淋巴细胞因子激活的杀伤细胞／ 活化自然杀伤细胞（ＬＡＫ 细胞／ 活化ＮＫ 细胞）与造血的关系及其对同基因骨髓移植小鼠造血重建的影响。方法 ①将同基因ＬＡＫ 细胞／ 活化ＮＫ 细胞与骨髓细胞一起置于体外半固体琼脂培养体系中,观察其对ＣＦＵＧＭ 形成的影响。②在小鼠同基因骨髓移植中, 联合注射同基因ＬＡＫ 细胞／ 活化ＮＫ 细胞, 观察其对移植后小鼠造血重建的影响。结果①当骨髓细胞置于有外源性集落刺激因子（ＣＳＦ） 的适宜培养体系中,同基因ＬＡＫ 细胞／ 活化ＮＫ 细胞抑制ＣＦＵＧＭ 形成;而当骨髓细胞置于无ＣＳＦ 不良培养体系中,同基因ＬＡＫ 细胞／ 活化ＮＫ 细胞促进ＣＦＵＧＭ 形成。②在小鼠同基因骨髓移植中,联合注射同基因ＬＡＫ 细胞／ 活化ＮＫ 细胞,能显著促进ＣＦＵＳ 和ＣＦＵＧＭ 增殖和显著升高白细胞和血小板数量。结论 ①同基因ＬＡＫ 细胞／ 活化ＮＫ 细胞对ＣＦＵＧＭ 形成有双向调节作用。②在小鼠同基因骨髓移植中,联合注射同基因ＬＡＫ 细胞／ 活化ＮＫ 细胞,能促进移植后小鼠造血重建。     

FLT3配基基因在人骨髓基质细胞中的表达

目的 构建人FLT3配基（FL）逆转录病毒载体，并观察其在人骨髓基质细胞中的表达。方法 用基因重组技术，将FLcDNA插入逆转录病毒载体pLXIN，获得重组载体pLFIN。采用脂质体法将重组质粒pLFIN转染包装细胞PA317，G418筛选抗性克隆，用抗性克隆上清液感染人骨髓基质细胞，RT-PCR和基因组DNA-PCR检测外源基因mRNA的转录及染色体的整合，ELISA法和小鼠CFU-GM集落形成法检测FL蛋白表达量和生物学活性。结果 酶切鉴定表明成功构重组逆转录病毒载体pLFIN；染色体基因组中整合有外源基因FL和Neo；在mRNA和蛋白质水平均可检测到FL表达；24hFL蛋白表达量为4.35ng/ml，活性测试结果显示转染的骨髓基质细胞分泌FL。结论 逆转录病毒介导的FL在骨髓基质细胞中获得表达，并具有良好的生物学活性，为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血调控的影响提供了实验依据。     

小鼠骨髓细胞体外扩增及其造血重建的研究

目的：观察干细胞因子（ＳＣＦ）与白细胞介素（ＩＬ）－１或ＩＬ－３联合对经５氟尿嘧啶（５ＦＵ）处理的骨髓细胞的体外扩增作用和体外扩增细胞移植的小鼠造血恢复能力。方法：在含有细胞因子的液体培养体系中培养５ＦＵ处理的骨髓细胞，观察粒－巨噬细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＭ）和高增殖潜能集落形成细胞（ＨＰＰ－ＣＦＣ）数量的增加以及移植扩增细胞的小鼠外周血细胞恢复。结果：单用ＳＣＦ无扩增作用，但ＳＣＦ与ＩＬ－１或ＩＬ－３联合时，与对照组相比较ＣＦＵ－ＧＭ分别增加３３．７±１８．１倍和１８．１±６．３倍。ＨＰＰ－ＣＦＣ分别扩增１７．８±１０．５倍和１２．７±９．１倍。移植体外扩增细胞组与对照组比较，外周血细胞恢复时间缩短１～３天，并且生存率也显著提高。结论：在液体培养体系中ＳＣＦ与ＩＬ－１或ＩＬ－３联合对造血细胞扩增有协同作用，并且体外扩增后的骨髓细胞能加速移植受体的早期造血重建。     

长期培养的人骨髓基质细胞中有关造血调节的粘附蛋白表达的研究

目的：研究骨髓基质细胞支持造血的分子基础。方法；应用免疫胶体金单标和双标记技术，在长期培养的骨髓基质细胞（HLTBMC）粘附层中，对各种造血调节有关的粘附蛋白进行了免疫电镜定位。结果：长期培养的骨髓基质细胞上均可显示各种粘附蛋白的表达，一些双标记证明各种粘附蛋白与某些细胞的特异性标记（vWF和Fb-sp）是共存的，表明在HLTBMC中的内皮细胞和成纤维细胞可合成和分泌各种粘附蛋白，这些粘附蛋白结合在基质细胞表面膜和细胞外基质上，结论：粘附蛋白与基质细胞分泌的各种生长因子一起，构成了一个支持造血的复杂网络，是基质细胞支持造血的分子基础。     

腺病毒介导的BMP-2基因转染骨髓基质干细胞及种植异种骨支架的体外观察

目的　用人骨形态发生蛋白 2腺病毒表达载体 (Ad BMP 2 )转染的兔骨髓基质干细胞 (BMSC) ,种植BCB(去抗原牛松质骨 )支架体外构建组织工程骨。方法　蛋白印迹法检测转染后细胞BMP 2的表达 ,ALP活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果　转染后 ,BMSC表达BMP 2 ,ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论　Ad BMP 2可高效转染BM SC ,且促进细胞分化。转染后细胞在BCB上生长良好 ,BMP 2基因治疗的组织工程骨构建成功     

体外转染JWA核酶逆转录病毒载体对人骨髓基质细胞黏附功能的影响

目的探讨JWA核酶基因转染对人骨髓基质细胞(BMSC)黏附功能的影响。方法设计合成JWA核酶基因并构建于逆转录病毒载体pLXSN上,转染体外培养的人BMSC(BMSC-JWARZ组),应用半定量RT-PCR法(sqRT-PCR)测定细胞内JWA mRNA的表达,流式细胞仪检测BMSC细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管黏附分子-1(VCAM-1)的表达,并检测共培养条件下BMSC对Jurkat细胞的黏附率及Jurkat细胞增殖变化。以pLXSN空载体转染的BMSC(BMSC-pLXSN组)及未转染细胞(BMSC组)为对照。结果BMSC-JWARZ组JWA mRNA表达量[吸光度(A)值]为0．187±0．045,较BMSC-pLXSN组(0．382±0．039)及BMSC组(0．366±0．048)显著降低;BMSC-JWARZ组细胞表面ICAM-1阳性细胞率为(16．11±3．93)％,较B-pLXSN组[(38．24±5．37)％]及BMSC组[(36．27±6．19)％]显著降低;BMSC-JWARZ组细胞表面VCAM-1阳性细胞率为(12．08±3．34)％,较BMSC- pLXSN组[(26．88±5．17)％]及BMSC组[(24．55±3．68)％]显著降低;B-JWARZ组细胞对Jurkat细胞的黏附率为(23．65±5．27)％,较BMSC-pLXSN组[(35．14±8．11)％]及BMSC组[(33．72±6．29)％]显著降低,与BMSC-JWARZ组细胞共培养的Jurkat细胞倍增时间为58．7 h,明显长于与BMSC-pLXSN组(44．1 h)及BMSC组(43．7 h)细胞共培养时。结论JWA核酶基凶转染可抑制人BMSC内JWA基因的表达,抑制骨髓基质细胞黏附功能。