人hsp90β基因的诱导表达与染色质活化的关系

目的 研究人ｈｓｐ９０β基因的热诱导表达与染色质活化的关系。方法 采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Ｊｕｒｋａｔ细胞内的活性和非活性染色质。然后采用狭缝杂交技术比较热诱地前后人ｈｓｐ９０β基因在活性和非活性染色质中的分布,并用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交的方法研究热休克诱导下的ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达。结果 发现热休克诱导使细胞内人ｈｓｐ９０β基因在活性染色质中的含量明显增加,并与内源性的ｈｓｐ９０β     

入hsp90p基因的热诱导表达与染色质活化的关系

目的研究人hsp90β基因的热诱导表达与染色质活化的关系.方法采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Jurkat细胞内的活性和非活性染色质,然后采用狭缝杂交技术比较热诱导前后人hsp90β基因在活性和非活性染色质中的分布,并用Northern印迹杂交的方法研究热休克诱导下的hsp90β mRNA表达.结果发现热休克诱导使细胞内人hsp90β基因在活性染色质中的含量明显增加,并与内源性的hsp90βmRNA表达水平一致.结论首次证实人hsp90β基因的热诱导表达在染色质水平受“基因开关”的调控,为研究人类细胞热应激机制提供了新的模型.     

人hsp90β基因的热诱导表达与染色质活化的关系

目的研究人ｈｓｐ９０β基因的热诱导表达与染色质活化的关系。方法采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Ｊｕｒｋａｔ细胞内的活性和非活性染色质，然后采用狭缝杂交技术比较热诱导前后人ｈｓｐ９０β基因在活性和非活性染色质中的分布，并用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交的方法研究热休克诱导下的ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达。结果发现热休克诱导使细胞内人ｈｓｐ９０β基因在活性染色质中的含量明显增加，并与内源性的ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达水平一致。结论首次证实人ｈｓｐ９０β基因的热诱导表达在染色质水平受“基因开关”的调控，为研究人类细胞热应激机制提供了新的模型。     

染色质多肽对DNA及细胞核转录的抑制

从大鼠肝制备了对DNA转录有抑制作用的染色质多肽物质,其中不含RNase和DNase活性。经嗜热菌蛋白酶处理后。抑制作用显著降低。对大鼠肝及肝癌细胞核体外转录有抑制作用。     

大鼠肝转录活性染色质的分离及某些理化性质的研究

作者参照Gottesfeld的DNaseⅡ温和消化、配合Mg~(++)溶解的方法,结合本实验室条件加以改进,将大鼠肝染色质分离成S_2、P_1、P_2三个组份。比较分析了它们的化学组成,模板活性及对DNase Ⅰ消化的敏感性。结果显示:S_2染色质组份富含RNA和非组蛋白,具有高模板活性和高度的DNaseⅠ消化敏感性,其RNA含量为P_1、P_2RNA含量的2倍以上,S_2的模板活性分别为P_1、P_2的7.7倍和3.2倍,它对DNase Ⅰ的消化敏感性分别是P_1、P_2组份的20倍和7倍以上。说明此法分离的S_2染色质组份为肝细胞核内的转录活性染色质,而P_1、P_2组份为转录非活性染色质。     

衰老人胚肺成纤维细胞核及染色质的体外转录活性

研究人胚肺成纤维细胞（简称2BS）核及染色质体外转录活性与代龄的关系。方法：用γ-~(32)PATP及~3H-UTP参入法测定衰老2BS细胞核及染色质的转录活性。结果：（1）衰老2BS细胞核的转录起始能力较年轻的下降44％（P＜0.01）；（2）衰老和年轻2BS细胞核内不与染色质结合的RNA聚合酶（RNP）转录活性无差异（P＞0．05），而与染色质结合的RNA聚合酶转录活性则随增龄明显下降（P＜0．01）；（3）衰老2BS染色质体外转录活性较年轻2BS下降58％（P＜0．01），对DNaseⅠ的敏感性也有所降低。结论：衰老2BS细胞核染色质结构的改变可能是转录活性下降的原因。     

热休克蛋白90β基因上游片段的转录调控活性研究

以人工合成的一对寡核苷酸为引物和人外周血淋巴细胞γＧＥＭ－１１基因文库为模板，通过ＰＣＲ护增并克隆了人ＨＳＰ９０β基因上游－１１０２／＋６８ｂｐ片段。将该片段删虍后克隆在报告基因－－荧火虫荧光素酶基因５｀上游，转染Ｊｕｒｄａｔ细胞后测定不同刺激条件下细胞裂解液中的荧光酶活性并同时测定荧光酶ｍＲＮＡ水平。结果表明，ＨＳＰ９０β基因上游片段在正常生理状态下通过启动子介导较高水平的基础转录；热休克时该片     

人热休克蛋白hsp90β基因的染色体定位

目的：研究ｈｓｐ９０β基因的染色体定位。方法：以３ＨｄＣＴＰ和３ＨｄＧＴＰ标记的ｈｓｐ９０β基因－１１０２／＋６８ｂｐ片段为探针，进行染色体原位杂交。结果：分析了２５７个杂交分裂相，１９６５个杂交银颗粒在各条染色体上的分布，发现５号染色体上有杂交银颗粒１８５个，占全部杂交银颗粒的９４１％（Ｐ＜００１）；在５ｑ１３５ｑ２２之间有杂交银颗粒８２个，占全部杂交银颗粒的４１７％，占５号染色体上杂交银颗粒的４４３％。结论：ｈｓｐ９０β定位于５ｑ１３５ｑ２２。由于使用了ｈｓｐ９０β基因上游片段作为探针，本文结果只反映活性基因的定位，可排除假基因的影响。     

Restin基因启动子的克隆及其在HeLa细胞中的转录活性

目的：扩增细胞静息因子（restin）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨其对全反式维甲酸（alltrans retinoic acid,ATRA）刺激的反应．方法：①对restin基因上游约2000bp基因组序列进行计算机生物信息学分析．②利用PCR技术扩增restin基因上游序列,将其克隆入pG5-luc中,插入荧光素酶报告基因上游,取代5个GAL-4结合位点及腺病毒启动子,构建Rp—luc质粒．③将构建的质粒转染入HeLa细胞,ATRA诱导检测该质粒中荧光素酶的表达．结果：酶切及测序结果均证实成功克隆了restin基因上游序列,已将该序列插入到荧光素酶基因的上游;ATRA诱导转入HeLa细胞中的真核表达载体Rp—luc,荧光素酶表达明显增加．结论：成功构建了含有restin基因启动子序列的荧光报告系统,为进一步研究restin基因功能及其转录调控奠定了基础．     

基因体外转录的应用研究

大量研究表明 ,基因表达的调控发生在基因复制、转录、转录后、翻译和翻译后等环节上。而基因转录的调控是逐级调控中最关键的环节。由于参与调控的因素有很多 ,调控的过程非常复杂 ,因此在体内自然条件下 ,对基因的转录情况进行研究比较困难。Pelham和Jackson于 1976年创立了基因的体外转录体系 ,其基本的工作原理是以DNA为模板 ,在转录体系中的一系列转录因子的作用下 ,经RNA聚合酶合成RNA。后来经过很多实验室的不断修订和改进 ,现已成为一项成熟的分子生物学和细胞生物学技术 ,已被开发成为试剂盒并提供标准的试验程序。应用体外转…     

热激活Rac-MEKK-JNK信号通路与hsp90β基因表达

目的探讨Rac-MEKK-JNK(Rac-丝裂原活化的蛋白激酶的激酶的激酶-C-jun N端蛋白激酶)信号通路对热诱导hsp90β基因表达的调控作用以及Hsp90蛋白对Rac信号通路传递的调节过程.方法将载体PcDNA3、显性负突变Rac(DN-Rac),显性负突变MEKK(DN-MEKK)和显性负突变JNK(DN-JNK)表达质粒分别与hsp90β基因转录调控片段介导的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因质粒β3.1共转染Jurkat和LETPa-2细胞,采用以竞争性RT-PCR为基础的系统检测CAT报告基因转录水平.用Western印迹分析检测转染了DN-Rac、DN-MEKK和DN-JNK的细胞在热刺激前后c-Jun的表达水平和磷酸化状态.用体外激酶活性分析法检测geldanamycin(GA)对热诱导的JNK活性的影响.结果转染DN-Rac、DN-MEKK及DN-JNK均能抑制42℃1 h诱导的β3.1报告基因的表达,Jurkat细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(72.8±5)%、(60±13.2)%及(47.7±12.1)%;LETPa-2细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(16.17±5.1)%、(50.2±8.7)%及(47.5±10)%.转录因子c-Jun的表达和磷酸化水平也在一定程度上被抑制.GA处理细胞可明显抑制热诱导激活的JNK激酶活性和c-Jun的磷酸化水平,但不影响JNK和c-Jun的蛋白表达水平.结论Rac-MEKK-JNK通路参与hsp90β基因的热诱导表达,hsp90可能对热激活化的Rac信号通路有调节作用.     

BTB／POZ结构域蛋白GRP对热休克中hsp90a基因表达的增强作用

目的 探讨人BTB／POZ结构域GAGA元件结合相关蛋白(GRP)在hsp90a基因表达中的作用。方法 用正义或反义GRP真核表达质粒或空载体,分别与装有hsp90a基因启动子(-1756- 37)的pREP4 episomal vector质粒和对照质粒pMCAT共转染Jurkat细胞,提取总RNA,用竞争性半定量RT-PCR测定hsp90a-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因相对启动子活性。结果 热休克时,GRP明显促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90a-CAT报告基因启动子活性。结论 GRP可能通过参与染色质动态调整促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90a CAT的表达。     

STAT1对hsp90∝基因表达的负调控作用

目的 探讨转录因子STAT1对hsp90∝基因表达的调控作用。方法 将STAT1表达质粒转染Jurkat细胞,利用竞争性RT－PCR定量检测其内源性hsp90∝基因mRNA水平。共转染STAT1表达质粒和hsp90∝基因上游调控区不同长度的片段驱动的氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因质粒,利用定量RT－PCR检测CAT报告基因转录水平,用Western印迹分析方法检测42℃ 1h热激前后Jurkat细胞中STAT1酪氨酸磷酸化状态,用电泳迁移率变更分析（EMSA）检测STAT1与hsp90∝5‘基因上游调控区中含有STAT1特异结合元件的双链寡核苷酸片段特异性结合程度。结果 STAT1既可抑制Jurkat细胞hsp90∝基因的表达,又能抑制hsp90∝基因5‘上游调控区驱动的CAT报告基因活性。热激以前Jurkat细胞中的STAT1 701位酪氨酸已有一定程度的磷酸化,热激以后其磷酸化程度明显升高,而且STAT1与hsp90∝基因5‘上游调控区中的STAT1结合元件呈特异性结合。结论 STAT1对hsp90∝基因的表达具有负调控作用。     

鼠肝细胞癌变发生过程中热休克蛋白gp96及其基因的动态表达

目的:探讨肝细胞癌变过程中热休克蛋白(HSP)gp96及基因的动态表达与变化。方法:以2-乙酰氨基芴(2-FAA,0.05%)喂饲SD大鼠诱发肝癌,观察肝病理组织学(HE染色)和总RNA的改变,以巢式逆转录酶链反应扩增gp96基因片段;以免疫组化分析肝细胞癌变过程中gp96的动态表达。结果:SD鼠在喂饲2-FAA后,在诱癌早期肝细胞发生颗粒样变性,中期出现不典型增生,后期见大量癌巢结节。癌变过程中肝组织gp96-mRNA表达明显增加,且显著高于对照组肝组织(P<0.01);正常肝gp96蛋白表达较少,肝细胞癌变过程中gp96表达呈显著的梯度增加。结论:gp96参与肝细胞的癌变过程,癌变初期的过度表达有助于肝癌的早期诊断。     

热休克基因转录的调节:热休克转录因子(HSF)的结构与功能

热应激反应 (Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｒｅｓｐｏｎｓｅ)最早由Ｒｉｔｏｓｓａ(１９６２)在研究黑腹果蝇时发现［１］。随后 ,许多学者对其进行了深入研究 ,发现众多生物 ,包括动物、植物、细菌等 ,都具有这一特性。随生物化学及遗传学技术进步 ,热休克蛋白 (Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ)及热休克基因被逐渐发现和探明。迄今 ,ＨＳＰ的结构及在热应激反应中的功能已较为清楚 ,其“分子伴娘”(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒｐｅｒｏｎｅ)［２］的身份已广为人知。同时 ,热应激反应的调节也逐渐受到研究人员的重视。１ＨＳＦ的发现鉴于…     

αB—晶状体蛋白在保护过氧化氢所致心肌细胞损伤中的作用

采用热休克对新生大鼠心肌细胞进行预处理,以诱导αＢ－晶状体蛋白的表达,并观察其对１ｍｍｏｌ．Ｌ＾－１的过氧化氢所致心肌细胞损伤的保护作用。发现：热休克预处理组心肌细胞中αＢ－晶状体蛋白表达明显增加,Ｈ２Ｏ２所致的细胞死亡率及ＬＤＨ释放率降低,总抗氧化能力增强;Ｈ２Ｏ２可引起αＢ－晶状体蛋白从胞浆向胞核及微丝位。     

缺氧诱导乳鼠心肌细胞hsp90a表达及变化

目的探讨缺氧后乳鼠心肌细胞中热休克蛋白90a(hsp90a)表达及变化规律,探讨hsp90a在缺氧心肌细胞中发挥的保护作用。方法采用建立的心肌细胞缺氧模型,蛋白免疫印迹法测定hsp90a蛋白表达变化水平,免疫组化法显示心肌细胞中hsp90a表达的定位。结果缺氧后乳鼠心肌细胞中hsp90a的表达明显升高且呈现出一定规律性。结论缺氧可以诱导心肌细胞中hsp90a的表达增加,其主要分布于心肌细胞浆内,作为一个重要的调控分子参与早期缺氧心肌细胞的保护机制。     

转录因子GATA-2基因在淋巴系白血病中的表达特点

我了解ＧＡＴＡ－２基因在淋巴系白血病中的表达情况。方法 利用反转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）、慢性淋巴细胞白血病（ＣＬＬ）、多毛细胞白血病（ＨＣＬ）和淋巴细胞白血病等１０１０例病人外周血单个核细胞吕ＣＡＴＡ－２基因。结果 ＧＡＴＡ－２基因在ＡＬＬ和ＣＬＬ中的表达率分别为７９．２％和９４．４％,３例ＨＣＬ均表达ＧＡＴＡ－２,３例淋巴瘤细胞白血病仅１例表达ＧＡＴＡ－     

BTB/POZ结构域蛋白GRP对热休克中hsp90α基因表达的增强作用

目的探讨人BTB/POZ结构域GAGA元件结合相关蛋白(GRP)在hsp90α基因表达中的作用.方法用正义或反义GRP真核表达质粒或空载体,分别与装有hsp90α基因启动子(-1756- 37)的pREP4 episomal vector质粒和对照质粒pMCAT共转染Jurkat细胞,提取总RNA,用竞争性半定量RT-PCR测定hsp90α-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因相对启动子活性.结果热休克时,GRP明显促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90α-CAT报告基因启动子活性.结论GRP可能通过参与染色质动态调整促进pREP4 episomal veetor质粒上hsp90α CAT的表达.