蛋白磷酸酶2A Cα在昆虫杆状病毒中的表达及活性

目的利用昆虫杆状病毒系统表达蛋白磷酸酶(PP)2A Cα亚基并进行活性分析。方法先将PP2A Cα构建进入昆虫杆状病毒表达载体,然后将其转染到昆虫细胞Sf9中并进行蛋白表达,最后检测PP2A Cα的功能。结果 Western印迹结果表明PP2A Cα蛋白已经在昆虫细胞成功表达;PP2A活性检测和GST pull-down实验结果表明PP2A Cα蛋白既有生物学功能,又有结构学功能。结论昆虫杆状病毒载体系统可以成功表达有活性的PP2A Cα蛋白。     

基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统的SARS-CoV-2 S1蛋白的高效表达

目的 设计、构建表达新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2) S1蛋白的重组杆状病毒,建立并优化其在昆虫细胞中的生产工艺,为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断方法的建立及疫苗开发奠定基础。方法 利用分子克隆技术将S1基因插入pFastBac^TM 1质粒,获得重组质粒pFastBac-S1,经转座获得重组杆粒rbacmid-S1,转染Sf9细胞后包装获得重组杆状病毒rBV-S1,通过rBV-S1感染High Five^TM(Hi5)细胞表达S1蛋白,使用Western blot分析鉴定S1蛋白的表达。在此基础上,建立优化rBV-S1扩增和蛋白表达的工艺,以实现S1蛋白的高效表达。结果 通过特异性引物PCR扩增重组质粒pFastBac-S1与重组杆粒rbacmid-S1,获得大小分别为2 367 bp、4 370 bp的基因片段,表明S1基因成功克隆入pFastBac^TM 1质粒与bacmid;采用Western blot分...     

人纤维介素蛋白2在昆虫杆状病毒系统中的表达及活性检测

目的:利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf9细胞)中表达人纤维介素蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶并检测其蛋白活性.方法:首先将PCR扩增的目的基因hfgl2和pENTR/D-TOPO载体连接,再将pENTR/D-TOPO-hfgl2质粒与BaculoDirectTM线性DNA进行体外基因重组,采用脂质体转染法将重组DNA转染到生长良好的Sf9细胞中进行病毒包装,经过对重组杆状病毒三轮扩增后,用RT-PCR和Western blotting从基因和蛋白水平检测hfgl2表达情况,一期凝固试验检测其蛋白活性.结果:重组杆状病毒感染后,Sf9细胞停止生长,体积变大,细胞开始悬浮,破裂,呈现颗粒样外观.RT-PCR扩增和Western blotting从基因和蛋白水平证实Sf9细胞能够表达hfgl2,蛋白分子量约为63kDa.同时,在细胞上清液中检测到了可溶性hfgl2的表达,蛋白分子量约为50kDa.一期凝固试验证明表达的跨膜型hfgl2具有凝血活性.结论:hfgl2在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达并具有生物学活性,为进一步研究hfgl2跨膜型以及可溶性蛋白功能提供了工具,亦可应用于开发重型肝炎蛋白芯片或ELISA诊断试剂盒.     

利用昆虫杆状病毒表达系统表达人KCTD9蛋白

目的应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(sf9细胞)中表达人KCTD9蛋白,以进行其功能学研究。方法从pMD18-T-hKCTD9质粒中扩增hKCTD9全长基因片段,连接至pENTR/D-TOPO载体,将pENTR/D-TOPO-hKCTD9质粒与线形杆状病毒DNA在体外重组后,转染易感细胞系昆虫sf9细胞。采用免疫共聚焦和WesternBlot法分析融合蛋白的表达;在电子显微镜下观察病毒颗粒的形成。结果凝胶电泳分析hKCTD9基因存在于各载体中;激光免疫共聚焦显微镜证实感染重组杆状病毒的sf9细胞核内可见绿色荧光,提示目的基因表达正确;WesternBlot进一步显示hKCTD9蛋白大小约为55KD;透射电子显微镜观察发现被感染的sf9细胞核涨大、透亮,核内清晰可见大量的杆状病毒颗粒。结论 hKCTD9在昆虫杆状病毒表达系统中被成功表达,为进一步功能学研究奠定了基础。     

亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因在昆虫细胞中的共表达

目的在昆虫细胞中表达亚洲1型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和疫苗奠定基础。方法从质粒pTOP-P1-2A和pTOP-3C中分别扩增出编码亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和3C蛋白酶基因,构建转移载体pDual-P1-2A-3C并与大肠杆菌(Escherichia coli)DH10Bac中的Bacmid质粒重组,构建重组转座质粒rBacmid-P1-3C。在脂质体介导下将rBacmid-P1-3C转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在Sf9昆虫细胞中共表达P1-2A和3C蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和Dot-ELISA试验鉴定重组蛋白。结果目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达蛋白与抗亚洲1型FMDV血清发生特异性反应,有良好的抗原性。结论成功在昆虫细胞中表达亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因。     

重组犬α干扰素在昆虫细胞中的高效表达与抗病毒活性鉴定北大核心CSCD

目的利用杆状病毒表达系统制备犬α干扰素(Canine interferon-α,CaIFN-α)。方法根据昆虫细胞密码子偏爱性优化CaIFN-α基因,构建含双拷贝CaIFN-α优化基因的载体pFastBacDual-CaIFNα-CaIFNα,转化DH10Bac感受态后获得重组基因组rBacmid-CaIFNα-CaIFNα,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα,接种Sf9细胞表达rCaIFN-α。采用PCR和透射电子显微镜鉴定重组杆状病毒的外源基因与病毒形态,采用间接免疫荧光染色法检测rCaIFN-α蛋白的表达,采用细胞病变抑制法测定rCaIFN-α抑制水疱性口炎病毒(VSV-GFP)在MDCK细胞的复制能力。结果重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα构建成功,rCaIFN-α在rBac-CaIFNα-CaIFNα感染的Sf9细胞中表达,其抗病毒活性为8.73×105 IU/ml。结论构建的杆状病毒表达系统能高效表达rCaIFN-α,该干扰素具有高效抗病毒活性,这为犬干扰素制剂的研究奠定了基础。     

杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体及其在医学中的应用

杆状病毒载体表达系统已被广泛用于在受纳昆虫细胞中大量表达外源蛋白。近年的研究发现 ,这种表达载体还可用来介导外源基因投送至各种哺乳动物细胞 ,并且通过哺乳动物启动子的驱动使外源蛋白得到高效稳定的表达 ,而其自身基因组并不复制和表达。同时 ,经过适当的修饰或预处理 ,杆状病毒表达载体还可介导外源基因在哺乳动物体内表达。由于这种载体的容量大 ,感染、表达效率高 ,生物安全性好 ,因而在基因治疗、疫苗开发、药物筛选等医学各领域具有广泛的应用前景。     

猪流感H1N1亚型NP基因杆状病毒表达载体构建及其在昆虫细胞中的表达

目的获得研发A型猪流感病毒ELISA检测试剂盒和制备NP蛋白单克隆抗体的抗原物质。方法根据已报道的猪流感病毒H1N1亚型NP基因序列(GenBank登录号:GQ422386)人工合成NP基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将NP基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,获得携带NP基因的重组质粒pFast-BacHTB-NP。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bac-mid-NP。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。结果通过SDS-PAGE和Westernblotting分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为57KD。结论实验结果表明已成功构建了携带NP基因的重组质粒pFastBacHTB-NP和转座的杆粒Bacmid-NP,转染后在sf9昆虫细胞上成功的表达。     

乙型肝炎病毒多聚酶基因在重组杆状病毒系统中的表达

目的利用杆状病毒一昆虫细胞表达系统制备乙型肝炎病毒多聚酶重组蛋白。方法构建含有乙型肝炎病毒多聚酶基因的杆状病毒转移载体pFastbac Dual—polymerase，转化大肠杆菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid转染昆虫细胞获得含有HBVpol基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染昆虫细胞进行蛋白表达，用SDS—PAGE电泳分析表达情况。结果将所得Bacmid行PCR鉴定，结果表明成功构建了的含乙型肝炎病毒多聚酶基因的重组杆状病毒，SDS-PAGE分析表明该病毒能在昆虫细胞中高效表达重组的多聚酶蛋白。结论利用杆状病毒表达系统，构建的重组杆状病毒在昆虫细胞中高效表达乙型肝炎病毒多聚酶，为进一步的乙型肝炎病毒多聚酶的体外功能研究奠定了基础。     

利用杆状病毒系统表达重组HBV聚合酶RT区段

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组HBV聚合酶RT区段蛋白。方法构建含有HBVP基因RT区段的杆状病毒转移载体pFastBac HT-RT，转化大肠埃希菌DH10B-ac进行重组，提取重组BacmidDNA质粒，转染昆虫细胞SD获得含有HBVP基因RT区段的重组杆状病毒。重组的杆状病毒再感染SO细胞进行HBVP基因RT区段蛋白表达，通过Western blot检测表达情况。结果成功构建了含HBVP基因RT区段的重组杆状病毒，昆虫细胞Sf9中能检测到HBVP基因RT区段蛋白的表达。结论利用杆状病毒表达系统能成功地表达HBVP基因RT区段蛋白。     

日本血吸虫翻译控制肿瘤蛋白基因的杆状病毒表达载体构建和在昆虫细胞中的表达

目的构建日本血吸虫的翻译控制肿瘤蛋白(SjTCTP)基因的杆状病毒重组供体质粒pFASTA-TCTP,用该重组转移质粒转化含有杆状病毒表达载体以构建BacmidGFP-TCTP,感染昆虫细胞进行表达。方法将已克隆的SjTCTP基因与线性化的pFASTA进行连接为pFASTA-TCTP,使pFASTA-TCTP与DH10BAC感受菌进行转座重组,利用抗性及蓝白斑筛选重组BacmidGFP-TCTP克隆,提取BacmidGFP-TCTP转染昆虫细胞Sf9获得有感染力的病毒,利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过荧光镜观察、RT-PCR、SDS-PAGE和Western-Blotting检测表达情况。结果获得了重组SjTCTP的杆状病毒,细胞能表达出与SjTCTP单抗结合的、分子量为23kDa左右的融合有组氨酸标签的目的蛋白。结论SjTCTP能在昆虫细胞中获得良好表达,为其的分子生物学活性研究奠定了基础。     

杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体及其在医学中的应用

杆状病毒载体表达系统已被广泛用于在受纳昆虫细胞中大量表达外源蛋白。近年的研究发现，这种表达载体还可用来介导外源基因投送至各种哺乳动物细胞，并且通过哺乳动物启动子的驱动使外源蛋白得到高效稳定的表达，而其自身基因组并不复制和表达。同时，经过适当的修饰或预处理，杆状病毒表达载体还可介导外源基因在哺乳动物体内表达。由于这种载体的容量大，感染、表达效率高，生物安全性好，因而在基因治疗、疫苗开发、药物筛选等医学各领域具有广泛的应用前景。     

汉滩病毒核蛋白部分片段与囊膜糖蛋白G1在昆虫细胞中的融合表达

目的　应用Bac -to -Bac杆状病毒表达系统融合表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白部分片段。方法　构建含有汉滩病毒G1S0 7嵌合基因的杆状病毒表达载体 pFBD -G1S0 7,转化DH10Bac致敏菌 ,利用其含有的细菌Tn7转座系统将嵌合基因重组至穿梭质粒Bacmid上 ,快速筛选出含有G1S0 7嵌合基因的重组杆状病毒 ,在昆虫细胞中表达该融合蛋白 ,利用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹对表达产物进行检测。结果　构建的含G1S0 7嵌合基因之重组杆状病毒可在昆虫细胞中表达出融合蛋白 ,该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1特异性单抗所识别 ,表达产物主要集中在细胞内。结论　在昆虫细胞中表达出具有生物学活性的G1S0 7融合蛋白 ,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础     

杆状病毒表达载体系统的特点及其在寄生虫学上的应用

杆状病毒载体表达系统使用一个或多个启动子 ,将外源目的基因插入到启动子下游 ,获得重组病毒 ,这种重组病毒在昆虫细胞或虫体内复制的同时 ,使外源基因得到表达。随着杆状病毒分子生物学和表达载体研究的不断深入 ,作为真核表达载体 ,该系统区别于其他表达系统的特点更为突出 ,主要表现在目的基因容量、表达效率、目的蛋白活性、可操作性、生物安全性和在寄生虫学上的应用等     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT51在原核表达载体中的克隆、表达、纯化与鉴定

目的对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT51的基因进行克隆,表达,纯化与鉴定,为核酸疫苗的研制与应用打下基础。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR法对编码MPT51蛋白的抗原基因进行扩增,产物克隆到表达载体pET22b中,构建了含mpt51的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coliXLI-Blue内提取质粒,酶切及测序鉴定,再转化入E.coliBL21(DE3)PLysS菌株内,以IPTG进行诱导后,破菌,离心,包涵体经尿素变性溶解后用His·Bind亲和层析柱纯化,透析复性,纯化后蛋白进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行特异性免疫检测。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达,所表达的蛋白质相对分子质量为27800,抗体检测有特异条带,大小为27.8kDa。结论目的基因克隆到了表达载体内并证明表达,重组结核杆菌分泌蛋白MPT51的成功表达为核酸疫苗的研制与应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

日本血吸虫SjPP基因重组杆状病毒的构建和在昆虫细胞中的表达

目的 在昆虫细胞中表达获得可溶性的日本血吸虫SjPP重组蛋白。 方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,通过RT-PCR扩增出SjPP基因的编码区序列,将其定向克隆到供体质粒pFastBac HT-B中,构建重组杆状病毒供体质粒pFastBac-SjPP,转化入大肠埃希菌DH10Bac进行转座,提取重组杆粒Bacmid-SjPP,用阳离子脂质体法转染粉纹夜蛾（TN5B1-4）细胞。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白表达情况。 结果 构建了含日本血吸虫SjPP基因的重组杆粒Bacmid-SjPP,转染TN5B1-4细胞后,获得有感染力的重组杆状病毒,并在TN5B1-4细胞中成功表达SjPP蛋白。该重组蛋白可被抗SjPP蛋白的兔血清识别。 结论 成功构建SjPP基因重组杆状病毒,并在TN5B1-4细胞中表达,该蛋白具有良好的抗原性。     

泛素样蛋白-蛋白酶体系统与结核分枝杆菌致病性的相关性研究进展

结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis, MTB)中的泛素样蛋白-蛋白酶体系统(prokaryotic ubiquitin-like protein-proteasome system, PPS),主要介导和调控MTB体内蛋白质的降解。在特定环境下,MTB中泛素样蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein, Pup)选择性标记特定的蛋白质,并在辅助因子的帮助下将靶蛋白送入蛋白酶体内降解,对MTB在宿主体内的生长、繁殖及致病性发挥重要调控作用。本文首先简单介绍了MTB中Pup、蛋白酶体的结构特点、作用及PPS降解靶蛋白的主要过程,接着重点介绍了PPS对MTB致病性的调控机制,及如何通过改变PPS作用来降低MTB致病性等一些最新进展,希望能够为寻找新型抗结核药物提供方向。     

胆管闭锁患儿肝脏组织中跨膜转运蛋白39A表达观察

目的 通过观察胆管闭锁患儿肝脏组织中跨膜转运蛋白39A(TMEM39A)的表达变化,初步探讨TMEM39A与胆管闭锁发病的关系。方法 选取胆管闭锁患儿30例纳入病例组,同期收治的先天性胆总管囊肿患儿30例纳入对照组。分别采用免疫组化法和Western blotting法检测两组患儿肝脏组织中的TMEM39A蛋白,采用RT-qPCR法检测TMEM39A mRNA。结果 免疫组化检测结果显示,TMEM39A蛋白主要分布在汇管区周围肝细胞胞质内,病例组TMEM39A蛋白相对表达量高于对照组（分别为0.695±0.137、0.375±0.096,P<0.05）;Western blotting检测结果显示,病例组TMEM39A蛋白相对表达量高于对照组（分别为0.624±0.082、0.352±0.082,P<0.05）。病例组TMEM39A mRNA相对表达量高于对照组（分别为5.724±1.490、2.338±0.984,P<0.05）。结论 胆管闭锁患儿肝脏组织中TMEM39A蛋白及mRNA呈高表达,TMEM39A异常表达可能与胆管闭锁的发病有关。     

大鼠髓样细胞表达激发受体-1／人IgG融合蛋白真核表达载体的构建表达与鉴定

目的 构建大鼠髓样细胞表达激发受体-1（TREM-1）/人IgG融合蛋白的真核表达载体,并在家蚕Bm细胞中实现稳定表达。方法 克隆大鼠TREM-1胞外段与人IgGFe段,片段连接后PCR扩增,再与病毒穿梭载体BAC1连接,基因克隆,构建重组质粒。利用杆状病毒表达系统（Bar-to-Bar）筛选重组杆状病毒,在Bm细胞中进行融合表达,并用Western blot法行蛋白鉴定。结果 重组质粒酶切测序正确,确认克隆载体构建成功。Western blot结果说明该蛋白样品可被抗大鼠TREM-1抗体特异性识别,证明该蛋白为TREM-1/IgG融合蛋白。结论 成功构建了大鼠TREM-1/IgG融合蛋白真核表达载体,并在Bm细胞中稳定表达。     

结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定

目的　对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT - 6 4基因进行克隆 ,鉴定与表达 ,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法　以结核杆菌H3 7Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对基因MPT - 6 4进行扩增 ,产物与载体质粒pGEX - 4T - 1构建表达MPT - 6 4的重组质粒 ,将此重组质粒先转化到E coliDH5α内抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主E coliBL2 1(DE3)PLysS菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS -PAGE ,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫染色 ,一抗为结核分枝杆菌菌株H37Rv羊抗阳性血清。结果　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,所表达的蛋白质相对分子质量为 5 0 0 0 0 ,抗体检测有特异带大小为 5 0kDa。结论　目的基因克隆到菌株内 ,重组结核杆菌分泌蛋白MPT - 6 4的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础