Survivin在骨髓间充质干细胞中的表达研究

目的：培养鉴定骨髓间充质干细胞（MSCs）,检测survivin的表达。方法：应用Ficoll法分离培养MSCs,流式细胞仪检测其特异性表面标志物,RT—PCR检测survivin mRNA表达。结果：培养MSCs的超微结构显示了干细胞特性,流式细胞仪检测证实为MSCs,survivin mRNA表达阳性。结论：Survivin在正常人骨髓间充质干细胞中有表达,提示它可能参与了其生物学行为并影响间充质干细胞存活。     

骨髓间充质干细胞研究进展

骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展,但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。     

骨性关节炎滑膜间充质干细胞分化能力研究

目的探讨从骨性关节炎(OA)滑膜组织分离、培养滑膜间充质干细胞(SDSCs)的可行性,并分析其细胞增殖能力及成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化能力。方法选取临床中因膝关节OA行关节置换的患者,提取手术中正常切除的滑膜组织,进行SMSCs的分离和培养。然后,对其进行成脂诱导、成骨诱导和成软骨诱导。结果来源于OA关节的滑膜组织,同样可以分离出SDSCs,进行传代培养,并向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化。结论 OA关节的滑膜组织中提取的SDSCs具有良好的增殖和多向分化能力。     

人骨髓间充质干细胞体外不同分离与培养方法的比较

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)理想的分离、培养方法。方法采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁法分离培养人骨髓干细胞,并将其分别置于普通培养瓶6、0Co培养瓶中培养,应用倒置显微镜和免疫组化法观察和鉴定骨髓间充质干细胞;流式细胞术检测细胞表面标志。结果人骨髓干细胞呈均一梭形、成纤维细胞样,形成集落样生长。60Co培养瓶细胞贴壁情况明显好于普通培养瓶,且费用低;免疫组化及流式细胞术显示CD34、CD45表达为阴性,CD29、CD44表达为阳性。60Co照射处理的培养瓶结合采用全骨髓贴壁法分离培养法获得的骨髓干细胞活性高,增殖力强,克隆形成早,传代时间短。结论全骨髓贴壁法和密度梯度离心法均可获得高纯度贴壁生长的骨髓干细胞,其中60Co照射处理的培养瓶结合采用全骨髓贴壁法分离培养简单易行,骨髓干细胞增殖快,活性好,传代力持久。可以收获大量、高纯度的MSCs;本实验为MSCs进一步的研究与临床应用提供了实验方法及依据。     

人胚胎骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

目的：摸索分离和鉴定高纯度的人胚胎骨髓间充质干细胞。方法：采用密度梯度离心法，分离含有间充质干细胞的人胚胎骨髓细胞悬液，获得人胚胎骨髓间充质干细胞。用流式细胞仪检测获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量。结果：获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量达85％。结论：密度梯度离心法分离获得的人胚胎骨髓间充质干细胞纯度高。     

人胚胎骨髓间充质干细胞在大鼠体内分化为肝细胞的研究

目的：观察人胚胎骨髓间充质干细胞(MSC)在受体大鼠体内的分化演变，研究人胚胎骨髓间充质干细胞在活体大鼠体内转化为人肝细胞的可行性。方法：将人胚胎MSC移植到肝损伤合并自身肝细胞再生抑制大鼠的脾脏。术后分时段取脾脏进行免疫组化染色，了解人白蛋白(ALB)、人角蛋白(CK8)、人CK18、人CK19的表达情况。结果：人胚胎MSC移植后10d大鼠脾脏的人CK8、人CK18、人CK19免疫组化染色可见阳性细胞；移植后15d大鼠脾脏组织内人ALB免疫组化染色可见阳性细胞。结论：人胚胎MSC能够在自身肝细胞再生抑制的肝损伤大鼠脾脏内分化为肝细胞。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性

从人骨髓中分离人间充质干细胞（ＭＳＣｓ）,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态,ＭＴＴ实验检测不同细胞因子对细胞增殖的影响。应用流式细胞学技术测定细胞周期及细胞表面抗原特征并观察细胞组织化学特点。结果：ＭＳＣｃ具有独特的表征,即ＣＤ２９,ＣＤ４４,ＣＤ１６６阳性,ＣＤ３４,ＣＤ４５,ＨＬＡ－ＤＲ和荆豆素阴性。细胞化学结果显示,几乎所有细胞酸性萘酚醋酸酯酶（ＡＮＡＥ）及糖原（ＰＡＳ反应）阳性,酸性磷酸酶（Ａ     

全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞及向神经样细胞分化的研究

目的目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离方法,实验通过全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经样细胞,以寻找一种简便、实用的分离方法。方法取大鼠骨髓,全骨髓培养法结合差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增。倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,免疫组化染色鉴定细胞。用MTT法间接测定不同代数细胞活力。诱导分化,先用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导24h,然后加入丁羟基茴香醚诱导（BHA）和二甲基亚砜（DMSO）诱导。观察诱导过程中细胞的形态变化,并用免疫组化染色法鉴定细胞。结果全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,免疫荧光染色示CD90、CD71、CD106表达阳性,CD45阴性。MTT法检测细胞活力示2、4、6代细胞于酶标仪490nm波长处吸光度值均高于第8、10代细胞。细胞经诱导后,细胞呈神经样细胞形态,并且神经元特异性表面标志β微管蛋白（β-Ⅲ-Tubulin）、巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）表达阳性。结论采用全骨髓培养法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化为神经样细胞。     

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

为建立分离纯化、大鼠扩增人骨髓间充质MSC，改进其冰冻保存的方法，并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法，以Percoll(1.073g/ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞，用含经筛选的10％的胎牛血清的低糖DMEM体外培养扩增骨髓干细胞（MSC），FCM鉴定细胞纯度，传代2次以后的细胞吸附于明胶海绵内，以TGF－β为主要刺激因子体外诱导1周，植入裸鼠皮下。在不同的时间取出组织块，甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现，体外培养扩增的人间充质MSC表达CD166、CD29、CD44等表面抗原，不表达CD34、CD45、HLA－DR等抗原；MSC可以不经消化，直接在原培养瓶内冻存在－70℃低温冰箱，3个月后复苏的细胞生物学特性没有明显改变；体外诱导的细胞植入裸鼠皮下4周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓MSC具有独特的生物学特征，体外培养的MSC具有体内成软骨能力，应用MSC构建软骨组织具有一定的可行性。     

人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的建立

目的：建立并优化骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）分离纯化及培养扩增的方法。方法：利用Ｐｅｒｃｏｌｌ（１．０７３ｇ／ｍｌ）及Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（１．０７７ｇ／ｍｌ）两种分离介质分离骨髓单个核细胞,筛选体外培养ＭＳＣｓ适宜的血清及浓度,通过流式细胞术分析鉴定ＭＳＣｓ的纯度。结果：经Ｐｅｒｃｏｌｌ分离,应用１０％筛选出的血清培养与扩增的ＭＳＣｓ,细胞纯度可达９５％左右;相反,应用常规Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ分离骨髓单个核细胞或增加血清浓度,ＭＳＣｓ纯度显著下降。结论：建立了一种稳定而实用的体外分离与培养ＭＳＣｓ的方法。     

miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。     

HMGB1促进人骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的：构建人高迁移率族蛋白（HMGB1）全长编码基因的原核表达载体，诱导和纯化重组蛋白，分析其对人骨髓间充质干细胞的迁移作用。方法：RT—PCR方法从人的单个核细胞中扩增出HMGB1全长编码基因，克隆于原核表达载体pET-24a—d（＋），经IPTG诱导表达，通过亲和层析方法纯化得到携带（His）。标签的HMGB1融合蛋白；RT—PCR方法检测间充质干细胞HMGB1受体的表达；观察HMGB1对人骨髓来源间充质干细胞的迁移作用。结果：构建了融合蛋白HMGB1的原核表达载体，获得了高度纯化的HMGB1融合蛋白。RT-PCR方法检测到间充质干细胞表达HMGB1的某些受体如RAGE和TLR-4。HMGB1在体外能够诱导人骨髓来源的间充质干细胞的迁移。结论：重组HMGB1蛋白能够诱导骨髓间充质干细胞的迁移，此作用有可能通过RAGE和（或）TLR-4介导。     

骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导

目的：观察骨髓问充质干细胞（MSC）体外培养及诱导成骨分化的特征。方法：采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导。应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶（ALP）检测。结果：MSC成骨细胞诱导培养第l～3天的细胞增殖旺盛,3～5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后,矿化结节形成率分别为（70．5±3．5）％和（87．5±3．5）%,ALP染色阳性率分别为（41．5±1．5）％和（85．2±1．7）％。结论：在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。     

HGF基因修饰增强间充质干细胞的免疫抑制作用

目的：探讨HGF基因在间充质干细胞（mesenehymal stem cell，MSC）中过表达对细胞生物学的影响，为扩充MSC临床应用范围提供依据。方法：用携带HGF基因的重组腺病毒感染人骨髓来源的间充质干细胞后。与对照细胞相比，进行以下项目的检测：FCM测定细胞表型；MTT法测定细胞增殖能力；ALP和钙定量以及组织化学染色检测细胞体外成骨和成脂肪能力；^3H—TdR掺入法测定MSC—HGF对混合淋巴细胞反应中效应细胞增殖活性的抑制作用。结果：HGF基因转染后MSC表型、体外增殖和分化能力无改变；混合淋巴细胞反应中，MSC—HGF对异基因抗原诱导的淋巴细胞增殖活性的抑制效应存在剂量依赖关系；MSC—HGF／MSC与效应细胞比例为1：80时，MSC组淋巴细胞增殖活性（cpm值）降低19．8％，MSC—HGF组降低68．3％，抑制率是MSC组的3．45倍。结论：HGF基因转染的人骨髓MSC仍维持固有的增殖和分化能力，而对体外细胞免疫反应具有更强的抑制效果，提示MSC—HGF在造血干细胞移植和器官移植中的潜在应用价值。     

骨髓间充质干细胞对大鼠肺组织胶原的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对博来霉素(BLM)引起的肺损伤大鼠肺组织胶原的影响,初步探讨其作用机制。方法:将SD大鼠MSCs异体注入受体大鼠体内,2周后观察肺组织病理学变化,同时检测肺组织羟脯氨酸含量及转化生长因子β1(TGFβ1)、血小板源性生长因子-A、B(PDGF-A,B)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)mRNA的变化。结果:MSCs的植入可使增生的大鼠肺泡间隔、基质胶原及Ⅰ、Ⅲ型胶原明显降低,使升高的肺组织羟脯氨酸及TGFβ1、PDGF-A,B、及IGF-ⅠmRNA的表达显著降低。结论:MSCs可减少肺损伤大鼠肺组织中的胶原含量,此作用与MSCs降低了多种促纤维化细胞因子的表达有关。     

骨髓间质干细胞对小鼠皮肤瘢痕形成的抑制作用观察

目的 探讨骨髓间质干细胞(BM-MSCs)对博来霉素诱导的小鼠皮肤瘢痕的治疗作用及其可能机制.方法 采用直接贴壁法分离培养C57BL/6小鼠的BM-MSCs.将30只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、皮肤瘢痕模型组和BM-MSCs移植组(n=10).模型组和BM-MSCs移植组小鼠于背部经皮下注射1ml浓度为1mg/ml的博来霉素,3h后BMMSCs移植组经皮下注射1x106个BM-MSCs,模型组给予相同剂量的PBS,对照组在相同时间点经皮下分别注射相同剂量的PBS,共注射28d.29d时处死全部小鼠,取新鲜皮肤组织,倒置荧光显微镜下观察转化生长因子β1(TGF-31)的表达;另取皮肤组织行HE及Masson's Trichome染色,光镜下观察皮肤病理组织学变化;采用免疫组织化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达.结果 BM-MSCs移植组的皮肤瘢痕程度较模型组明显减轻,真皮层胶原厚度显著小于模型组,反映皮肤纤维化程度的指标TGF-β1及α-SMA蛋白的表达水平也明显低于模型组.结论 BM-MSCs移植可抑制博来霉素诱导的小鼠皮肤瘢痕形成,其机制可能与调节TGF-β1的表达有关.     

BMP12诱导恒河猴骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞

目的研究骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞的可能性。方法通过电穿孔法将外源基因BMP12导入骨髓间充质干细胞中，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞；在形态学和分子生物学水平上对诱导后的细胞加以鉴定。结果光镜下，诱导后的细胞形态发生明显改变；RT-PCR结果表明，诱导后的细胞有BMP12和Collagen Ⅰ的mRNA表达，而没有Coilagen Ⅲ的mRNA表达；诱导后98.39％的细胞呈CD44^ 、HLA-DR^-。结论BMP12能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞，间充质干细胞有可能成为肌腱组织工程种子细胞来源之一。     

自体骨髓间充质干细胞注射治疗骨不连19例

目的 评价自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合纤维蛋白胶注射治疗骨不连的有效性.方法 从患者髂前上棘抽取骨髓10 ml,体外分离、培养、扩增获取BMSCs,与纤维蛋白胶混合后经皮注射治疗19例骨不连.所有患者均定期随访,随访时间5～24 个月,平均10.7个月.结果 注射后6个月,14例达到临床及放射学骨折愈合标准,骨折愈合时间3～6 个月,平均4.1个月.其余5例无骨折愈合征象,视为失败.注射后未发生感染,未出现供区并发症. 结论自体BMSCs复合纤维蛋白胶注射疗法可有效地治疗骨不连.