鼠疫耶尔森菌比较和进化基因组学研究

鼠疫菌是鼠疫的病原体,曾经引起3次世界范围的鼠疫大流行。从基因组角度认识鼠疫菌在不同疫源地的演化对鼠疫的检验、鉴定和防治具有重要意义。本文论述了目前对鼠疫菌基因组进化的认识,并讨论了这些研究成果的实际意义。     

1994年印度苏拉特鼠疫暴发的回顾性基因溯源研究

目的 明确1994年苏拉特鼠疫疫情中分离的鼠疫耶尔森菌系统发育地位及基因组特征,为进一步研究此次疫情暴发的起因提供线索.方法 利用比较基因组学方法,将已发表的两株苏拉特暴发株基因组与366个鼠疫全球代表菌株的基因组进行变异鉴定和系统发育重建,并对苏拉特菌株的基因组特征进行解析.结果 苏拉特鼠疫菌很可能是20世纪广泛使用...     

鼠疫耶尔森菌的研究及其军事医学意义

随着军事医学的发展,防生物危害医学学科研究的范畴应当包括目前认识到的所有可以导致生物危害的领域,包括生物战、生物恐怖、外来有害生物入侵、生物资源流失、转基因生物安全和研发、突发疫情的应对研究等.鼠疫耶尔森菌是导致自然疫源性疾病鼠疫的病原菌,也是重要的生物战和生物恐怖剂之一,历史上曾3次导致世界鼠疫大流行,多次被用于战争,并多次在战争中导致军队感染.目前鼠疫主要分布在亚洲、非洲、美洲及俄罗斯地区,我国现有12种类型的鼠疫自然疫源地,分布在19个省(区),占国土面积的15％左右,疫情监测结果表明,疫区动物鼠疫自然疫源地异常活跃,面积不断扩大,逐渐向城市逼近,防治形势严峻.2001年美国“9·11”恐怖袭击后,鼠疫耶尔森菌的研究方兴未艾,其中很多研究进展对其他生物恐怖剂的研究具有借鉴意义.微生物法医学溯源数据库的建立及其检测新技术的研究进展为生物恐怖剂的溯源和应急处置提供了很好的经验.     

鼠疫耶尔森菌菌株91001的蛋白质组学初步研究

目的建立鼠疫耶尔森菌的蛋白质组学研究方法,获得鼠疫耶尔森菌的基本蛋白质组数据。方法以对人无致病能力的布氏田鼠疫源地菌株91001为研究对象,按照溶解性的不同分别收集菌体蛋白,以3种不同方法(Shotgun-LC-MS-MS,1D-LC-MS-MS和2D-MS)进行分析,将分析数据与基于91001菌株基因组全序列建立的蛋白质理论数据库进行比对,确定91001菌株本实验培养条件下所表达的蛋白组分。结果Shotgun-LC-MS-MS方法鉴定了971种蛋白,1D-LC-MS-MS鉴定了915种,而2D-MS方法则鉴定了233种蛋白质,三者合计为1193种蛋白质,占基因组预测CDS的28．7％(1193／4143)。结论不同的蛋白质组分析方法鉴定的蛋白质种类和数目都存在差异,为更全面地获得鼠疫耶尔森菌蛋白质组数据,有必要同时采取多种方法进行分析。     

温度和酸度对田鼠型鼠疫耶尔森菌psa位点的转录调控研究

目的研究温度和酸度对田鼠型鼠疫耶尔森菌psa位点的转录调控作用。方法首先设计相关跨基因引物,用RT-PCR方法验证psa位点的相关操纵子结构。扩增操纵子首基因上游启动子区500 nt序列,并克隆入pRW50质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,将重组质粒转入鼠疫菌中,通过测定β-半乳糖苷酶活性差异来判断不同温度（26和37℃）和酸度（pH 6.0和pH 8.0）对psaE和psaA的调控关系。最后提取鼠疫菌在上述不同温度和酸度条件下的总RNA,采用引物延伸实验进一步明确温度和酸度对psaA的调控关系。结果与结论 RT-PCR结果证实了田鼠型鼠疫菌的psa位点由操纵子psaEF和psaABC构成;半乳糖苷酶和引物延伸实验结果显示在37℃、pH 6.0培养条件下psaABC的转录水平最高,而psaEF的转录水平无明显变化,提示psaA的表达水平在37℃酸性条件下表达量最高,psaE则不受温度和酸度的调控。     

蛋白芯片筛选鼠疫耶尔森菌与巨噬细胞的蛋白相互作用

目的：利用蛋白芯片筛选鼠疫耶尔森菌的毒力因子，进一步揭示鼠疫菌与宿主之间相互作用的机制。方法：鼠疫菌毒力相关蛋白芯片筛选与小鼠巨噬细胞系774A．1可能有相互作用的蛋白质，免疫荧光试验验证筛选出的蛋白相互作用。结果：共筛选到17个可能与巨噬细胞有相互作用的鼠疫菌蛋白，并通过免疫荧光试验初步验证了其中8个蛋白芯片筛选试验中信号最强的蛋白与巨噬细胞的相互作用。结论：蛋白芯片技术可用于筛选病原菌与宿主之间的相互作用，有助于深入研究病原与宿主之间相互作用的机制。本研究筛选出的鼠疫菌蛋白与巨噬细胞的相互作用尚需深入研究和验证，以便最终确定这些蛋白在鼠疫菌致病机制中所发挥的作用。     

基于Luminex悬浮芯片的鼠疫耶尔森菌SNP分型方法研究

目的利用Luminex悬浮芯片技术,基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）建立我国鼠疫耶尔森菌东方型菌株（以下简称东方型鼠疫菌）的基因分型方法,为进一步研究东方型鼠疫菌多态性并分析其系统发育关系奠定基础。方法利用多重PCR,同时扩增东方型鼠疫菌中18个具有分型意义的SNP位点,扩增产物进行多重等位基因特异性引物延伸（allele specific primer extension,ASPE）反应以及Luminex悬浮芯片技术分析,随后利用MasterPlex GT V2.3软件计算平均荧光强度（median fluorescence intensity,MFI）比值,判断各SNP位点的碱基状态;并对SNP分型方法的重现性进行评价。结果 Luminex多重SNP技术能够快速、高通量地检测出各SNP位点的MFI值,从而在8 h内一次性成功确定东方型鼠疫菌中18个SNP的碱基状态;36株东方型鼠疫菌基于18个SNP可以分为7个基因型。结论本文建立的Luminex多重SNP检测方法作为一种高通量检测SNP的技术平台,为后期的东方型鼠疫菌SNP分型及系统发育分析奠定了基础。     

鼠疫耶尔森菌活疫苗株的比较基因组学研究

目的揭示不同来源的鼠疫活疫苗株在基因组组成上的差异。方法以芯片比较基因组杂交为主要研究手段,结合PCR验证,对19株鼠疫活疫苗株进行比较基因组分析。结果鼠疫活疫苗株基因组中缺失了大量基因,但也有某些大片段基因的拷贝增多。结论不同来源的疫苗株在基因组组成上存在差异,构成了不同疫苗株的表型与使用效果具有差异性的遗传基础。     

鼠疫耶尔森菌文献数据库的研建与开发

目的 建立便捷的鼠疫菌文献数据库系统,从而提高文献利用效率.方法 运用EndNote X5文献管理软件进行文献收集整理,通过Perl及PHP等计算机语言规范数据格式、构建实体关系模型、搭建系统和开发网页;选择中小型网站开发中常用的Apache+PHP+MySQL组合进行动态网站的开发.结果与结论 构建了鼠疫菌文献数据库(访问地址:http://101.201.51.148/ypkd/).该文献数据库可供用户快速检索、浏览并获取鼠疫菌相关文献和著作全文,并提供自动更新的鼠疫菌新闻资讯.该数据库具有前沿性和完整性,为鼠疫菌相关科研及鼠疫疫情的预防控制提供了知识保障,并为其他重要病原文献数据库的建立提供了参考模型.     

鼠疫耶尔森菌生物型变异遗传基础的研究和新生物型--田鼠型的提出

目的 探究鼠疫耶尔森菌生物型变异的遗传基础。方法 通过全基因组序列的比较分析,鉴定可能与生物型变异相关的基因突变,采用DNA测序和位点特异性PCR的方法,分析基因突变在鼠疫耶尔森菌自然分离株中的分布。结果 田鼠鼠疫自然疫源地菌株在毒力、生化表型和分子特征上与其他型别鼠疫耶尔森菌相差很大。所有脱氮阴性菌株的napA基因发生了突变,所有甘油利用阴性菌株的glpD基因发生了突变,所有阿拉伯糖利用阴性菌株的araC基因发生了突变。结论 提出了一个新的生物型——田鼠型;相应糖醇代谢相关基因发生突变是4个生物型变异的遗传基础。     

应用抑制消减杂交技术研究鼠疫菌与假结核菌基因组之间的差异

目的：研究古典型鼠疫菌与假结核菌ATCC29833基因组间的差异，为进一步认识鼠疫菌的起源与进化奠定基础。方法：通过抑制消减杂交技术比较两种细菌基因组间的差异。结果：与已测序的3株鼠疫菌基因组进行同源性比较，发现了259个假结核菌基因组中存在的特异序列，与基因库进行同源性比较发现了10个假结核菌ATCC29833基因组中存在的新序列。结论：抑制消减杂交技术是一个简单而有效的比较近源微生物基因组之间差异的方法，鼠疫菌在进化过程中失去了大量的基因，假结核菌基因组之间也存在着一定的差别。     

不同培养条件下鼠疫菌PhoP/PhoQ的自调控模式研究

目的 研究鼠疫耶尔森菌PhoP/PhoQ在不同培养条件下的自调控关系.方法 PCR扩增YPO1635启动子区DNA序列,并克隆入pRW50质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,构建LacZ重组质粒,进而将该重组质粒转入鼠疫菌野生株(WT)和phoP突变株(ΔphoP)中,通过测定二者中β-半乳糖苷酶活性差异来判定PhoP对YPO1635的调控关系.提取WT和ΔphoP的总RNA,采用引物延伸实验研究phoP的转录起始位点,并根据产物的丰度判断PhoP对phoP的调控关系.结果 LacZ结果表明,在低Mg2+TMH和BHI培养基中,PhoP能激活YPO1635的转录,而在高Mg2+TMH中,PhoP对YPO1635的转录无调控作用.引物延伸结果显示,phoP有两个转录起始位点G(-90)和A(-118)(分别记为P1和P2,翻译起始位点为+1),在低Mg2+ TMH中,PhoP能激活P1的转录,而对P2无调控作用;在高Mg2+TMH中,PhoP对二者均无调控作用;在BHI中,PhoP对二者的转录均具抑制作用.结论 PhoP/PhoQ的自调控关系随周围环境的变化而表现出不同的模式,这有利于鼠疫菌快速适应外界生存环境的改变.     

鼠疫耶尔森菌pgm位点及其侧翼序列遗传变异的比较分析

目的研究鼠疫耶尔森菌中国自然分离株pgm位点及其侧翼序列的变异,了解不同疫源地菌株间的毒力差异,为鼠疫防治提供帮助。方法比较分析现有4株菌的pgm位点及其侧翼序列的变异,采用PCR、等位基因特异性PCR扩增260株中国自然分离株和7株假结核耶尔森菌。结果除锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株外,其他菌株均缺失了YPl666的70～87bp之间的18bp碱基。1406bp处T的缺失仅存在于东方型菌株中。北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株的pgm位点下游都没有IS100插入;锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株的色素沉着区有1个IS285插入,在其下游3kb区域还有1个IS100插入。冈底斯山型和昆仑山A、B型菌株的pgm位点上游侧翼区与其他菌株不同。36株菌的pgm位点缺失,缺失的菌株主要集中在鄂尔多斯高原型,松辽平原B型,昆仑山A、B型4种生态型菌株中。结论北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株是中国鼠疫耶尔森菌中比较古老的菌株。锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株是一个独特的分支,建议归为第4个生物型——田鼠型。北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株的pgm位点,由于在其下游没有IS100插入,所以稳定、不易缺失。pgm位点及其侧翼序列的变异与菌株的生物型、自然疫源地和生态型都具有一定的相关性。     

鼠疫耶尔森菌DNA标识序列的鉴定及其应用研究

目的确定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,以用于鼠疫耶尔森菌的快速检测和鉴定。方法通过芯片比较基因组杂交和PCR验证,鉴定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,针对标识序列设计特定的PCR引物。结果鼠疫耶尔森菌基因组中存在3个区段,共28条基因,均是鼠疫耶尔森菌DNA标识序列。针对其中3条基因设计PCR引物,能特异性扩增出鼠疫耶尔森菌,与来自其他非鼠疫耶尔森菌的DNA无交叉反应。结论鼠疫耶尔森菌存在DNA标识序列,并能用于鼠疫耶尔森菌的快速检测与鉴定。     

鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片的研制及用于比较基因组学分析

目的 研制鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片,并将其用于比较基因组分析。方法 挑选出4005条鼠疫耶尔森菌基因,PCR扩增各基因,以纯化的PCR产物点样制备芯片,采用双色荧光杂交策略,进行芯片比较基因组杂交。结果 设计了若干质控杂交组合,芯片杂交结果与全基因组测序结果完全一致。结论 成功建立了基于全基因组DNA芯片的鼠疫耶尔森菌比较基因组学技术平台。