肝星状细胞凋亡研究进展

近年来,肝星状细胞在肝纤维化过程中的作用得到广泛重视。本文综述了国外肝星状细胞凋亡的研究进展。分别对肝星状细胞凋亡的活化机制,基因调控机制及其在抗肝纤维化中的意义作了介绍。     

肝星状细胞凋亡研究进展

近年来,肝星状细胞在肝纤维化过程中的作用得到广泛重视。本文综述了国外肝星状细胞凋亡的研究进展,分别对肝星状细胞凋亡的活化机制、基因调控机制及其在抗肝纤维化中的意义作了介绍。     

脂质体转染大鼠肝星状细胞的实验研究

目的运用脂质体Lipofectamine 2000转染大鼠肝星状细胞（HSC-T6）,比较不同质粒与脂质体比例及不同时刻转染HSC后绿色荧光蛋白的表达,确定高表达阳性克隆G418筛选条件。方法将细胞按质粒与脂质体的不同比例分为四组：A组（2ug：3u L）,B组（2ug：4u L）,C组（2ug：5u L）,D组（2ug：6u L）混合后转染大鼠HSC,约24 h观察转染率,以最高转染率的质粒与脂质体混合,转染大鼠HSC,比较转染后24、48、72 h的转染率;用不同浓度G418进行筛选,确定筛选最佳浓度,通过G418筛选建立高表达EGFP的HSC-T6阳性克隆。结果转染24 h后,各组均有绿色荧光蛋白的表达,与A、B、D组比较,C组转染率明显增高（P〈0.05）,质粒与脂质体以2ug：5u L转染HSC后,随时间延长,转染后48 h转染率最高（P〈0.05）,72 h有所下降,G418筛选最佳浓度为400 ug/m L,经筛选约21d后可阳性克隆,更换为正常培养液可继续培养和传代。结论 Lipofectamine 2000可有效转染HSC,经G418筛选形成阳性克隆,为基因治疗肝纤维化的研究提供依据。     

四氯化碳对体外培养肝星状细胞钙浓度的影响

目的研究四氯化碳(CC l4)对肝星状细胞内游离Ca2 ([Ca2 ]i)的影响。方法用常规的细胞培养方法,每组加入5~15 mmol/L的CC l4处理细胞,分别作用2~8 h后,以F luo-3/AM进行荧光染料负载,用激光共聚焦显微镜观察不同剂量CC l4作用不同时间[Ca2 ]i的变化。结果CC l4在5~15 mmol/L范围内可明显增加肝星状细胞[Ca2 ]i,且[Ca2 ]i随CC l4剂量的增大而升高(P<0.05),作用2 h后,各组[Ca2 ]i均上升,与对照组比较差异有显著性(P<0.05),4 h后各组[Ca2 ]i继续升高;8 h后各组[Ca2 ]i维持在较高水平,各组分别与作用4 h比较差异均无显著性(P<0.05)。结论CC l4可能引起肝星状细胞[Ca2 ]i升高。     

PPARγ对肝纤维化肝星状细胞的影响

肝纤维化是肝脏受到各种致病因素的炎症刺激后组织修复失控的病理过程。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是其发展的关键环节。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)与HSC的关系密切,其干扰肝纤维化的形成及发展,有望成为新型抗纤维化药物。     

姜黄素对肝星状细胞增殖能力影响

目的探讨姜黄素对体外培养大鼠肝星状细胞细胞株(CSFSC-2G)增殖能力及细胞外基质分泌的影响。方法四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度姜黄素(5,10,15,20,40μmol/L)在不同培养时间作用下肝星状细胞(HSC)的增殖能力;酶联免疫吸附实验法检测不同浓度姜黄素作用下HSCI型胶原(CollagenI,ColI)和Ⅲ型胶原(CollagenⅢ,ColⅢ)合成及分泌能力;流式细胞术检测姜黄素对HSC凋亡的影响。结果不同浓度的姜黄素(5,10,15,20,40μmol/L)均可抑制HSC增殖,并呈现明显剂量依赖关系;含20μmol/L姜黄素培养基培养24h后,HSC-ColI、ColⅢ吸光度(A)值分别为(0.418±0.019),(0.554±0.043),均明显低于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05);含20μmol/L姜黄素培养基培养48h后,HSC处于G0/G1期的HSC细胞占(39.98±8.07)%,S期细胞占(55.79±9.13)%,G2/M期细胞占(4.23±0.12)%;凋亡率为(20.31±2.55)%,高于阴性对照组凋亡率(0.22±0.11)%,低于秋水仙素阳性药物对照组凋亡率(29.75±2.64)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论姜黄素可抑制HSC细胞的增殖并促进其凋亡,有可能成为防治肝纤维化的理想药物。     

川芎嗪对肝星状细胞增殖及分泌细胞外基质的影响

目的观察川芎嗪对大鼠肝星状细胞增殖及分泌细胞外基质分泌的影响。方法用不同浓度的川芎嗪处理大鼠肝星状细胞;以MTT比色法测定细胞的增殖;放射免疫法测定透明质酸和层粘连蛋白;酶联免疫吸附法(ELISA)测定I型胶原的水平。结果川芎嗪可剂量依赖性地抑制HSC增殖,不同程度抑制I型胶原、透明质酸和层粘连蛋白分泌。结论川芎嗪可显著抑制HSC的增殖及分泌细胞外基质。     

川芎嗪对肝星状细胞增殖及分泌细胞外基质的影响

目的观察川芎嗪对大鼠肝星状细胞增殖及分泌细胞外基质分泌的影响。方法用不同浓度的川芎嗪处理大鼠肝星状细胞;以MTT比色法测定细胞的增殖;放射免疫法测定透明质酸和层粘连蛋白;酶联免疫吸附法(ELISA)测定I型胶原的水平。结果川芎嗪可剂量依赖性地抑制HSC增殖,不同程度抑制I型胶原、透明质酸和层粘连蛋白分泌。结论川芎嗪可显著抑制HSC的增殖及分泌细胞外基质。     

小鼠滋养层细胞原代培养方法的优化

目的 建立一种简便、有效的小鼠滋养层细胞原代培养方法,为研究病理妊娠的发生机制奠定基础.方法 分别在K.Handschuh和Zhou WH方法的基础上进行改良,获取孕鼠滋养层细胞,进行原代培养,并应用细胞计数及免疫细胞化学法比较滋养层细胞数量和纯度.结果 K.Handschuh改良法和Zhou WH改良法获得滋养层细胞数目分别为(11.4±1.8)×104个/mL、(16.3±0.9)×104个/mL,纯度分别为95%、96%,在获得滋养层细胞数目方面Zhou WH改良法优于K.Handschuh改良法(P<0.05).结论 Zhou WH改良法可获得高纯度足量的小鼠滋养层细胞.     

亚砷酸钠对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨亚砷酸钠对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖与凋亡的影响。方法取处于对数生长期的HSC-T6细胞,调整细胞密度为4×10~4/ml,分别暴露于含终浓度为0(对照)、5、15、25μmol/L亚砷酸钠的DMEM高糖培养基24、48、72 h。采用MTT比色法检测细胞增殖活性;采用流式细胞术检测细胞早期凋亡率。结果随染毒剂量和时间增加,5μmol/L组的细胞增殖活性高于对照组,差异有统计学意义(P0.05),25μmol/L组的细胞增殖活性低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。HSC-T6细胞形态由染毒前的椭圆形和不规则形转变为染毒后的索条形,有纤维化倾向。随着染毒时间延长,染毒剂量升高,HSC-T6细胞早期凋亡率随之增高,差异有统计学意义(P0.05),具有剂量-效应和时间-效应关系。结论低剂量亚砷酸钠暴露促进肝星状细胞增殖,高剂量亚砷酸钠暴露抑制肝星状细胞增殖,会改变细胞形态,促进细胞凋亡,具有明显的细胞毒性。     

Lycopene isomerisation and storage in an in vitro model of murine hepatic stellate cells

Background  Lycopene is a carotenoid whose biological activities and protective effect on prostate and breast cancer have been described, but little is known on its extra-intestinal metabolism and storage. While most alimentary lycopene is in all-trans configuration, in animal and human tissues approximately half of the lycopene is in cis isoforms. Aim of study  Our object was to monitor the capacity of storage, isomerisation, and intracellular localization of all-trans and cis lycopene in hepatic stellate cells, which are the major sites of metabolism and storage of retinoids and carotenoids in the body. Methods  We used the GRX cell line representative of murine hepatic stellate cells, incubated with 1–30 μM lycopene in culture medium. Analysis was done by high-performance liquid chromatography. Results  Lycopene was able to induce expression of the lipocyte phenotype and it was internalized into GRX cells. Its cellular release only occurred in presence of albumin with a rapid initial decrease of intracellular lycopene. A corresponding increase in the culture medium was observed at 24 h. All-trans, 13-cis and 9-cis lycopene isoforms were identified in all the cell compartments. The membrane fraction contained the major part of lycopene, followed by the cytoplasmic fraction, lipid droplets and nuclei. The ratio between all-trans and cis isomers was approximately 2/1 in the majority parts of cell compartments. Conclusions  This study identified a novel hepatic cell type able to store and isomerise lycopene. Liver can contribute to the serum and tissue equilibrium of cis/trans isomers of lycopene, and to participate in storage of lycopene under high extracellular concentration such as observed after the alimentary input.     

小鼠睾丸支持细胞的原代培养和鉴定

目的 建立小鼠睾丸支持细胞培养方法，为从细胞和分子水平研究环境化合物对雄性生殖系统的影响提供条件。方法 采用两步胶原酶消化，提取出生10d的ICR雄性小鼠睾丸支持细胞，用Tris-HCl处理后除去生精细胞，进一步纯化。倒置相差显微镜和苏木精-伊红（HE）染色观察细胞生长和形态。Feulgen染色法鉴定支持细胞。结果 培养的支持细胞增生活跃，纯度〉95％，Feulgen染色后明显可见支持细胞核内的双极小体。结论 酶消化法分离和Feulgen染色法鉴定大鼠支持细胞简单易行，且细胞纯度较高。为今后研究生殖毒理提供了条件和方法。     

胰高糖素样肽-1受体激动剂通过JNK信号通路促进肝星形细胞凋亡的机制研究

目的 探讨胰高糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)通过JNK信号通路促进肝星形细胞(HSC)凋亡的机制.方法 体外培养人HSC并进行形态学鉴定,将HSC样本随机分成对照组(20份)、GLP-1RA组(20份)和JNK阻断组(20份).对照组HSC在常规培养基础上加入高糖(终浓度25 mmol/L),GLP-1RA组在对照组基础上加入GLP-1RA利拉鲁肽(终浓度10 mmol/L),JNK阻断组在GLP-1RA组基础上加入JNK信号通路阻断剂SP600125(终浓度20 μmol/L)进行培养;培养120 h后用流式细胞术检测各组的HSC凋亡情况.同时采用Western印迹法检测各组的p-JNK蛋白表达水平.结果 三组的平均凋亡率和平均p-JNK的表达水平差异均有统计学意义(F=19.412和66.451,P均＜0.01).GLP-1RA组的凋亡率和p-JNK蛋白表达水平分别为(30.61±4.07)％和(22.79±3.80)％,均高于对照组,差异均具有统计学意义(t=0.530和9.854,P均＜0.01);JNK阻断组的细胞凋亡率和p-JNK蛋白表达水平分别为(23.48±4.41)％和(10.66±4.15)％,均低于GLP-1RA组,差异有统计学意义(t=-5.428和-8.757,P均＜0.01).结论 JNK信号通路在GLP-1RA介导的HSC凋亡中起着关键作用,GLP-1RA可以通过JNK信号通路促成经高糖诱导活化的HSC发生凋亡.     

高糖诱导下肝星形细胞活化与p38MAPK信号通路的关系

目的 探讨高糖诱导下肝星形细胞(HSC)活化与p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路的相互关系.方法 体外培养人HSC并进行形态学鉴定,选取60份样本,分为对照组、高糖组和阻断组各20份;对照组常规培养,高糖组在常规培养基础上加入葡萄糖(终浓度25 mol/L),阻断组在高糖组基础上加入p38MAPK阻断剂SB203580(终浓度40 mol/L)进行培养,培养120 h后用链霉亲和素-生物素复合物法(SABC)及Western印迹法检测各样本的α-肌动蛋白(α-SMA)和p-p38MAPK蛋白表达情况.结果 经鉴定,培养后的HSC呈扁平状,胞体大,具有发育良好的应力纤维,胞浆内缺乏脂肪滴.SABC法原位检验结果显示:高糖组的α-SMA阳性信号强于对照组,而阻断组的α-SMA阳性信号则近似于对照组.3组HSC的α-SMA和p-p38MAPK蛋白的相对表达量差异均有统计学意义(F=31.36,78.49,P均＜0.01).其中,高糖组的α-SMA表达相对量为(34.61±4.07)％,高于对照组和阻断组的(23.90±6.02)％和(26.48±4.41)％,差异均有统计学意义(t=-7.20和-5.37,P均＜0.01);高糖组表达相对量高糖组为(22.79±3.80)％,对照组和阻断组分别为(8.13±4.95)％和(10.66±4.15)％,差异均有统计学意义(t=-11.01和-10.41,P均＜0.01).结论 活化程度较高的HSC具有较高的p38MAPK信号强度,而阻断p38MAPK信号通路能够降低HSC的活化程度.     

大鼠内皮祖细胞的培养及鉴定

目的 探索大鼠内皮祖细胞的分离培养,为缺血性疾病细胞移植治疗提供实验方法.方法 采集大鼠骨髓,梯度密度离心法分离单核细胞,内皮细胞培养液M199培养基培养(含20%FCS+15 ng/ml VEGF),种植于提前包埋了纤维连接蛋白的六孔板培养,应用免疫荧光和流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133.并通过检测其对FITC标记的UED-1的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定.结果 经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、Flk-1,部分表达CD133.大鼠骨髓单个核细胞经体外诱导分化,培养第5～14天的贴壁细胞不同程度的表达CD34、CD133、Flk-1和CD31.培养第9天流式细胞仪检测其阳性率分别为(40.12±6.28)%、(15.62±4.31)%、(44.05±8.20)%和(76.1±7.20)%,细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL,并且在Matrigel上可以形成毛细血管样.结论 大鼠骨髓可以分离培养内皮祖细胞并能体外扩增,为内皮祖细胞的移植研究奠定了基础.     

细胞因子与肝纤维化

肝纤维化是一个复杂的多阶段性疾病,多种细胞因子参与其中,并发挥了重要的作用。因此,了解肝纤维化发病机制中主要的细胞因子对掌握其致病机制十分重要,可为肝纤维化的防治提供新的研究思路和手段。     

细胞因子与肝纤维化

肝纤维化是一个复杂的多阶段性疾病,多种细胞因子参与其中,并发挥了重要的作用.因此,了解肝纤维化发病机制中主要的细胞因子对掌握其致病机制十分重要,可为肝纤维化的防治提供新的研究思路和手段.     

大鼠生精细胞分离方法的研究

目的:建立一种简单、有效的哺乳动物睾丸生精细胞分离方法。方法:采用研磨-Percoll法、单一酶-研磨-Percoll法、组合酶法制备成熟期前大鼠睾丸生精细胞,分析比较其细胞总数、分离所需时间和细胞纯度,以及检测细胞培养前后的存活率。结果:组合酶法得到的睾丸生精细胞总数最多、分离所需时间最短;获得的细胞含杂质最少、细胞存活率最高;细胞培养48h后的存活率高,与其他两种分离方法比较有显著性差异(P<0.05)。结论:用组合酶法能在较短时间内获得数量较多的、比较纯化和存活率较高的生精细胞。     

TGF-β1和TGF-βⅡ型受体酵母表达载体构建

  目的  研究截短型人肝细胞生长因子突变体（tvNK1）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人肝星状细胞LX-2纤维化的影响。  方法  把经PCR和双酶切的小分子泛素相关修饰蛋白（SUMO）和tvNK1的融合基因SUMO-tvNK1插入原核表达载体pET28a,诱导表达和Ni²⁺亲和层析纯化SUMO-tvNK1;进一步经SUMO蛋白酶Ulp1水解和Ni²⁺亲和层析纯化tvNK1,MTT法观察其对TGF-β1诱导LX-2纤维化细胞增殖的影响,qPCR及蛋白印迹（WB）检测其对I型胶原蛋白（col1α1）和α – 平滑肌球蛋白（α-SMA）蛋白表达的影响。  结果  宿主菌Rosetta/pET28a-SUMO-tvNK1在37 ℃经1 mmol/L IPTG诱导5 h获得SUMO-tvNK1的可溶性表达,将超声破碎后上清液经Ni²⁺亲和层析成功获得SUMO-tvNK1,进一步经Ulp1水解和Ni²⁺亲和层析纯化tvNK1,SDS-PAGE鉴定其分子量约为22.0 kDa,MTT显示20和40 ng/mL的tvNK1能明显抑制TGF-β1活化的人肝星状细胞LX-2增殖,qPCR及WB显示20和40 ng/mL的tvNK1能显著抑制活化的LX-2细胞中Col1α1和 α-SMA在mRNA和蛋白水平表达。  结论  SUMO蛋白可用于制备tvNK1,其能抑制TGF-β1活化的LX-2细胞增殖并具有抗纤维化作用,为进一步体内外功能研究打下基础。