Arresten抑制HUVEC细胞增殖和管腔形成的实验研究

目的:探讨血管生成抑制因子arresten对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖和体外血管腔形成的影响,了解其抑制血管生成的途径。方法:采用MTT比色法,观察不同浓度的arresten对HUVEC细胞增殖的影响;Matrigel胶体外管腔形成试验检测arresten对HUVEC细胞形成血管的影响。结果:MTT比色法显示,arresten对HUVEC细胞增殖具有抑制作用,随着浓度的增加,arresten对HUVEC细胞增殖抑制作用也增强,但当其浓度增加到800 ng/mL后其增殖抑制率不再提高; arresten浓度为0、400及800 ng/mL时,HUVEC细胞形成的血管腔数分别为17±2、9±1及5±1。结论:Arresten能够抑制HUVEC细胞的增殖,并抑制HUVEC细胞形成血管腔。     

Arresten对人脐静脉内皮细胞增殖的影响及其作用机制

背景与目的：Arresten是近年发现的血管生成抑制因子，它能抑制裸鼠移植瘤的生长和转移。本文探讨arresten对人脐静脉内皮细胞huvec增殖的影响及其相关机制。方法：应用MTT法测试细胞的生长曲线，检测不同浓度的arresten对huvec细胞增殖的影响，流式细胞仪检测arresten对huvec细胞凋亡的影响，半定量RT—PCR及Western—blot分别检测人脐静脉内皮细胞的VEGF在mRNA水平及蛋白水平的表达。结果：Mr丌比色法显示，arresten对huvec细胞增殖具有抑制作用并呈浓度依赖性，但当其浓度增加到800ng／L后其增殖抑制率不再提高，而此浓度时huvec细胞的凋亡率达到峰值的59％；经过arresten处理，huvec细胞的VEGF在mRNA及蛋白水平的表达量均显著下降。结论：arresten通过降低huvec细胞的VEGF表达抑制huvec细胞增殖并促进huvec细胞凋亡。     

汉黄芩素对肺腺癌A549细胞黏附和迁移能力的影响及其可能机制

目的:观察汉黄芩素对人肺腺癌A549细胞黏附、迁移和侵袭能力的影响,并初步探讨其分子作用机制。方法:采用MTT法检测汉黄芩素对A549细胞增殖和黏附能力的影响;细胞划痕实验和侵袭小室法检测其对A549细胞迁移和侵袭能力的影响;RT-PCR和Western印迹法检测汉黄芩素对A549细胞中与转移相关的基因,如细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、内皮细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和c-Met表达的影响。结果:汉黄芩素能抑制A549细胞的生长,其细胞增殖抑制率与药物浓度及作用时间呈依赖关系。低浓度的汉黄芩素处理A549细胞后,可明显降低肺癌细胞的黏附、迁移和侵袭能力。汉黄芩素能有效抑制ICAM-1、VCAM-1基因和蛋白的表达,但对c-Met基因及其蛋白并没有影响。结论:汉黄芩素具有抑制肿瘤细胞转移的作用,其分子机制可能与下调ICAM-1和VCAM-1的表达有关,但与c-Met表达无关。     

arresten在CHO细胞的表达及其生物学效应

目的 初步探讨血管生成抑制因子arresten在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中的表达及其生物学效应。方法 用脂质体转染法将真核表达载体pSecTag-arresten导入CHO,抗生素Zeocin筛选获得阳性克隆。RT—PCR检测arresten在mRNA水平的表达,Western blot检测arresten在蛋白水平的表达。将人脐静脉内皮细胞（huvec）分为加DMEM培养组、加SFX无血清培养基培养组及加含arreten的上清培养液组,TransweH小室检测arresten对huvec细胞迁移的影响,Mamgel胶体外管腔生成试验检测arresten对huvec细胞血管形成能力的影响。结果 RT—PCR和Western blot检测显示,arresten在mRNA水平与蛋白水平均有表达。迁移抑制曲线显示,含arresten组的迁移抑制率明显高于对照组（P〈0．05）。加DMEM培养组、加SFX无血清培养基培养组和加含arresten的上清培养液组细胞形成的血管腔分别为16±2、13±1和7±2个,加含arresten的上清培养液组显著低于其他两组（P〈0．05）。提示arresten对huvec细胞的迁移和血管形成具有抑制作用。结论成功构建arresten的真核表达体系,并发现arresten因子可抑制huvec细胞迁移和管腔形成,这可能是其抑制血管生成的途径之一。     

血管生成抑制因子arresten 的真核表达体系的建立

  目的 构建血管生成抑制因子arresten的真核表达细胞克隆体系。方法 用脂质体转染法，通过真核表达载体pSecTag2-arresten将arresten基因导入CHO细胞，经抗生素Zeocin筛选获得阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测arresten mRNA表达，免疫蛋白印迹技术（Westem-blot）测arresten蛋白的表达。结果 经过筛选获得阳性克隆的CHO细胞，RT-PCR、Westem-blot结果提示arresten基因成功导入CHO细胞并进行表达。结论 获得了稳定表达人arresten因子的CHO细胞克隆，为深入研究arresten在抑制肿瘤血管生成中的作用机制奠定了良好的基础。     

RNA干扰技术下调CEACAMl基因表达对胶质瘤血管生成的影响

目的：利用RNA干扰技术下调胶质瘤细胞中癌胚抗原相关细胞黏附分子1（ CEACAM1）基因的表达情况,探讨胶质瘤细胞CEACAM1表达变化后其培养上清液诱导人脐静脉内皮细胞（ HUVEC）增殖、血管生成的情况及其可能机制。方法设计并化学合成针对CEACAM1的3对siRNA,脂质体法瞬时转染SHG44细胞,收集细胞培养上清液作为条件培养基。分别采用RT－PCR检测RNA干扰后细胞中CEACAM1及血管内皮生长因子（ VEGF） mRNA表达的变化情况,ELISA法检测上清液中VEGF蛋白的含量。 MTT比色法及Transwell侵袭实验检测共培养刺激后HUVEC增殖及迁移能力的变化,体外血管生成实验检测体外血管生成能力。结果与正常对照组和阴性对照组相比,转染CEACAM1－siRNA后胶质瘤细胞中CEACAM1 mRNA的表达水平下调（P＜0．01）,以CEACAM1－siRNA3组最为显著。 RNA干扰后SHG44细胞VEGF mRNA及上清液中的VEGF蛋白含量均减少,HUVEC的增殖受到抑制,迁移及体外血管生成能力下降。结论 CEACAM1－siRNA能够下调SHG44细胞中CEACAM1 mRNA的表达,并通过减少VEGF分泌,从而影响HUVEC的增殖、迁移和体外血管生成能力。     

肽类生长因子及苏拉明对体外培养人脐静脉内皮细胞生长的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和苏拉明(suramin)对体外培养人脐静脉内皮细胞生长(HUVEC)的影响，旨在探讨他们在肿瘤血管生成和抗肿瘤血管生成中的作用。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞EV—304，一组用不同浓度的bFCF(0．01、0．1、1．0、10、100ng／mL)进行培养，另一组在用不同浓度的苏拉明(0．01、0．1、1．0、10、100μmol/L)培养6h后抑入浓度为10ng／mL的bFGF再进行培养。结果：bFCF可明显刺激内皮细胞的生长，而Suramin可阻止bFGF对内皮细胞的生长刺激。结论：苏拉明对体外培养内皮细胞的生长抑制作用可能是通过中和肽类生长因子如bFGF及引起内皮细胞凋亡来实现的。     

胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用对整合素αv表达的影响

背景与目的:研究表明整合素αv亚基与胶质瘤生物学行为密切相关。本研究探讨胶质瘤细胞和内皮细胞相互作用对整合素αv亚基表达的影响。方法:利用Transwell共培养系统在体外对C6胶质瘤细胞和人脐静脉内皮细胞进行共培养,通过半定量RT-PCR方法检测单独培养和共培养后的C6细胞和人脐静脉内皮细胞上整合素αv的mRNA转录的情况,细胞免疫化学方法检测单独培养和共培养后的C6细胞和人脐静脉内皮细胞上整合素αv的表达的情况。结果:经共培养后的C6细胞和人脐静脉内皮细胞上整合素αv的mRNA转录出现上调(P<0.01;P﹤0.05)和免疫染色强度也出现加强。结论:胶质瘤细胞和血管内皮细胞的相互作用可诱导整合素αv表达的上调。     

ING4对缺氧状态下血管内皮细胞增殖、迁移及HIF-1α表达的抑制作用

目的:在缺氧状态下,观察ING4对血管内皮细胞增殖、迁移及血管形成相关因子VEGF、MMP-2、MMP-9活性的影响,并探讨ING4对HIF-1α的调控作用。方法:人脐静脉内皮细胞HUVECs体外培养,构建ING4质粒及干扰RNA转染至HUVECs,应用CoCl2处理细胞模拟缺氧环境,MTT法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞迁移,Real time PCR及Western blot实验检测血管形成相关因子VEGF、MMP-2、MMP-9、HIF-1α及其靶基因AK3的mRNA及蛋白表达水平。结果:MTT及Transwell实验结果显示在缺氧状态下,转染ING4质粒能够抑制人脐静脉内皮细胞株HUVECs的增殖及迁移,而转染ING4 siRNA则能够促进HUVECs增殖及迁移,Real time PCR及Western blot实验结果显示转染ING4质粒能够抑制血管形成相关因子VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白的表达水平,并且能够抑制HIF-1α及其靶基因AK3的表达水平。结论:在缺氧状态下,ING4能够通过抑制血管内皮细胞的增殖及迁移能力,下调血管形成相关因子VEGF、MMP-2、MMP-9的表达水平,进而抑制新血管形成,其机制可能与ING4能够下调缺氧状态下HIF-1α及其靶基因AK3的表达水平有关。     

Arresten对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡影响的研究

目的:观察血管生成抑制因子Arrest-en对人脐静脉内皮细胞Huvec增殖和凋亡的影响.探讨VEGFR在其中的作用.方法:应用MTT法检测不同浓度的Arresten对Huvec细胞增殖的影响;流式细胞仪检测Arresten对Huvec细胞凋亡的影响;半定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测VEGFR mRNA水平及VEGFR蛋白水平的表达.结果:MTT比色法显示,Arresten对Huvec细胞增殖具有抑制作用,随着浓度的增加,Arresten对Hhvec细胞增殖抑制作用也增强;但当浓度增加到800 ng/L后其增殖抑制率不再提高,而此浓度时Huvec细胞的凋亡率达到峰值的(59±0.3)%.经过Ar-resten处理.Huvec细胞的VEGFR mRNA表达及VEGFR蛋白表达均显著下降.结论:Airest-gn通过降低Huvec细胞的VEGFR表达而抑制Huvec细胞增殖并促进Huvec细胞凋亡,这可能是Arresten抑制血管生成的机制之一.     

IL-17通过JAK2/STAT3信号通路诱导PD-L1在肝内胆管癌细胞中的表达

目的:探讨白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)对人肝内胆管癌细胞程序性细胞死亡蛋白配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)表达水平的影响及其潜在机制。方法:使用不同浓度(0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL)的IL-17作用于人肝内胆管癌细胞系RBE和HCCC9810,Western blot检测PD-L1的表达情况,并筛选出IL-17的最佳作用浓度。使用最佳作用浓度处理RBE和HCCC9810细胞,收集mRNA、蛋白质。实时定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测PD-L1在mRNA水平的表达情况。Western blot检测JAK2/STAT3信号通路的活化情况,并使用AG490阻断信号通路,Western blot检测通路被阻断后,IL-17对RBE及HCCC9810细胞PD-L1表达水平的影响。结果:IL-17诱导了PD-L1在RBE和HCCC9810细胞中的表达,并且PD-L1的上调幅度与IL-17的浓度相关,当浓度为50 ng/mL和100 ng/mL时,对PD-L1的诱导作用最为显著。与对照组相比,50 ng/mL的IL-17可显著刺激PD-L1在mRNA水平的表达(P＜0.01)。同对照组相比,50 ng/mL的IL-17促进了STAT3和JAK2蛋白的磷酸化水平(P＜0.01),但并不影响STAT3和JAK2总蛋白的表达水平(P＞0.05)。在使用AG490阻断JAK2/STAT3信号通路后,IL-17诱导PD-L1蛋白表达的能力明显减弱(P＜0.05)。结论:IL-17可诱导PD-L1在人肝内胆管癌细胞系RBE和HCCC9810中的表达,其机制可能与促进JAK2/STAT3信号通路蛋白的磷酸化水平有关。     

G-CSF在人实体肿瘤细胞株中的表达及其对细胞增殖的影响

目的:探讨G-CSF在人实体肿瘤细胞株中的表达及外源性rhG-CSF对肿瘤细胞增殖的影响及机制。方法:人G-CSF ELISA试剂盒检测肿瘤细胞G-CSF的分泌水平,细胞计数法和MTT法检测rhG-CSF对肿瘤细胞增殖的影响,流式细胞仪分析rhG-CSF对KB细胞周期和细胞凋亡的影响,免疫细胞化学检测G-CSF受体在肿瘤细胞中的表达。结果:T-24细胞分泌大量G-CSF;rhG-CSF呈剂量依赖性促KB细胞增殖,并在质量浓度为100 ng/mL达最大值,与对照相比,差异有统计学意义(P<0.05);KB细胞表达G-CSF受体,rhG-CSF拮抗KB细胞的G0/G1期阻滞,降低KB细胞凋亡率。结论:T-24细胞表达G-CSF;rhG-CSF通过作用于KB细胞表面的G-CSF受体拮抗G0/G1期阻滞、抑制凋亡而发挥促增殖作用。     

miR-429靶向调控SIAH1基因对结直肠癌细胞LOVO增殖的影响

目的 探讨miR-429靶向SIAH1基因对结直肠癌细胞系LOVO细胞增殖的影响。方法 采用qRT-PCR检测正常结肠黏膜上皮细胞系NCM460和结直肠癌细胞系SW480、LOVO、HT-29中miR-429的表达。将miR-429 mimic和miR-429阴性对照序列（NC）转染至LOVO细胞,同时设置Control组。预测miR-429的靶基因并用双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系。采用Western blot检测SIAH1蛋白的表达水平,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期分布情况。结果 qRT-PCR检测结果显示,相对于NCM460细胞,miR-429在各结直肠癌细胞系中的表达均降低（均P<0.001）。双荧光素酶报告基因实验证实了SIAH1与miR-429的靶向关系。与NC组相比,过表达miR-429能抑制LOVO细胞中SIAH1蛋白的表达（P<0.001）,细胞被阻滞在G0G1期,细胞增殖能力降低（P<0.001）。结论 miR-429通过靶向SIAH1基因表达抑制LOVO细胞增殖。     

光动力作用对人乳腺癌细胞增殖的实验研究

目的:探讨光动力疗法(PDT)对人乳腺癌细胞增殖的影响。方法:以人乳腺癌细胞株MDA-MB-231为研究对象,以血卟啉衍生物(HpD)为光敏剂,630nm波长的激光为光源,MTT法绘制MDA-MB-231PDT后不同时间的生长曲线。流式细胞仪检测PDT对人乳腺癌细胞阻滞的细胞周期,免疫组化观察PDT对增殖细胞核抗原(PCNA)的影响。结果:生长曲线示PDT对人乳腺癌细胞增殖有明显的抑制作用;PDT作用后早期(12h)G0/G1期比例明显高于对照组(P<0.05),且呈时间依赖性变化;免疫组化示:实验组PDT后各时间段PCNA阳性细胞蛋白表达率较对照组阳性表达率明显下降(P<0.01)。结论:光动力疗法可阻滞人乳腺癌细胞增殖,其机制可能与PDT阻滞细胞于G0/G1期和降低PCNA的表达有关。     

Role of exosomes released by chronic myelogenous leukemia cells in angiogenesis

Our study is designed to assess if exosomes released from chronic myelogenous leukemia (CML) cells may modulate angiogenesis. We have isolated and characterized the exosomes generated from LAMA84 CML cells and demonstrated that addition of exosomes to human vascular endothelial cells (HUVEC) induces an increase of both ICAM-1 and VCAM-1 cell adhesion molecules and interleukin-8 expression. The stimulation of cell-cell adhesion molecules was paralleled by a dose-dependent increase of adhesion of CML cells to a HUVEC monolayer. We further showed that the treatment with exosomes from CML cells caused an increase in endothelial cell motility accompanied by a loss of VE-cadherin and β-catenin from the endothelial cell surface. Functional characterization of exosomes isolated from CML patients confirmed the data obtained with exosomes derived from CML cell line. CML exosomes caused reorganization into tubes of HUVEC cells cultured on Matrigel. When added to Matrigel plugs in vivo, exosomes induced ingrowth of murine endothelial cells and vascularization of the Matrigel plugs. Our results suggest for the first time that exosomes released from CML cells directly affect endothelial cells modulating the process of neovascularization.     

GPX1在结直肠癌组织中的表达及其对癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

目的:探讨谷胱甘肽过氧化物酶1 (glutathione peroxidase 1,GPX1)在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)组织中的表达水平及其对CRC细胞株HT29和LOVO细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响.方法:收集2015年6月至2016年3月间海口市人民医院滨江分院普外科手术切除的60例临床CRC组织及癌旁组织,应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测CRC组织及癌旁组织中GPX1 mRNA水平.在高表达GPX1 mRNA的HT29细胞株用慢病毒携带shRNA感染的方法构建敲除GPX1的细胞株,瞬时转染法在低表达GPX1 mRNA的LOVO细胞系构建过表达GPX1的细胞株,并在GPX1 mRNA及蛋白水平进行验证.通过MTS法检测CRC细胞的增殖能力的变化,用划痕实验、Transwell侵袭实验分别检测CRC细胞迁移侵袭能力的变化,同时用Western blotting检测E-钙黏蛋白和波形蛋白表达的变化.结果:CRC组织中GPX1 mRNA表达水平显著低于癌旁组织(0.051±0.024 vs 0.142±0.051,P＜0.01).敲除GPX1后,HT29细胞的增殖能力显著增强(12.901±2.790 vs 6.617±2.462,P＜0.01)、侵袭能力显著增强[(384.7±37.9) vs (209.2±31.2)个,P＜0.01]、迁移能力显著增强[(0.139±0.025)vs (0.251±0.038)mm,P＜0.01]、E-钙黏蛋白表达下调(P＜0.01)、波形蛋白表达上调(P＜0.05).过表达GPX1的LOVO细胞的增殖能力显著降低(P＜0.01)、迁移和侵袭能力下降(均P＜0.05)、E-钙黏蛋白上调(P＜0.01)、波形蛋白表达下调(P＜0.01).结论:GPX1mRNA在人CRC组织中低表达,GPX1负向调控CRC细胞的增殖、迁移和侵袭,其在CRC中可能发挥抑癌作用.     

珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效应及机制研究

目的观察珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效应并初探其分子机制。方法体外细胞培养采用人肝癌细胞株SMMC-7721,分为对照(BL)组、珠子参(PJ)组、二甲基亚砜(DMSO)组及5-FU组,采用电镜观察作用后肝癌细胞超微结构改变;流式细胞仪检测肝癌细胞周期和凋亡率;RT-PCR法检测癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、p21表达的变化。结果与对照组比较,电镜下珠子参组SMMC-7721细胞染色质浓缩,分解成大小不一有膜包绕团块,内含有新月形DNA物质及细胞器,形成凋亡小体;周期分析可见G0/G1期细胞阻滞,阻止了细胞向S期的转换,并引起细胞凋亡,凋亡率达38.34%;RT-PCR半定量分析珠子参能降低癌基因c-myc表达(P<0.05),增高抑癌基因p53和p21表达(P<0.05)。结论珠子参能诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡,部分作用机制可能与阻滞细胞停留在G0/G1,降低癌基因c-myc和c-fos表达,增高抑癌基因p53和p21表达有关。