乙型脑炎病毒微滴式数字PCR检测方法的建立

目的 建立乙型脑炎病毒微滴式数字PCR (droplet digital PCR,ddPCR)检测方法.方法 根据乙型脑炎病毒基因的NS3序列设计特异性引物和TaqMan探针,用于ddPCR和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR).优化ddPCR的退火温度、引物和探针浓度后,比较ddPCR和qPCR灵敏度和重复性,并用多种虫媒病毒进行特异性验证.结果 该方法特异性良好,灵敏度可以达到16.1 copies/μL,重复性良好.结论 本研究建立的ddRT-PCR能够高度敏感地检测乙型脑炎病毒核酸,将该方法用于临床乙型脑炎病毒感染的检测,可提高检测的准确性.     

无创基因检测技术在产前诊断中的应用1

目的:探讨胎儿染色体非整倍体无创基因检测技术在产前筛查及产前诊断中的应用。方法:选择在医院行胎儿染色体非整倍体无创基因检测的单胎孕妇921例,对孕妇外周血中游离DNA进行高通量测序,对检测结果高风险者进行羊膜腔穿刺及胎儿染色体核型分析,对检测结果阴性者行电话随访。结果:921例孕妇无创基因检测结果高风险19例,包括21-三体9例,18-三体8例,13-三体2例。对19例高风险孕妇行羊膜腔穿刺羊水细胞染色体核型分析,结果显示21-三体的灵敏度100.0%,特异度100.0%,阳性预测率为100.0%,阴性预测率为100.0%;18-三体的灵敏度100.0%,特异度99.9%,阳性预测率为87.5%,阴性预测率为100.0%。结论:无创基因检测不仅无唐氏综合征年龄、孕周的限制,也无介入性产前诊断流产等的风险,是一种安全、快捷、准确的产前诊断新技术。     

乙型脑炎病毒微滴式数字 PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,用于乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的核酸检测。方法 设计特异性扩增JEV的引物探针并优化条件建立ddPCR检测方法,检测其他病毒核酸,观察有无交叉反应判断其特异性。用实时荧光定量PCR(qPCR)与ddPCR法分别对梯度稀释后JEV体外转录核酸进行检测以评价方法的敏感性;用不同浓度的病毒核酸进行独立重复实验以评价方法的重复性;用乙型脑炎IgM抗体阳性标本评价临床标本,健康人血清用于阴性验证。结果 本法检测与其他病毒核酸无交叉反应;RT-qPCR和RT-ddPCR方法对JEV的最低检出限分别为10⁰和10^-1,对应分别为6.73 copies/μL和0.75 copies/μL;各浓度检测拷贝数变异系数均在2.0%以下,检出率为100.0%;12份乙型脑炎IgM抗体阳性标本中检出7份阳性(58.3%),健康人血清的阴性率为100.0%。结论 本研究建立的RT-ddPCR检测JEV方法有较好的特异性、敏感性、重复性和临床标本适应性,可作为乙型脑炎病...     

基于微滴式数字PCR的急性早幼粒细胞白血病治疗监测相关lnc-LOC100506453检测方法的建立

目的 建立急性早幼粒细胞白血病（APL）患者治疗监测相关lnc-LOC100506453的微滴式数字PCR(ddPCR)定量检测方法,完成方法学评价,并用于APL患者的外周血检测。方法 设计和合成lnc-LOC100506453 ddPCR的引物和探针,优化ddPCR的反应体系和条件。评价所建立ddPCR的方法学性能,包括重复性、特异性、检测下限与定量检测范围。最后用于APL患者的外周血标本的检测。结果 lnc-LOC100506453 ddPCR方法的最佳退火温度为59℃,最佳引物浓度为900 nmol/L。该ddPCR方法的特异性为100%,批间和批内重复性的CV值均<10%。ddPCR方法的检测下限达到0.5 copies/μl,定量检测值为0.5 copies/μl～5 000 copies/μl。在对临床标本的ddPCR检测中,APL患者外周血lnc-LOC100506453表达量明显高于非APL患者和健康对照者（P<0.001）。APL患者诱导分化后的外周血lncLOC100506453表达量低于APL治疗前（P<0.001）,APL患者完全缓解后的表达量...     

FISH技术在产前诊断胎儿染色体数异常中的应用

目的 探讨荧光原位杂交(FISH)技术在快速产前诊断胎儿染色体非整倍体异常中的价值.方法 使用荧光原位杂交技术,选用荧光素标记的双色13/21染色体位点特异性探针和三色18/X/Y染色体着丝粒探针,检测760例胎儿羊水细胞.结果 采用双色13/21号和三色18/X/Y染色体荧光探针检测间期未培养羊水细胞,发现8例21三体综合征,1例13三体综合征,1例45,XO,1例47,XXX,3例性染色体嵌合体.荧光原位杂交检测结果 和常规细胞遗传学检测结果 相比,两者符合率为99%.结论 荧光原位杂交技术在产前快速诊断胎儿染色体非整倍体异常有很高的临床价值.     

微滴数字PCR在重症急性胰腺炎疑似血流感染病原学诊断中的应用

目的 探讨微滴数字聚合酶链反应(ddPCR)在重症急性胰腺炎(SAP)合并疑似血流感染(BSI)病原学诊断中的价值。 方法 选取2022年7—9月某院重症医学科收治的SAP患者, 在疑似BSI发作时同步采集静脉血进行ddPCR检测和血培养(BC)及药敏试验(AST), 记录两种检测方法的耗时, 比较ddPCR与BC的检测结果, 计算ddPCR的病原学诊断效能, 并探讨ddPCR检测病原菌载量值与感染指标水平的相关性。 结果 共纳入22例患者, 采集52份静脉血标本进行检测, BC阳性17份(32.7%), 检出病原体29株; ddPCR阳性41份(78.8%), 检测出病原体73株。ddPCR耗时低于BC[(0.16±0.03)d VS (5.92±1.20)d, P＜0.001]。在ddPCR检测范围内, 以BC为金标准, ddPCR检测的灵敏度和特异度分别为80.0%、28.6%;联合检测前1周内非血标本微生物证据综合判定BSI, ddPCR检测的灵敏度和特异度分别提高至91.9%、76.9%。ddPCR耐药基因检测中, 19份检出bla_KPC, 9份检出bla_NDM/IMP, 6份检出VanA/VanM, 5份检出mecA。相关性分析显示病原菌载量值与C反应蛋白、降钙素原水平呈正相关(r分别为0.347、0.414, 均P＜0.05)。 结论 ddPCR作为一种辅助BC诊断BSI的检测方法具有灵敏度高、耗时低等优势, 值得进一步探讨其在临床中的应用。     

BACs-on-Beads技术对微缺失/微重复综合征的产前诊断

传统染色体核型分析是染色体疾病诊断的“金标准”[1],但培养周期长、易培养失败,对5Mb以下的染色体缺失/重复无法正确检出。BACs on Beads(BoBs)技术是一种快速产前诊断技术,将DNA探针固定在经过荧光编码的Luminex微球表面,采用微球阵列分析同时检测5种染色体非整倍体(13、18、21、X和Y)及常见的微缺失综合征(Wolf Hirschhorn综合征、Cri du Chat综合征、Williams Beuren综合征、Langer Giedion综合征、Prader Willi/Angelman综合征、Miller Dieker综合征、Smith Magenis综合征及DiGeorge综合征),大大缩短了检测时间,提高了产前诊断效率。本文对4639份羊水进行BoBs快速检测,探讨其在检测微缺失/微重复综合征中的应用价值。     

STR在产前诊断中的应用

短串联重复序列(Short Tandem Repeat,STR)即微卫星位点，是一种广泛存在于人类基因组、以2～6个碱基为单位的串联重复排列的序列。STR具有高度多态性，可以作为一种理想的遗传标记，广泛应用于连锁图和单基因病等遗传病的相关基因定位。     

母体外周血中胎儿有核红细胞在产前诊断中的应用

目前,对胎儿染色体非整倍体及单基因疾病的产前诊断,主要通过羊膜腔穿刺或绒毛膜取样的侵入性方法获取胎儿遗传物质,运用各种细胞遗传学和分子遗传学方法进行检测。这些侵入性临床操作,对孕妊娠妇女和胎儿具有一定的风险^[1]。因此,有必要探索胎儿染色体非整倍体及单基因疾病等非侵入性诊断方法,     

微滴式数字PCR和实时荧光定量PCR对新型冠状病毒肺炎患者不同时间血便尿中核酸检测结果初步探讨

目的 分析微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的核酸检测结果,比较两种方法检测各类样本的差异性,为改进新型冠状病毒核酸检测方案提供数据支持。 方法 利用ddPCR和qPCR技术对已经确诊的3例新型冠状病毒肺炎患者发病不同时间的全血、尿液、粪便共22份标本进行新型冠状病毒核酸检测。 结果 两种方法对人保守区域基因扩增结果一致:全血标本信号最强,尿液次之,粪便最少;ddPCR在1份全血,1份尿液,5份粪便中检出ORF-1ab和N基因的阳性微滴,qPCR仅在3份粪便中检出上述基因,漏检的3个标本基因拷贝数平均浓度为128 copies/ml;ddPCR在发病<5、5~15、>15 d的各类标本中都有检出,qPCR检出以中晚期为主;重症病例用ddPCR均可测到阳性微滴,qPCR检测的各类标本均为阴性;轻症病例的各类标本中qPCR只有粪便核酸检测阳性,ddPCR检出率高于qPCR。 结论 ddPCR可以有效克服qPCR 灵敏度不足的难题,是对qPCR 的有益补充,尤其是针对病毒载量比较低的血液、尿液和可疑的粪便或肛拭子标本,适用于早期感染的判断及患者治愈后出院诊断。     

冬虫夏草微滴式数字聚合酶链式反应定量检测方法的建立及应用

目的 建立一种定量检测冬虫夏草菌的微滴式数字聚合酶链式反应（ddPCR检测方法,探讨其定量检测冬虫夏草的可行性。方法 使用冬虫夏草菌特异性引物和探针建立dd PCR检测方法,对冬虫夏草及其常见伪品进行鉴别,对其特异性和自制混伪品进行检测和评估,并采用该方法对市场流通的冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分进行检测。结果 ddPCR检测方法对冬虫夏草菌具有良好的检测特异性,且在掺伪0%～70%范围内定量检测的准确性高;此外,对冬虫夏草及其制剂市售样品的检测结果显示,该方法可用于冬虫夏草的定量检测。结论 ddPCR检测方法可成功检测市售冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分,具有市场应用价值,可为含冬虫夏草成分的保健食品和药品提供定量和鉴伪检测依据。     

一种通用型肠道病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

目的 建立一种肠道病毒通用型微滴式数字PCR（ddPCR）的定量检测方法,以实现肠道病毒的量化检测。方法 利用肠道病毒标准品对ddPCR反应中的探针浓度、退火温度进行优化,并确定ddPCR的检测范围。利用已优化好的反应条件对28份临床样本进行病毒载量检测。结果 本研究确定ddPCR的最佳探针浓度为0.4 μmol/L,退火温度为51.0 ℃,核酸检测范围为3.02~3.59×10⁶ copies/μL,检出限为3.02 copies/μL。ddPCR方法线性相关系数为0.993 8,呈良好的线性关系。结论 本研究建立基于ddPCR肠道通用型的定量方法,可有效地对临床样本中不同血清型的肠道病毒临床样本进行拷贝数定量分析,为临床研究病毒载量的测定提供一种技术。     

FISH技术在产前诊断中的应用

荧光原位杂交(FISH)是一种具有高度灵敏性和特异性的染色体和基因分析技术,目前广泛用于产前诊断各种染色体异常,不仅可以用于羊水或绒毛细胞来筛查非整倍体,同时可以用于母亲外周血分离胎儿有核红细胞及宫颈冲洗收集滋养细胞等细胞数少、不适合常规染色体分析的染色体异常的检测.FISH技术还发展到植入前遗传学诊断对单个细胞进行染色体检查选择适宜的胚胎植入官腔从而避免患儿的出生.     

FISH技术在产前诊断中的应用

荧光原位杂交(FISH)是一种具有高度灵敏性和特异性的染色体和基因分析技术,目前广泛用于产前诊断各种染色体异常,不仅可以用于羊水或绒毛细胞来筛查非整倍体同时可以用于母亲外周血分离胎儿有核红细胞及宫颈冲洗收集滋养细胞等细胞数少、不适合常规染色体分析的染色体异常的检测。FISH技术还发展到植入前遗传学诊断对单个细胞进行染色体检查选择适宜的胚胎植入宫腔从而避免患儿的出生。     

FISH技术在产前诊断中的应用

荧光原位杂交(FISH)是一种具有高度灵敏性和特异性的染色体和基因分析技术，目前广泛用于产前诊断各种染色体异常，不仅可以用于羊水或绒毛细胞来筛查非整倍体，同时可以用于母亲外周血分离胎儿有核红细胞及宫颈冲洗收集滋养细胞等细胞数少、不适合常规染色体分析的染色体异常的检测。FISH技术还发展到植入前遗传学诊断对单个细胞进行染色体检查选择适宜的胚胎植入宫腔从而避免患儿的出生。     

多重PCR在Y染色体微缺失检测中的应用

目的:建立检测Y染色体微缺失的多重PCR体系。方法:参照欧洲男科协会和欧洲分子遗传实验室质控网推荐的6个特异性序列标签(STS),并在此基础上增加9个STS,依据Y染色体上15个STS设计引物,以性别决定基因(SRY)为内参建立多重PCR体系;对无精症组、严重少精症组、精液正常组及其它组(精液参数至少一项低于参考值)进行Y染色体微缺失检测。结果:建立的15个STS多重PCR体系检测到无精子症组缺失率为5.9%,严重少精子症组缺失率为17.2%,精液正常组及其它组中未发现缺失。多重PCR检测的特异性为100%,未发现假阳性或假阴性结果。结论:多重PCR检测Y染色体微缺失具有操作简单、快捷,结果可靠、重复性好,在辅助生殖临床检测上有重要应用价值。     

无创产前基因检测在产前筛查中的应用价值

目的探讨无创产前基因检测(NIPT)在产前筛查中的临床应用价值。方法回顾性分析2016年1月-2018年12月在该院接NIPT的1 937例孕妇的临床资料,并与羊穿、脐穿染色体核型分析进行比较。结果 1 937例孕妇中检出胎儿染色体异常高风险21例,检出率为1. 08%。其中,3种主要的三体高风险(21、18和13号)分别为13例、3例和1例,另有性染色体异常4例。经核型分析比较,检测灵敏度和准确性均为100. 00%,特异度为95. 24%,仅有1例性染色体异常为假阳性。结论 NIPT诊断染色体异常不仅具有无创优势,且有较高的检出率,值得进一步探索推广。     

MLPA技术在快速检测胎儿染色体非整倍体异常中的应用

目的:探讨多重探针连接依赖式扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)在快速检测胎儿染色体非整倍体异常中的应用价值。方法:282例产前诊断标本(羊水179例、脐带血90例和绒毛13例)同时进行MLPA检测及核型分析,用计算机辅助数据分析方法得出MLPA检测结果。结果:MLPA分析在标本接收后24h内即可得出结果,共检出染色体倍体异常产前诊断标本17例,包括唐氏综合征(Down Syndrome,47,+21)7例、爱德华氏综合征(Edwards Syndrome,47,+18)5例、特纳氏综合征(Turner Syndrome,45,X)3例、帕陶氏综合征(Patau Syndrome,47,+13)1例及XYY综合征(47,XYY)1例。MLPA检测24h报告结果临床符合率为97.9%。结论:MLPA技术具有快速、准确性高、成本低等优点,可作为诊断常见染色体非整倍体异常的可靠方法。     

荧光原位杂交技术在产前诊断中的应用

染色体病在目前尚无有效治疗方法,产前诊断是防止染色体病患儿出生的有效措施.随着分子生物学技术的发展,荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术已逐渐成为解决复杂染色体异常的一种重要方法,染色体特异重复序列探针、全染色体或染色体区域特异性探针、特异性位置探针、端粒或亚端粒探针等多种FISH DNA探针的出现,提高了染色体病的检出率.FISH技术灵敏度高、特异性强、操作简便、实验周期短,在降低染色体病发病率、预防患儿出生方面发挥巨大作用,是产前诊断的重要工具.