心脏电生理学新概念:(11) 膜片钳技术在心血管基础和药物研究中的应用

膜片钳技术，特别是全细胞记录技术发明20年来，极大地推动了心血管生理、病理生理及药理学的研究，使人们对心血管系统生理调节，分子水平的病理学改变，及药物的作用机制有了更深的认识和研究手段，解决了大量的理论和实际问题。今后膜片钳技术在心血管基础和药物研究中仍将发挥重要的作用。本文简要介绍膜片钳技术在心血管研究中的应用及进展情况。１ 心肌细胞膜离子通道电流的记录 这是膜片钳全细胞记录的主要优势之一，也是最常用的手段。目前应用这一技术可以检测到心肌细胞上各种离子通道。如钠通道，钙通道，钾通道和氯通道等及其亚…     

钙激活性钾通道是人小肠上皮细胞的容积调节性通道(英文)

目的 :研究细胞容积调节机制 ,探讨人类小肠上皮细胞调节性容积减小 （RVD）过程中离子通道的作用及其种类。方法 :膜片钳全细胞记录和单通道记录法记录培养的人类小肠上皮细胞 RVD过程中电流的变化 ,细胞容积测定法观察 RVD过程中特异性钙激活性钾通道阻断剂 （clotrimazole）的作用。结果 :全细胞记录法证实细胞 RVD过程中 K+通道和 Cl-通道电流同时被激活 ,该 K+通道电流具有明显的钙依赖性并可被 clotrim azole阻断。单通道记录法进一步证实 RVD过程中激活的 K+通道为 Interm ediate- conductance钙激活性钾通道。结论 :人类小肠上皮细胞在低渗溶液作用下具有 RVD过程 ,钙激活性钾通道在 RVD过程中具有十分重要的作用。     

膜片钳技术在心电生理研究中的应用

膜片钳技术在心电生理研究中的应用陈灏珠蒋文平Ｎｅｈｅｒ和Ｓａｋｍａｎ于１９７６年首次报告用膜片钳技术记录了细胞膜离子单通道电流，近２０年来这一技术得到了广泛的应用，推进了细胞和分子生物学的发展，心电生理深入的研究也离不开膜片钳技术，它的基本方法与经典...     

膜片钳技术在高血压研究中的应用

膜片钳技术(patch - clamp technique)是1976年由Nehetr 和Sakroann在电压钳的基础上发展而来的一种记录细胞膜离子通道电生理活动的技术.通过微电机与细胞膜之间形成紧密接触,采用电压钳或电流钳技术对生物膜上离子通道的电活动进行记录.膜片钳技术的应用将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起,已成为现代细胞电生理研究的常规方法,使人们对于疾病和药物作用的认识不断更新.膜片钳技术用于心血管领域的研究也越来越多.本文拟对膜片钳技术在高血压病研究中的应用作一综述.     

在人小肠上皮细胞膜上检出钙激活性钾通道(英文)

目的 :研究人类小肠上皮细胞 （Intestine40 7cell lines）膜上钙激活性钾通道的分子生物学特征及其电生理学特性。方法 :用 RT- PCR方法检测培养的人类小肠上皮细胞膜上钙激活性钾通道的表达形式 ,用膜片钳的全细胞记录及单通道记录法探讨了该通道的电生理学特点。结果 :RT- PCR证实该细胞系有 interm ediate- conductance（IK）钙激活性钾通道表达 ,而没有 large- conductance（BK）和 small- conductance（SK）钙激活性钾通道的表达。电生理学研究表明 ,Ionom ycin引导的全细胞电流显示该钙激活性钾电流具有内向整流性并可被特异度 IK钙激活性钾通道阻断剂 clotrimazole所抑制 ,但特异度 SK钙激活性钾通道阻断剂 apam in对该电流无明显抑制作用。单通道记录法证实该通道的电导为 30± 2 p S,通道活性对细胞内 Ca2 +浓度有明显依赖性。结论 :分子生物学和电生理研究证实了人类小肠上皮细胞膜上有 IK钙激活性钾通道 ,其生理学意义有待进一步研究     

大鼠心房肌细胞三磷酸腺苷敏感钾通道的牵张敏感性

目的研究成年大鼠心房肌细胞三磷酸腺苷敏感钾通道(KATP)的牵张敏感性。方法应用单通道膜片钳技术在开放细胞贴附模式下记录大鼠心房肌细胞上KATP通道的电活动,并研究KATP通道对机械刺激的反应。结果根据通道的激活方式、药理学特性、I-V曲线、反转电位及整流特性,确定所记录的通道为KATP通道。进一步研究表明该通道的开放概率对负压刺激呈现强度依赖性。结论大鼠心房肌细胞上的KATP通道对牵张刺激敏感。     

成年大鼠心房肌牵张激活钾通道的牵张敏感性和门控机制

目的探讨成年大鼠心房肌细胞牵张激活钾通道（stretch-activated K+-selective channels,SAKCs）的电生理学特性,确定皮质细胞骨架在通道门控机制中的作用,对从通道水平阐明机械-电反馈具有重要的理论和实际意义。方法联合应用单通道膜片钳技术和压力钳技术,在急性分离的成年大鼠心房肌细胞上,采用细胞贴附（cell-atta-ched）方式记录SAKCs的活动。结果实验所记录的通道为SAKCs,通道闪烁样开放,无整流特性。当细胞外液为高K+液（140mmol/L）时,翻转电位为0mV。钳制膜电位+60mV时单通道的电导值为（59±5）pS,-60mV时为（51±8）pS。通道约在负压刺激开始700800ms内被快速激活,刺激解除后,通道快速在500ms内去激活。超过-30mmHg（1mmHg=0.133kPa）的刺激可使多个通道同时开放。实验中未观察到通道活动达到饱和现象。单通道电流幅度不受负压刺激的影响。随膜片钳电极内负压的增加,通道开放概率增大,呈刺激强度依赖性。Cytocha-lasin B不改变SAKCs的电流幅度,但增加SAKCs的开放概率,增强SAKCs的背景活动和对机械刺激的敏感性。结论我们推测生理状态下细胞皮质肌动蛋白内衬于细胞膜,可能作为细胞膜的并联成分承受部分细胞应力,并使脂质膜的应力减少,从而使SAKCs不易被激活。     

豚鼠心房肌细胞的分离及其离子流记录

为探讨豚鼠心房肌细胞的分离方法及其离子流记录,采用酶解技术分离豚鼠心房肌细胞,应用膜片钳全细胞记录技术,记录细胞膜L型钙流(L-I_(Ca))及延迟整流性钾流(I_K)。结果获得了具正常电生理活性的单个细胞及高阻封接的形成,成功记录了L-型钙流和延迟整流性钾流。认为本方法分离的单个心房肌细胞具正常的电生理活性,可用于研究心房肌细胞离子通道活性。     

膜片钳技术及其在心血管研究中的应用

80年代初发展起来的膜片钳技术(ｐａｔｃｈｃｌａｍｐｔｅｃｈｎｉｑｕｅ)[1]为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段。该技术的兴起与应用,使人们不仅对生物体的电现象和其他生命现象更进一步的了解,而且对于疾病和药物作用的认识也不断的更新,同时还形成了许多病因学与药理学方面的新观点。本文拟对膜片钳的基本原理及在心血管研究中的应用作一综述。1　膜片钳技术基本原理与特点　　膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴,两者的区别关键在于:①膜电位固定的方法不同;②电位固定的细胞膜面积不同,…     

豚鼠心房肌细胞的分离与其离子流记录

为探讨豚鼠心房肌细胞的分离方法及其离子离子流记录，采用酶解技术分离豚鼠心房肌细胞，应用膜片钳全细胞记录技术，记录细胞膜Ｌ型钙流（Ｌ－Ｉｃａ）及延迟整流性钾流（Ｉｋ）。结果获得了具正常电生理活性的单个细胞及高阻封接的形成，成功记录了Ｌ－型钙流和延迟整流钾流，认为本方法分离的单个心房肌细胞具正常的电生理活性，可用于研究心房肌细胞离子通道活性。     

卡维地洛对豚鼠心室肌细胞离子流的研究

卡维地洛是临床上广为应用的非选择性 β受体、选择性α1受体阻滞剂 ,在动物实验和临床研究中都显示具有抗心律失常作用 ,本研究系统地观察卡维地洛对豚鼠心室肌细胞离子流的直接影响 ,探讨其细胞电生理作用。1 材料与方法 :选用 2 0 0～ 3 0 0g的健康豚鼠 ,酶解法分离获得单个左心室肌细胞 ,采用膜片钳全细胞记录技术 ,膜片钳放大器为美国AxonInstruments公司产Axopatch 2 0 0B型 ,电压钳制脉冲发放和数据采集由Pclamp 6 0 4软件控制 ,根据所记录离子流的不同采用相应的电极外液和电极内液。卡维地洛 (山东齐鲁制药厂提供 )以浓度递增方…     

不同形态的家兔房室结细胞超极化钳制电流特性的 …

为探讨家兔房室结３层细胞束细胞的电生理特性，按房室结３层细胞束４种细胞的形态特点，用胶原酶灌注分离房室结细胞并从中筛选４种形态细胞；圆形，椭圆形，细长形和条状形细胞，应用膜片钳全细胞记录技术观察各形房室结细胞超极化钳制电流的特征。超极化钳制时，房室结细胞中１２个条状形细胞中４个记录到较弱的内向整流钾电流（Ｉｋ１）其他各形细胞均未记录到Ｉｋ１。大部分圆形和椭圆形细胞（１１／１４）记录到起搏电流Ｉｆ，     

心力衰竭家兔左心室瞬间外向钾通道重构及氯沙坦干预研究

本研究应用膜片钳全细胞记录方法记录左心室心肌瞬间外向钾电流（I10）；应用半定量一聚合酶链反应（RT．PCR）法检测左心室瞬间外向钾通道a亚单位Kv1.4、Kv4.2和Kv4.3，mRNA表达，观察心力衰竭家兔左心室瞬间外向钾通道重构情况以及氯沙坦的干预作用，进一步探讨血管紧张素受体拮抗剂（ARBs）降低心力衰竭心律失常的机制。     

成年小鼠心肌细胞的分离及电生理特性

目的 :摸索成年小鼠心肌细胞分离方法并观察其电生理特性。方法 :采用酶消化法分离单个心肌细胞 ,应用膜片钳全细胞记录技术记录钙电流和钾电流。结果 :本法分离所得心肌细胞横纹清晰 ,一次性复钙 ,可获得 5 0 %～6 0 %的耐钙细胞 ;并具有正常电生理活性 ,易于形成高阻封接 ,可用于钙电流和钾电流记录。结论 :本实验所采用的分离方法经济、简便、成功率高 ,所获细胞具有正常的电生理活性     

人参皂甙单体Rh1对心肌作用的单钙通道分析及电子自旋共振…

应用细胞封接式膜片钳方法，在Ｗｉｓｔａｒ大鼠的单个心室肌细胞上记录了Ｔ型、Ｌ型和Ｂ型钙通道的单通道活动，人参三醇组皂甙单体Ｒｈ１６０ μｍｏｌ／Ｌ显著抑制３种类型钙通道的活动，使其开放概率减少与开放时间缩短，对通过通道的离子流幅度无明显影响，用电子自旋共振法测定了培养心肌细胞的自由基含量，Ｒｈ１ ３０μｇ／ｍｌ能显著抑制黄嘌呤－黄嘌呤氧化酶引起的自由基含量增多。     

有氧运动抑制衰老大鼠脑动脉平滑肌STOC/BKCa功能下调

目的　探讨有氧运动训练对衰老大鼠脑动脉平滑肌细胞全细胞K⁺电流、自发瞬时外向电流及大电导钙激活钾通道生物物理特性的影响。方法　19～21月龄雄性Wistar大鼠12只（老年组）,随机分为安静组和有氧运动组,并选用2月龄Wistar大鼠安静处理作为青年对照组。12周后取脑动脉,急性分离动脉平滑肌细胞。分别采用膜片钳全细胞模式、穿孔膜片钳模式和单通道内面向外模式观察运动对全细胞K⁺电流、自发瞬时外向电流和大电导钙激活钾通道门控特性的影响。结果　安静组全细胞K⁺电流密度及对Iberiotoxin敏感性降低;安静组自发瞬时外向电流幅值降低,频率无明显变化;安静组大电导钙激活钾通道平均开放概率和平均开放时间显著低于青年对照组,而平均关闭时间高于青年对照组;电压依赖性和钙敏感性亦显著下降;与安静组相比,有氧运动可以增加全细胞K⁺电流密度、自发瞬时外向电流幅值及大电导钙激活钾通道平均开放概率、电压依赖性和钙敏感性来实现对大鼠脑动脉平滑肌自发瞬时外向电流/大电导钙激活钾通道功能的保护作用。结论　长期规律有氧运动可以减弱衰老所致的大鼠脑动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道功能下调,这可能是有氧运动改善衰老动脉功能的重要机制之一。     

钾通道活性降低促进大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖

低氧性肺动脉高压 (ＨＰＨ)的病理基础是肺小动脉收缩反应增强和结构重建。研究发现 ,缺氧通过抑制电压依赖钾通道使肺动脉平滑肌细胞 (ＰＡＳＭＣｓ)收缩。ＰＡＳＭＣｓ增殖是ＨＰＨ血管重建的重要组成部分 ,目前还不清楚钾通道在其中所起的作用。我们的研究旨在明确钾通道活性降低对培养大鼠ＰＡＳＭＣｓ增殖的作用。材料与方法　细胞培养 :采用酶消化法培养大鼠ＰＡＳＭＣｓ,经免疫组化法鉴定细胞纯度为 98%。膜片钳试验 :各种钾通道阻断剂对ＰＡＳＭＣｓ钾电流 (ＩＫ)的影响采用标准膜片钳全细胞记录法[1] 进行。细胞增殖 :5～ 10代ＰＡ…     

褪黑素在诱发肠系膜动脉舒张过程中对BKCa通道的直接作用机制

目的探讨褪黑素(MT)在诱导血管舒张过程中对大电导钙激活钾通道(BK_(Ca)通道)的直接作用机制。方法选用8周龄雄性Wistar大鼠,麻醉后取肠系膜动脉,分别采用微血管张力测定和单通道膜片钳技术检测褪黑素及其受体对血管张力和血管平滑肌细胞BK_(Ca)通道门控特性的影响。结果 (1)褪黑素本身对血管张力没有显著影响,但是可引起去甲肾上腺素(NE)激动的肠系膜动脉呈浓度依赖性舒张,这种舒张作用可以被褪黑素受体MT1/MT2阻断剂2-苯基-N-乙酰色胺(Luz)和BK_(Ca)通道特异性阻断剂iberiotoxin(Ib TX)不同程度地抑制,其中Ib TX抑制作用更显著。(2)单通道膜片钳贴附式结果显示,褪黑素可引起肠系膜动脉平滑肌细胞BK_(Ca)通道的开放概率、平均开放时间显著增加,平均关闭时间显著降低;Luz可显著抑制褪黑素对BK_(Ca)通道的激活作用。(3)单通道膜片钳内面向外模式结果同样显示,褪黑素可引起BK_(Ca)通道的开放概率、平均开放时间显著增加,平均关闭时间显著降低。结论褪黑素可诱发肠系膜动脉血管舒张,其中,褪黑素直接或通过受体作用间接激活平滑肌细胞BK_(Ca)通道可能是其作用机制之一。     

心肌细胞自发搏动节律模式和转化机制的实验研究

选取离体培养心肌细胞、细胞片作为心脏起步节律实验模型,通过膜片钳(EPC9,Germany)在电流钳模式下记录自发性膜电位活动节律、Powerlab电生理系统配合Photometry光学系统记录收缩节律和动态离子图像系统记录(TILLvsION,Germany)[Ca2+]i振荡节律,对心脏细胞起步节律进行实验研究.