Smad分子在骨形成蛋白2调控成牙本质细胞Ⅰ型胶原基因表达中的作用

目的　研究Smad蛋白在骨形成蛋白 2 (bonemorphogeneticprotein 2 ,BMP 2 )调控小鼠成牙本质细胞系MDPC 2 3内Ⅰ型胶原α2链 [collagenα2 (Ⅰ ) ,COL1A2 ]表达中的作用。方法　细胞免疫组化观察MDPC 2 3细胞内BMP 2细胞内信号分子Smad1、Smad5和Smad6的表达。瞬时转染和报告基因检测观察Smad1、Smad5和Smad6在BMP 2调控COL1A2基因转录中的作用。结果　MDPC 2 3细胞表达Smad1、Smad5和Smad6。BMP 2能诱导含COL1A2基因启动子的荧光素酶报告基因活性。Smad1或Smad5过表达增强BMP 2诱导的COLIA2基因启动子活性 ,而Smad6过表达抑制BMP 2诱导的COL1A2基因启动子活性。过表达Smad1或Smad5突变型载体可以阻断BMP 2的诱导能力。结论　在MDPC 2 3细胞内 ,Smad信号途径存在并发挥功能 ,参与调控BMP 2对COL1A2基因的转录。Smad信号途径可能在BMP 2调控成牙本质细胞分化和牙本质形成过程中发挥重要作用     

遍在蛋白-蛋白连接酶对骨形态发生蛋白/Smad通路的调节

Smad通路是转化生长因子(TGF)-β超家族包括骨形态发生蛋白(BMP)信号转导的经典通路.Smad复合物的积聚导致其基因转录的过度活化,因此Smad的降解对Smad通路的调控至关重要.遍在蛋白-蛋白水解酶复合体通路降解Smad,对调控TGF-β信号转导发挥重要的调节作用.遍在蛋白-蛋白连接酶(Smurf)作为这一系...     

骨形态发生蛋白/Smad信号转导机制及其对离心力刺激的响应

骨形态发生蛋白(BMP)是一类转化生长因子-β超家族成员的多功能分泌型信号分子,参与调节多种细胞的增殖、分化和程序性死亡,在组织器官的形成、胚胎的发育和损伤组织的修复中起关键作用.Smad蛋白是BMP细胞内信号转导和调节分子,可以直接将BMP细胞外信号从细胞膜转导入细胞核,构成BMP/Smad信号转导通路,而BMP/Smad信号转导通路在调节牵张成骨新骨形成中发挥着重要作用.笔者下面就体外培养细胞离心力加载装置和BMP/Smad信号转导机制及其对离心力刺激的响应作一综述.     

IGF1通过BMP2-Smad1/5信号通路调控犬上颌窦黏膜干细胞成骨分化

目的探讨骨形态形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP2)-Smad1/5及p38MAPK信号通路在胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)介导的促犬上颌窦黏膜干细胞(maxillary sinus membrane stem cells,MSMSCs)成骨分化中的作用。方法构建表达胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor1,IGF1)基因的重组腺病毒载体(recombinant adenovirus,rAdv)Ad-IGF1。感染Ad-IGF1的犬上颌窦黏膜干细胞,经成骨诱导培养后,qRT-PCR和Western blot检测BMP-Smads信号通路中重要信号蛋白Smad1/5的磷酸化水平和BMP2蛋白的表达;免疫组化观察磷酸化Smad1/5核转位情况;qRT-PCR及Western blot检测BMP-Smads通路抑制剂Noggin和p38MAPK信号通路抑制剂SB203580对IGF1介导的促犬MSMSCs成骨分化的影响。结果成功构建IGF1基因表达重组腺病毒载体Ad-IGF1;感染Ad-IGF1的犬MSMSCs,经成骨诱导培养后,Smad1/5的磷酸化水平和BMP2蛋白的表达升高,IGF1可促使Smad1/5核转位;BMP-Smads信号通路抑制剂Noggin可抑制Smad1/5的磷酸化,降低成骨标志物Runx2、OPN和ALP mRNA的表达,钙结节形成减少。p38MAPK信号通路抑制剂SB203580不能降低Ad-IGF1犬MSMSCs的p38磷酸化水平,亦不能降低成骨标志物Runx2、OPN和ALP mRNA的表达。结论犬MSMSCs成骨分化过程中,IGF1通过经典的Smads蛋白依赖性信号转导通路BMP2-Smad1/5促进成骨,而Smads蛋白非依赖性信号转导通路p38MAPK在IGF1介导的犬MSMSCs成骨过程中可能并不发挥作用。     

BMP2/Smads通路介导富血小板纤维蛋白对人牙髓干细胞成骨分化的作用研究

目的:基于骨形态发生蛋白2(BMP2)/母亲信号蛋白同源物通路(Smads)通路,分析富血小板纤维蛋白(PRF)对人牙髓干细胞成骨分化的作用.方法:分离纯化牙髓干细胞,流式细胞仪检测并鉴定牙髓干细胞表面抗原标记物,随机分为对照组、PRF组、BMP激活剂组和BMP抑制剂组(简称激活剂组和抑制剂组),检测培养7d、14d后的碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-qPCR检测牙髓干细胞胶原蛋白Ⅰ(COL-Ⅰ)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN) mRNA相对表达水平;茜素红染色观察矿化结节形成;Western-Blot检测牙髓干细胞BMP2、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、RUNX2蛋白相对表达水平.结果 ..STRO-1、CD29、CD90表达阳性,符合牙髓干细胞的表型.各组ALP活性随时间延长而升高(P＜0.05),从对照组到抑制剂组、PRF组、激活剂组,牙髓干细胞ALP活性及COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA相对表达水平依次升高,红色矿化结节数目、A值依次增加(P＜0.05).从抑制剂组到对照组、PRF组、激活剂组,牙髓干细胞BMP2、p-Smad1/5、RUNX2蛋白相对表达水平依次升高(P＜0.05).结论 ..PRF可能通过激活BMP2/Smads信号通路促进人牙髓干细胞成骨分化.     

转化生长因子β信号转导通路及其对血管内皮和平滑肌及基膜的调控

转化生长因子（TGF）β信号转导通路主要由TGFβ及其受体以及受体底物Smad蛋白分子组成，可通过多种分子机制调控血管内皮细胞的增殖、迁移和分化，介导平滑肌细胞分化，参与维持血管内皮基膜的完整性。研究TGFβ信号转导通路在口腔颌面部血管畸形、肿瘤血管生成等血管相关疾病的中作用机制，探讨其他基因或转录因子对该信号转导通路的调控，可为治疗血管相关性疾病提供新思路。本文就TGFβ信号转导通路及其对血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和血管基膜的调控等研究进展作一综述。     

激活素受体样激酶2及其在颅面部生长发育中的作用

人类的ALK2基因位于染色体2q23～24,其内含子大都在0.5～6.5 kb,其3'非编码区对ALK2基因表达起着重要的调节作用.ALK2蛋白由胞外区、跨膜区和富含丝氨酸-苏氨酸序列的胞内区组成,在组成上高度保守.ALK2是骨形态发生蛋白(BMP)家族受体中的一员并转导BMP信号.ALK2信号转导通路分为经典的Smad信号转导通路和非Smad信号转导通路,前者在促进骨、软骨和牙发生方面发挥着重要的作用.ALK2蛋白广泛表达于机体的不同组织,如骨、软骨、牙体和心脏等.ALK2在颅骨发生发育早期促进成骨,在成熟期抑制成骨;ALK2基因突变增强可导致异位骨化,体现了ALK2独特于其他BMP受体的重要生理病理学意义.     

生物力刺激和促丝裂原激活蛋白激酶对骨改建的影响

生物力信号转导是骨生物学研究的热点之一.通过研究流体剪切力、细胞外基质形变等生物力刺激下成骨细胞系的应答发现,生物力信号转导涉及促丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号转导通路在内的多种信号系统.生物力刺激作用于整联蛋白、钙离子通道和脂筏等感受器,激活MAPK信号转导通路并通过级联反应调节下游分子的活性,如核心结合因子-α1和激活蛋白1等转录因子,进而调控成骨细胞的功能.同时生物力刺激诱导的MAPK信号转导通路与雌激素受体、甲状旁腺素受体和1,25-二羟胆骨化醇受体等信号转导通路存在交联作用,是生物力信号转导的重要途径.     

BMP2作用下人牙乳头细胞内Smad 1 mRNA表达的变化

目的：观察人牙乳头细胞内Smad1 mRNA的表达及在BMP2作用下，细胞内Smad1 mRNA的表达变化，探讨人牙乳头细胞内Smad1信号途径在BMP2调控牙乳头细胞分化中的作用。方法：原代培养的人牙乳头细胞用BMP2处理后，提取总RNA，采用Northern blot法，从mRNA水平观察Smad1基因的表达及含量变化。结果：从mRNA水平观察到Smad1基因在人牙乳头细胞内的表达，但在BMP2作用6、12、24h后，Smad1 mRNA表达量无显著变化。结论：人牙乳头细胞内存在Smad1信号转导途径，牙乳头细胞内Smad1 mRNA表达量不受BMP2调控。     

bFGF对人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖及MEK/ERK、NF-κB通路的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）对人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖及MEK／ERK、核转录因子-κB（NF—κB）信号通路的影响。方法：培养人涎腺腺样囊性癌细胞株（ACC-2），MTT比色法测定不同浓度bFGF对细胞增殖的影响；免疫沉淀法纯化蛋白并ERK试剂盒测定ERK活性；Western—blot测定p-ERK及NF—κB抑制物（I-κBa）表达。并观察丝裂原蛋白活化激酶激酶（MEK）抑制剂U0126对上述指标的干预作用。结果：MTT实验显示bFGF明显增强ACC-2细胞增殖，免疫沉淀法显示bFGF上调ERK活性，免疫印记法显示bFGF明显增强p-ERK1／2表达及抑制I-κBα表达。U0126可抑制bFGF的以上效应。结论：bFGF可促进人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖，其途径与上调ERK活性，激活ERK、NF—κB信号通路有关。     

MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹（Western blotting）检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶（ALP）染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物 （miR-103-3p mimics）及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因mRNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制（P<0.05）,Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。     

PP-1蛋白稳定高表达MC3T3-E1成骨样细胞系的建立

目的建立稳定高表达蛋白质磷酸酶-1(protein phasphatase-1,PP-1)的MC3T3-E1成骨样细胞系。方法采用RT-PCR技术从MC3T3-E1细胞中扩增蛋白质磷酸酶-1(PP-1)基因,将获得的基因定向插入pCI-neo真核表达质粒中,PCR及双酶切鉴定后用脂质体将表达载体转染入MC3T3-E1细胞,经G418加压有限稀释筛选,建立稳定高表达PP-1的MC3T3-E1成骨样细胞系,采用Western blot法检测PP-1的蛋白表达情况。结果 PCR及双酶切鉴定表明表达载体pCI-neo-PP-1构建正确;Western blot检测结果显示PP-1蛋白能在转染pCI-neo-PP-1的MC3T3-E1细胞中稳定高表达。结论成功建立了稳定高表达PP-1的MC3T3-E1成骨样细胞系,为进一步深入研究PP-1在细胞力学信号转导通路中的功能及作用机制奠定了实验基础。     

RGD多肽修饰的无机小牛骨粉对MC3T3-E1细胞黏附、增殖及分化的影响

目的:研究小鼠前成骨细胞MC3T3-E1在RGD修饰的无机小牛骨粉上的黏附、增殖及分化。方法:浸泡法制备RGD/Bio-Oss复合材料。MTT法检测细胞1 h、2 h、3 h黏附,扫描电镜观察细胞黏附形态,DNA浓度定量分析细胞1 d、3 d、5 d、7 d的增殖。碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞7 d、14 d的分化。结果:1 h、2 h、3 h细胞黏附结果Bio-Oss/RGD组明显高于Bio-Oss组及空白对照组;1 d、3 d、5 d、7 d Bio-Oss/RGD组和Bio-Oss组的DNA浓度差别无统计学意义,但都低于空白对照组;细胞分化第14天时Bio-Oss/RGD组的结果明显高于Bio-Oss组与空白对照组。结论:RGD对细胞黏附及分化有一定的促进作用,但对细胞增殖无显著促进作用。     

Effects of hypergravity on migration, proliferation and function of mouse osteoblastic cell line MC3T3-E1

The purpose of this study was to investigate the hypergravity-induced responses and their mediators of osteoblastic cell line, MC3T3-E1. The synchronized G1 or the S Phase cells were exposed to 5 and 18 x g hypergravity at 37 degrees C. The migration velocity was measured and the morphology was observed. MC3T3-E1 cells were cultured for 1, 2 or 3 days at 37 degrees C, exposing to 5, 10, 20 and 40 x g hypergravity. The proliferation, prostaglandin E2 (PGE2) production rate and alkaline phosphatase (ALPase) activity were measured. The results were as follows: 1) In the G1 phase of the cell cycle, the migration of MC3T3-E1 cells was increased by 18 x g. In the S phase, the morphology altered depending on the g-stress. 2) The proliferation of MC3T3-E1 cells was enhanced at 20 and 40 x g but reduced at 10 x g. The proliferation of HeLa cells and JTC-12 cells was also enhanced at 40 x g. 3) Indomethacin (10(-5)M) reduced the proliferation of MC3T3-E1 cells induced by 40 x g. But indomethacin (10(-5)M) did not reduce the proliferation of HeLa cells. 4) The increase of the released PGE2 from the cells depended on the time (1-8h) and the gravity (1-40 x g). 5) The increase of the ALPase activity of MC3T3-E1 cells also depended on the gravity. These results suggest that the hypergravity enhanced the proliferation of MC3T3-E1 cells via PGE2-mediated mechanism.     

同源盒蛋白(Msx1)过度表达抑制成骨细胞碱性磷酸酶表达的实验研究

目的:观察同源盒蛋白(Msx1)过度表达在成骨细胞MC3T3-E1分化培养过程中对碱性磷酸酶的调节作用,以探讨Msx1蛋白对细胞成骨分化过程的调控机制。方法:将成骨细胞MC3T3-E1分为5组:未转染病毒组作为对照组1(A组);空白腺病毒载体组作为对照组2(B组);未分化组作为空白对照组(C组);分化前1 d转染携带同源盒基因Msx1的腺病毒载体组(D组);分化后1 d转染Msx1腺病毒载体组(E组)。在成骨分化培养基中培养4 d后,检测成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。结果:A、B两组成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养基培养4 d后,ALP活性呈强阳性;C组中未分化成骨细胞MC3T3-E1无ALP活性,D、E两组的成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养4 d后的ALP活性明显较A、B组减低,而且D、E两组间ALP活性无区别。结论:过度表达同源盒蛋白(Msx1)能抑制成骨细胞MC3T3-E1的ALP表达,在其成骨分化的过程中起一定的抑制作用。     

牵引力介导MC3T3-E1细胞microRNA的差异表达

目的 探讨周期性牵引力作用下小鼠成骨前体细胞microRNA的表达谱,寻找与TGF-β信号通路相关的差异microRNA。 方法 体外培养MC3T3-E1细胞。以正常培养细胞为对照,应力加载组细胞加载12%拉伸应变力3 h,利用microRNA基因芯片技术初步筛选出牵张应力作用下MC3T3-E1细胞差异表达的microRNA,然后采用实时荧光定量PCR技术对与TGF-β信号通路相关的差异表达microRNAs进行验证,生物信息学预测可能受其调控的靶基因。 结果 与对照组相比,应力加载组有41个microRNAs表达差异（P值均小于0.05且差异倍数均大于1.5倍）,其中20个表达上调,21个表达下调。实时荧光定量PCR结果显示：相比于对照组,应力加载组中miR-132-3p的表达水平升高,与芯片结果一致且存在统计学差异（P<0.05）。经软件分析,miR-132-3p的靶基因可能为Smad2。 结论 周期性牵引力作用下成骨细胞microRNA表达谱发生改变,这些差异表达的microRNAs可能通过影响TGF-β信号通路或其相关信号分子来影响成骨细胞的生物学功能。     

不同浓度无机磷对MC3 T3-E1细胞系成骨及破骨相关基因表达的影响

目的：探讨不同浓度的无机磷液对体外培养MC3T3-E1细胞的成骨和破骨相关基因mRNA表达的影响。方法：体外常规培养MC3T3-E1细胞。根据所用培养液外加无机磷浓度的不同,将实验细胞分为4组：0 mM组（对照组）、1 mM组、3 mM组和5 mM组。每组设3个复孔,培养48 h后收取细胞标本,通过Real-time PCR检测MC3T3-E1细胞成骨和破骨相关基因mRNA的表达。结果：与对照组相比,成骨相关基因ALP、BSP、OC及OSXmR-NA的表达在1 mM组和3 mM组增加,而在5 mM组则减少,差异具有统计学意义（ P＜0.05）;成骨抑制基因SOST及破骨相关基因CTSK、TRAPmRNA的表达,在1 mM 组、3 mM 组和5 mM 组都增加,差异具有统计学意义（ P ＜0.05）。结论：高浓度（5 mM）的无机磷环境对MC3T3-E1细胞的成骨相关基因表达起显著抑制作用,对破骨相关基因表达起显著增强作用,提示高浓度无机磷抑制MC3T3-E1细胞的成骨活性。     

白藜芦醇通过上调SOCS-3蛋白抑制脂多糖诱导的成骨细胞表达MIP-2

目的:探讨白藜芦醇是否依赖细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling-3,SOCS-3)蛋白发挥对牙髓卟啉单胞菌(Porphiyromonas endodontalis,P.e)脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导成骨细胞产生巨噬细胞炎性蛋白2(...     

miR-497-5p在前成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化中的作用及机制探讨

目的：研究微小RNA(miR)-497-5p在前成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化中的作用，并探讨其相关机制。方法：取第3代MC3T3-E1细胞，分别转染miR-497-5p过表达质粒miR-497-5p mimics、低表达质粒miR-497-5p inhibitor和阴性对照质粒miR-497-5p NC，设为miR-497-5p mimics组、miR-497-5p inhibitor组和miR-497-5p NC组。取不做处理的细胞作为空白组。成骨诱导后14天，检测碱性磷酸酶（ALP）活性；免疫印迹法检测成骨分化相关蛋白骨钙素（OCN）、I型胶原（COL-I）蛋白表达量；茜素红染色法观察矿化情况；免疫印迹法检测Smad泛素化调节因子2(Smurf2)蛋白表达量；双荧光素酶实验验证miR-497-5p与Smurf2的靶向关系。采用SPSS 25.0软件包进行统计学分析。结果：与空白组、miR-497-5p NC组相比，miR-497-5p mimics组ALP活性显著增强，OCN、COL-I蛋白表达量及矿化结节面积构成比显著升高，Smurf2蛋白表达量显著降低（P<0.05...     

钛表面RGD/仿生磷酸钙复合涂层对MC3T3-E1细胞黏附、增殖、分化的影响

目的:研究钛表面RGD/仿生磷酸钙复合涂层对MC3T3-E1细胞黏附、增殖和分化的影响。方法:1)两步法在钛表面制备仿生磷酸钙涂层,扫描电子显微镜(SEM)观察形态,X射线衍射(XRD)、傅立叶转换红外光谱(FTIR)检测表征;2)RGD固定至仿生磷酸钙涂层;3)实验分3组:纯钛组,钛/仿生磷酸钙涂层组,钛/RGD/仿生磷酸钙复合涂层组,细胞分别接种至3组材料表面。4)SEM观察细胞接种4 h和24 h的形态;5)结晶紫染色检测细胞接种4 h和8 h的黏附情况。6)MTT法检测细胞1、3、7 d的增殖活性;7)检测细胞3、7、14 d的ALP活性。结果:SEM细胞形态观察及结晶紫染色结果显示,RGD/仿生磷酸钙复合涂层组的细胞黏附效果优于对照组。MTT结果显示RGD/仿生磷酸钙复合涂层组的细胞增殖活性强于对照组。ALP检测结果显示RGD/仿生磷酸钙复合涂层组的成骨分化活性高于对照组。结论:钛表面RGD/仿生磷酸钙复合涂层对MC3T3-E1细胞的黏附、增殖、分化均有促进作用。