多重PCR技术在检测食源性金黄色葡萄球菌 肠毒素基因中的应用

摘要:目的　金黄色葡萄球菌A、B、C、D和E型肠毒素是引起食源性疾病的主要类型,采用多重PCR技术分析食源性金黄色葡萄球菌分离株肠毒素基因携带状况。方法　以19株食源性金黄色葡萄球菌分离株为研究对象,利用多重PCR技术对核酸酶基因以及肠毒素A、B、C、D和E型基因进行检测。结果　19株菌中均检出金黄色葡萄球菌特异性核酸酶基因,与传统菌落分离培养鉴定结果一致;9株菌含肠毒素SEA基因,1株同时含SEA和SEB基因,没有检测到肠毒素C、D和E基因。结论　在19株食源性金黄色葡萄球菌分离株中,10株携带肠毒素基因,以携带肠毒素A基因为主。     

食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因的多重PCR快速检测法

目的 建立食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因的多重PCR快速检测方法.方法 根据公布的金黄色葡萄球菌肠毒素基因A～D型序列,分别设计引物并验证引物的特异性,建立多重PCR方法,检测食品风险监测和食物中毒事件中分离得到的165株金黄色葡萄球菌肠毒素基因A～D型.结果 165株金黄色葡萄球菌有95株携带肠毒素基因,毒素基因携带率为57.6％(95/165),携带一种基因型的占42.4％(72/165),同时携带两种以上毒素基因的占13.9％(23/165).结论 该方法具有简便快速、灵敏度高、特异性强等特点,适用于食源性金黄色葡萄球菌和食物中毒中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测.     

多重PCR快速检测金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因的研究

[目的]建立一种快速、高效地检测金黄色葡萄球菌SEA、SEB、SEC和SED基因的多重PCR法并进行优化. [方法]试剂盒提取产肠毒素金黄色葡萄球菌基因组DNA作为模板,根据SEA、SEB、SEC和SED肠毒素基因片段保守区序列设计引物,多重PCR扩增产肠毒素金黄色葡萄球菌基因组中特异靶序列.对反应体系Mg2+浓度、引物浓度和退火温度进行优化,并初步检测方法特异性. [结果]在PCR反应体系中加入设计的4对引物可同时扩增出金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因中的特异序列;在总体积为25 μl的反应体系中,最优Mg2+浓度为2.0 mmol/L,引物浓度分别为0.2 μmol/L,退火温度为49℃;以大肠杆菌O157:H7和肠炎沙门菌510041基因组DNA为模板扩增不出特异片段. [结论]成功建立金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因多重PCR法,该法能快速、高效地同时检测SEA、SEB、SEC和SED基因,比传统PCR方法省时省力,可以弥补传统PCR法的不足.     

PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的研究

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素C的快速敏感PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌肠毒素C基因编码序列,设计1对PCR引物来特异性扩增靶基因片段,片段长度为600 bp,通过对1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株和5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株进行检测来评价该方法的特异性;对金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株做一系列10倍稀释后进行PCR检测,并对其进行敏感性分析,对PCR扩增产物进行电泳和测序鉴定。结果1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应呈阳性,5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应为阴性;通过基因测序证实了PCR产物的特异性;PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的检测下限为1.5×10^2cfu/ml。结论本研究建立了一个快速、特异、敏感的金黄色葡萄球菌肠毒素C基因PCR检测方法。     

2010-2016年云南省食源性金黄色葡萄球菌肠毒素和mecA基因的检测及分析

目的 检测云南省9类食品中金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)分离株中的肠毒素基因(sea～ see)和mecA基因分布,为有效防控金葡菌食物中毒和临床感染提供基础数据及参考.方法 基于毛细管电泳的多重PCR技术,检测肠毒素基因和mecA基因,以Sanger测序为金标准加以确认;用SPSS 25.0软件对测定结果进行分析.结果...     

金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测与分型

目的:了解不同来源的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)分离株产肠毒素的情况,以及主要肠毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE基因携带状况。方法:采用小型VIDAS全自动荧光酶标免疫法对46株分别从医院消毒监测样品、公共场所监测样品、食品监测样品以及食物中毒病人粪便和呕吐物中分离到的SA菌株进行肠毒素检测,再采用PCR技术对产肠毒素的菌株进行基因分型。结果:46株SA菌株中,携带肠毒素的为22株,检出率为47.83%。其中以SEA、SEB检出率较高,分别为31.82%和27.27%。不同来源SA分离株携带肠毒素基因的比例不同,24株来自医院消毒监测样品分离株中检出率为41.67%(10/24);4株来自公共场所监测样品分离株中检出率为50.00%(2/4);12株来自食品监测样品分离株中检出率为33.33%(4/12);6株食物中毒样本分离株中检出率为100%(6/6)。结论:46株SA分离株中产肠毒素为22株,比例较高,而且携带肠毒素基因的类型较多。试验表明,VIDAS与PCR技术应用于检测SA分离株中肠毒素基因简单、快速,适合基层疾控部门应用。     

应用实时荧光PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素基因

目的:建立一种简便、特异的荧光PCR检测方法,用于金黄色葡萄球菌肠毒素的检测。方法:按金黄色葡萄球菌SEA～SEE型肠毒素基因序列设计引物,在普通PCR检测体系中,加入SYBR Green I荧光染料,建立荧光PCR检测体系。结果:46株金黄色葡萄球菌中检出22株携带肠毒素基因,阳性率为47.83%。以SEA、SEB检出率较高,分别为31.82%和27.27%;不同来源的分离株携带肠毒素基因的比例不同,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占27.27%。结论:荧光PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法具有快速、敏感、特异性高的特点,适用于肠毒素基因的分型与分布的研究,适合基层疾控部门使用。     

一起食物中毒金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测

目的：检测从食物中毒中分离的金黄色葡萄球菌的肠毒素基因，明确肠毒素的基因型。对所分离的金黄色葡萄球菌进行药敏试验，检测其耐药性。方法：应用PCR扩增金黄色葡萄球菌SEA—SEJ基因，电泳检测扩增结果；用VITEK32检测药敏结果。结果：检测到金黄色葡萄球菌的肠毒素基因SEG和SEI，菌株的耐药性不强。结论：金黄色葡萄球菌的肠毒索SEG和SEI可能是这起食物中毒的因子。     

PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、E基因的研究

目的:建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的PCR方法,实现同一台PCR仪、同一PCR反应条件下同时检测SEA、SEB、SEC、SEE,用于金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒的诊断。方法:根据已公布的SEA、SEB、SEC、SEE编码的基因序列,设计4对引物,优化反应条件,建立检测方法,对特异性和敏感性进行分析,并对扩增产物进行测序鉴定。结果:方法特异性分析表明能很好区分各种肠毒素基因型,灵敏度达0.8-1.0×102 CFU/ml。结论:建立了一种在同一台PCR仪、同一PCR条件下同时检测SEA、SEB、SEC、SEE的方法,可用于金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒的诊断和肠毒素的分型检测。     

台州市食源性金黄色葡萄球菌的主动监测及肠毒素基因分布研究

目的:了解台州市食源性金黄色葡萄球菌的污染状况及肠毒素基因的分布特征,为食品安全的风险评估和食源性致病菌的预防提供科学依据。方法:在2005年-2010年间按照监测网的工作要求对采集的各类食品样品进行金黄色葡萄球菌的定性检测,并对保存的菌株用多重PCR方法进行18种肠毒素基因(sea～seu)的检测分析。结果:380份食品样品中共有47份检出金黄色葡萄球菌,总检出率为12.4%,其中即食食品检出率最高为13.2%,生肉类为11.7%,豆制品为7.7%;保存的42株菌中共有22株菌检出12种肠毒素基因,基因携带率为52.4%,sea、seq、sei基因的检出率较高,分别为21.4%、16.7%、11.9%。结论:台州市市售食品中金黄色葡萄球菌的污染程度较高,肠毒素基因携带率较高,监测结果应引起食品监管部门的重视。     

多重PCR检测金葡菌肠毒素基因型的研究

目的 应用多重聚合酶反应(PCR)，建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)基因方法。方法 用溶菌素和蛋白酶K制备模板DNA，用多重聚合酶链反应扩增的方法，对临床分离的金黄色葡萄球菌130株进行扩增。结果 金黄色葡萄球菌肠毒素血清型A(SEA)阳性的占23．1％(30／130)，血清型B(SEB)阳性的占43．1％(56／130)，血清型C(SEC)阳性的占11．6％(15／130)，血清型D(SED)阳性的占6．12％(7／130)，血清型EA(SEE)阳性的占2．31％(3／130)；femA基因片段在多重PCR中作为内部参照避免了假阴性结果的出现。结论 多重PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素基因型，具有敏感、快速、特异的特点，是一种可靠的实验诊断手段。     

日常食品及食物中毒样本中金黄色葡萄球菌肠毒素的分型检测分析

目的通过对北京市海淀区日常食品及食物中毒样本检出的金黄色葡萄球菌进行肠毒素分型检测,比较两种分离菌株的肠毒素分布差异。方法实验所用的金黄色葡萄球菌为2007-2012年海淀区日常食品和食物中毒样本中分离检出的菌株,依据GB 4789.10-2010采用ELISA方法测定金黄色葡萄球菌肠毒素(SEA-SEE)。结果 127株金黄色葡萄球菌中有108株肠毒素阳性,产肠毒素阳性率为85.0%。日常食品检出金黄色葡萄球菌93株,76株菌产肠毒素,产肠毒素阳性率为81.7%;食物中毒样本检出金黄色葡萄球菌34株,32株菌产肠毒素,产肠毒素阳性率为94.1%。产1种肠毒素和同时产3种肠毒素的菌株分别是47、37株,在产毒株中分别占43.5%和34.3%。食物中毒分离株产SEA和SED的比例(65.6%、65.6%)大于日常食品分离株(32.9%、30.3%).共有98株菌产SEE,在产毒株中占90.7%,肠毒素类型分布由高到低依次为E、A、D、C、B。结论食源性金黄色葡萄球菌产毒素能力较强,金黄色葡萄球菌食物中毒分离株和日常食品分离株在肠毒素分布上有差异。     

金黄色葡萄球菌荧光定量PCR计数法的建立

目的建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法,用于对金黄色葡萄球菌计数。方法根据金黄色葡萄球菌nuc基因序列(GenBank:DQ399678.1),设计并合成引物和荧光标记探针,建立和优化反应体系,用已知浓度的金黄色葡萄球菌DNA模板作为外部参照,建立标准曲线。用加入金黄色葡萄球菌的模拟牛奶样品,把Baird-Parker平板计数结果和PCR定量检测结果进行比较,以评价体系性能。结果平板计数和荧光定量PCR的检测结果做比较,采用配对t检验,t=0.58,v=32,P0.05,其结果差异无统计学意义。结论所建立的金黄色葡萄球菌荧光定量PCR计数法,操作较传统的方法简单直接,能有效地缩短整个检测的时限,并有较好的灵敏度和特异性,与传统方法相比,有较明显的优势。     

四种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的建立一种多重PCR检测方法同时检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。方法参考沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因序列,志贺菌侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,金黄色葡萄球菌引物设计参考耐热核酸酶(nuc)基因序列,单增李斯特菌引物设计参考溶血素蛋白(hly)基因序列设计引物,通过多重PCR对4种食源性致病菌的目的基因进行扩增,并对反应体系进行优化。结果对15株目标菌和17株非目标菌的检测未出现假阳性和假阴性结果,产物分子量与预期一致;4种菌的检测灵敏度分别至少达到10pg/μl;对产物的测序分析表明所得序列与目的基因序列吻合;对319份样品的检测结果显示,其中4份生鲜乳中检出金黄色葡萄球菌,1份生猪肉中检出沙门菌。结论该方法具有良好的检测特异性,可供食源性致病菌的快速检测。