RNA干扰沉默STAT3基因对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721的影响

肝细胞癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤之一,其发生、发展过程受诸多因素的影响.近年研究发现,信号转导和转录激活因子(STAT)具有强烈的抑制细胞凋亡,促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演变,其中以STAT3尤为活跃.本研究利用RNA干扰(RNAi)技术,用短发夹样RNA(shRNA)设计并构建RNAi-DNA质粒,筛选稳定表达小干扰RNA(siRNA)的肝癌HepG2及SMMC-7721细胞株,体外研究siRNA稳定和特异性诱导肝癌STAT3基因转录后沉默并逆转其恶性表型的能力,从而探索肝癌治疗的新方法.     

醛酮还原酶1B10基因沉默对MHCC97H细胞生长和基因表达的影响

目的 探讨醛酮还原酶1B10(AKR1B10)基因在肝癌发生和发展过程中的作用及其机制.方法 化学合成AKR1B10序列特异性小干扰RNA,用脂质体LipofectaminrTM2000介导转染人肝癌细胞系MHCC97H,设实验组转染AKR1B10-小干扰RNA,设阴性对照组转染非编码序列双链小RNA,设空白对照组不作转染.用实时定量PCR、Western blot和酶活性检测法检测AKR1B10 mRNA和蛋白的表达情况,用细胞计数试剂盒CCK-8检测转染细胞的生长增殖变化,用流式细胞仪检测膜联蛋白V/碘化丙啶双标记的凋亡细胞变化,并用实时定量PCR检测c myc、c-fos、N-ras、ki-67、caspas 3、bax肿瘤相关基因的表达变化.用析因设计的方差分析和完全随机方差分析进行组间比较,LSD法进行多重比较.结果 转染24、48 h和72 h后,AKR1B10 mRNA的相对表达量在实验组分别为0.382±0.048、0.098±0.008和0.257±0.032;阴性对照组分别为0.797±0.092、0.742±0.086和0.794+0.105;空白对照组分别为0.808±0.118、0.716±0.083和0.706±0.067.不同转染时间和不同实验组中AKR1B10 mRNA的表达比较,F值分别为11.650和566.971,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.转染24、48 h和72 h后,实验组的AKR1B10mRNA表达较空白对照组被明显抑制,抑制率分别为52.7%±5.6%、86.3%±4.4%和63.7%±6.1%,以转染48 h的抑制率最高(t=80.68,P＜0.01);阴性对照组的表达水平接近空白对照组(P＞0.05).Western blot结果显示,转染24、48 h和72 h后,实验组的AKR1B10蛋白表达水平均有下降,其中以转染72 h的降低幅度最大;阴性对照组的表达水平接近空白对照组.转染24、48、72h和96h后,实验组450nm处吸光度值分别为1.465±0.040、1.724±0.106、1.934±0.069和2.377±0.163;阴性对照组分别为1.528±0.044、2.019±0.091、2.711±0.204、3.151±0.159;空白对照组分别为1.567+0.057、2.102±0.099、2.642±0.198、3.069±0.180;不同转染时间和不同实验组间比较,F值分别为128.092、36.535,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.转染了AKR1B10-siRNA的MHCC97H细胞生长受到抑制.与空白对照组相比,实验组的细胞生长抑制率在转染48、72 h和96 h分别为18.0%±1.6%、26.1%±3.2%和22.5%±1.1%,t值分别为19.197、13.093和23.553,P值均＜0.01,差异均有统计学意义;阴性对照组的细胞生长未受到明显抑制(P＞0.05).实验组、阴性对照组和空白对照组各基因mRNA的相对表达量:c-myc基因分别为1.047±0.156、1.737±0.193和1.631±0.128;c-fos基因分别为0.041+0.003、0.082±0.006和0.081±0.004; N-ras基因分别为0.082±0.009、0.156±0.013和0.133±0.015;ki-67基因分别为0.032±0.002、0.070±0.008和0.069±0.005; caspasc-3基因分别为0.148±0.018、0.110±0.009和0.108+0.012;bax基因分别为0.780±0.092、0.629±0.058和0.617±0.073,各基因的mRNA在不同组别表达差异均有统计学意义(F值分别为104.384、400.915、211.903、427.041、67.750和37.272,P值均＜0.01).结论 AKR1B10可能通过调节肿瘤相关基因的表达水平来促进细胞增殖、抑制细胞凋亡.     

NCEH1基因在肝癌组织与细胞系中的表达及生物学作用

目的了解中性胆固醇酯水解酶1(neutral cholesterol ester hydrolase 1,NCEH1)基因在肝癌组织及人肝癌细胞系中表达水平,观察NCEH1基因敲减对SMMC-7721人肝癌细胞系增殖、凋亡、侵袭及转移能力的影响。方法选取2013年1月—2019年6月在暨南大学附属广州红十字会医院手术治疗的32例肝癌患者标本及对应的癌旁组织,采用实时荧光定量PCR方法检测NCEH1基因的相对表达量。从ICGC数据库下载截至2020年9月份的肝癌样本基因表达数据,应用R软件整理数据,筛选出每个样本中NCEH1基因表达量,分别采用配对Wilcoxon符号秩检验和Wilcoxon秩和检验分析肝癌与癌旁组织间的差异。采用实时荧光定量PCR方法检测NCEH1基因在SMMC-7721、Bel-7402、HepG2、Hep3B人肝癌细胞系和HL7702正常人肝细胞系中的表达水平。通过慢病毒介导的小干扰RNA(siRNA)技术构建NCEH1基因敲减的SMMC-7721人肝癌细胞系,分为NCEH1敲减组(KD组)和阴性对照组(NC组),以实时荧光定量PCR法检测NCEH1基因的敲减效率,再以MTT检测实验、Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测、划痕愈合实验、Transwell实验和Transwell侵袭小室实验检测2组SMMC-7721肝癌细胞的增殖、凋亡、转移和侵袭能力,采用t检验对两组间数据进行统计学分析。结果 NCEH1基因在肝癌组织中的平均表达量高于癌旁组织(本院标本Z=2263,P=0.024,ICGC数据库U=18 768,P 0.001)。NCEH1基因在中等侵袭转移潜能的SMMC-7721细胞系中的表达量最高;在低侵袭转移潜能的Bel-7402和HepG2细胞系中的表达水平次之,在无侵袭转移潜能的Hep3B细胞系中的表达水平最低。KD组SMMC-7721细胞中NCEH1基因的表达水平明显低于NC组(t=11.578,P=0.000 3),NCEH1基因的敲减效率高达740%。较之NC组,KD组细胞生长速度明显减缓(t=32.10,P 0.001);细胞凋亡率明显升高(t=27.303,P 0.001);迁移率、转移和侵袭细胞数均明显降低(t值分别为9.51、38.123、22.331,P值均0.001)。结论 NCEH1基因在肝癌组织及细胞系中的表达明显升高,且可促进肝癌细胞的生长增殖及侵袭转移并抑制凋亡,提示其可能是一个潜在的肝癌治疗靶点。     

人宫颈癌基因小干扰RNA抑制HepG2细胞生长的作用及其机制

目的 利用RNA干扰技术探讨人宫颈癌基因(HCCR)对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制. 方法 构建表达HCCR小干扰RNA的真核表达质粒pRIV2-siHCCR,将其转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量PCR、Westem blot检测HCCR及其相关基因的表达,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖状态,流式细胞术观察细胞凋亡与细胞周期变化. 结果 成功构建真核表达质粒pRIV2-siHCCR,其表达的HCCR siRNA可有效抑制HepG2细胞内HCCR的表达,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加.Western blot结果显示HCCR小干扰RNA作用HepG2细胞后,细胞内P53蛋白的表达降低,P15蛋白的表达明显升高,而PTEN、P16、P27蛋白水平没有明显改变. 结论 HepG2细胞中HCCR蛋白下调后,细胞增殖受到抑制,凋亡细胞增多,其作用机制可能与蛋白质P53、P15有关.     

微RNA 18与B细胞易位基因2在肝癌细胞中差异表达相关性的研究

目的 研究微RNA 18(miR-18)对肝癌细胞HepG2基因表达谱的影响,预测其靶基因,初步探讨miR-18与抗增殖基因B细胞易位基因2(BTG2)两者在肝癌发生过程中差异表达的相关性.方法 利用基因表达谱芯片技术筛选HepG2的微RNA差异表达谱,应用生物信息学方法预测表达明显上调的miR-18的靶基因,初步筛选出直接调控的靶基因为抗增殖基因BTG2;应用RT-PCR和Northern blot法分析BTG2正常与肝癌组织中的表达情况.结果 生物信息学分析结果显示miR-18分子调控的下游靶基因有609个,涉及细胞增殖、分化和凋亡,转录调节等众多生理和病理过程;抗增殖基因BTG2在肝癌组织和细胞中呈明显低表达.结论 miR-18在肝癌细胞中表达明显上调,并可能负性调控抗增殖基因BTG2在肝癌细胞中的表达,两者共同在肝癌细胞增殖方面发挥着重要作用.     

靶向survivin的小干扰RNA对HCCLM6细胞恶性表型的影响

目的 研究survivin基因在肝癌细胞中的表达水平及survivin小干扰RNA对高侵袭潜能人肝癌细胞HCCLM6恶性表型的影响.方法 收集4种人肝癌细胞株,以RT-PCR和Western blot检测survivin蛋白质表达,进而筛选出高表达survivin基因的肝癌细胞.构建针对survivin mRNA的干扰质粒pshRNA-survivin及阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-NC,并将其转染HCCLM6细胞.实时荧光定量PCR检测survivin mRNA表达量的变化情况;肿瘤细胞黏附实验检测细胞黏附能力的改变及Matrigel侵袭实验检测细胞侵袭力的改变. 结果 4种肝癌细胞随侵袭能力升高survivin mRNA表达水平依次升高(P＜0.05),HCCLM6细胞survivin表达水平最高;Western blot结果与RT-PCR结果一致.HCCLM6细胞转染pshRNA-survivin后,survivin mRNA表达量明显下降,抑制率达93.500%±3.117%,与转染阴性对照质粒组(8.215%±0.797%)相比,差异有统计学意义(t=70.852,P＜0.01).细胞黏附实验结果显示,survivin重组质粒转染组黏附率为11.403%±1.256%,阴性对照组为32.545%±1.367%(t=20.732,P＜0.01).Matrigel侵袭实验结果显示,与阴性对照组[(32.6±1.4)]个相比,转染pshRNA-survivin后,细胞侵袭力明显下降[(13.5±0.9)个,t=14.5,P＜0.01].结论 Survivin与肝癌侵袭转移等恶性生物学行为有关,并随侵袭转移潜能升高表达水平升高.pshRNA-survivin可以特异性抑制高侵袭肝癌细胞HCCLM6中survivin表达,并显著降低其侵袭、黏附能力,小干扰RNA技术有望成为抑制肝癌侵袭转移的新途径.     

短发夹状RNA抑制SMYD3基因在HepG2细胞中的表达

目的构建针对人SET-和MYND-结构域含有蛋白3(SMYD3)基因的短发夹状RNA (shRNA)表达载体pGenesil-1-s,观察其对人肝癌细胞株HepG2细胞SMYD3基因表达的特异性抑制效应。方法设计合成针对SMYD3 mRNA编码序列267～288、302～323靶位点之间的核苷酸片断,并定向克隆到仅表达EGFP的空载体pGenesil-1的U6启动子下,构建重组质粒pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2；不针对任何序列的重组质粒pGenesil-1-hk作为对照。通过脂质体介导转染人肝癌细胞株HepG2,应用逆转录聚合酶链反应,western blot蛋白免疫印迹法分别从mRNA、蛋白水平检测阻抑效应。结果酶切鉴定和测序结果证实了pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2、pGenesil-1-hk的成功构建,转染HepG2细胞后,pGenesil-1- s1、pGenesil-1-s2组SMYD3 mRNA和蛋白表达均明显下调,与pGenesil-1-hk组及pGenesil-1对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结论构建的重组质粒pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2能特异性抑制SMYD3 在HepG2细胞中的表达。     

PeroxiredoxinⅡ基因在肝癌组织中的表达及意义

目的观察peroxiredoxinⅡ（PrxⅡ）mRNA和蛋白在黄曲霉毒素B1（AFB1）诱发树鼩HCC形成过程中的表达变化,并在人肝癌癌旁组织和正常肝组织中进行验证,以探讨PrxⅡ在肝癌形成过程中的作用。方法应用RT-PCR和Western blot方法,检测6例AFB1诱发的树鼩肝癌、癌旁组织和这些动物肝癌发生前的活检肝组织,以及6例对照组动物相应时期的肝活检组织PrxⅡ在mRNA水平和蛋白水平的表达情况,并在18例人肝癌及其相应癌旁组织以及17名正常人肝组织进行验证。结果PrxⅡ在树鼩肝癌组织中的mRNA和蛋白质表达水平均明显高于相应的癌旁和癌前组织,也高于对照组同期活检肝组织（P〈0．05）;人肝癌组织中PrxⅡ的mRNA和蛋白表达改变和树鼩相符,即肝癌中的表达高于癌旁组织和正常肝组织（P〈0．05）。结论PrxⅡ基因可能与肝癌的发生发展有关,并有可能成为防治肝癌的分子靶标。     

microRNA在肝癌发生和发展中的作用及其机制

肝细胞肝癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤,其发生、发展是多因素、多基因和多步骤的复杂过程[1].miRNA(microRNA)是一类内源性非编码小分子RNA,可经序列特异性翻译抑制或mRNA裂解来调控基因表达,参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等,约有1/3以上基因在转录后受其调控[2].新近研究结果表明,多种miRNA通过调节其靶基因参与HCC的细胞生物程序调控,间接发挥癌基因和抑癌基因的功能[3].了解miRNA的调控机制,可为肝细胞恶性转化及HCC的诊治提供理论依据.本文综述了miRNA在肝癌发生、发展中作用与机制的研究进展.     

胰岛素样生长因子Ⅱ及其受体在肝细胞癌变中的表达及意义

目的 探讨ＩＧＦ－Ⅱ及戎受体（ＩＧＦ－ⅡＲ）在肝细胞癌孪演化过程中的作用。方法 通过ＤＮＡ、ＲＮＡ原位分子杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术,观察和分析慢性肝炎、肝硬化和肝癌中ＩＧＦ－Ⅱ、ＩＧＦ－ⅡＲ基因的单细胞转录瓣表达与ＨＢＶ ＤＮＡ整合之间的关系。结果 ＩＧＦ－Ⅱ、ＩＧＦ－ⅡＲ ｍＲＮＡ在慢性肝炎、肝硬化和肝癌中均有不同程度的表达,阳性率依次为：慢性肝炎（３３．３％）〈肝癌（６６．７％）〈肝硬化     

长片段RNA抑制HepG2.2.15细胞中HBV基因的表达和复制

目的 评估长的反义RNA干扰片段在培养细胞株中对HBV复制的抑制效应.方法将HBV基因组S区的全部核苷酸序列插入至pTARGETTM载体中,并将重组载体转染入HepG2.2.15细胞中.用酶联免疫吸附法检测HBsAg与HBeAg水平,用荧光定量PCR法检测HBVDNA水平.对数据采用多个独立样本Kruskal-Wallis检验与两两比较的Mann-Whitney U检验.结果 经过处理后,HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg表达量(A值)在HBS2组(携带长片段反义RNA)为0.621±0.027,在HBS4组(携带正义RNA)为3.399±0.018,对照组为2.232±0.187;HBeAg表达量(A值)在HBS2组、HBS4组和对照组分别为0.749±0.019、1.548±0.025和1.570±0.044; HBV DNA水平(×104拷贝/ml)在HBS2组、HBS4组、对照组分别为1.597±0.082、3.381±0.297和3.610±0.063.与对照组相比,HBS2组HBsAg、HBeAg和HBV DNA表达量均降低,统计量Z值均为-2.309,P值均＜0.05; HBS4组HBsAg表达量增高(Z=-2.309,P＜0.05),而HBeAg和HBV DNA表达量无明显差异,统计量Z值分别为-0.866、-1.155,P值均＞0.05.结论 长片段反义RNA能抑制HBV基因的表达和病毒复制.

Abstract：

Objective To evaluate the inhibitory effects of long antisense RNA on HBV replication in HepG2.2.15 cells. Methods The coding region of HBV S gene was cloned into pTARGET vector in sense and antisense orientations and the recombinant plasmids were transfected into HepG2.2.15 cells which were divided into HBS2 (antisense RNA) group, HBS4 (sense RNA) group and control group. HBsAg and HBeAg in the culture supernant were detected by ELISA. The HBV DNA in the supernant was quantified by real-time PCR. Results After treatment, the levels of HBsAg in HepG2.2.15 cell supernatants of three groups were 0.621 ± 0.027, 3.399 ± 0.018 and 2.232 ± 0.187 respectively; the levels of HBeAg were 0.749 ± 0.019,1.548 ± 0.025 and 1.570 ± 0.044 respectively and the levels of HBV DNA were 1.597 ± 0.082, 3.381 ± 0.297 and 3.610 ± 0.063 respectively. The expressions of HBsAg and HBeAg and the HBV DNA level in HBS2 group were remarkably reduced as compared to the control (Z = -2.309, P ＜ 0.05); whereas the sense plasmid transfection (HBS4) did not affect HBeAg (Z= -0.866) and HBV DNA (Z = -1.155) levels in the culture supernant but slightly increased the HBsAg level (Z = -2.309). Conclusion Antisense RNA might be a useful tool to repress HBV replication.     

KAll基因在肝硬化和肝细胞癌组织中的表达及其意义

目的研究转移抑制基因KAIl在肝硬化和肝细胞癌组织中的表达及该基因与肝细胞癌患者临床资料间的关系.方法采用Northern blot方法研究20例肝细胞癌组织、14例肝硬化组织和10例正常肝组织中KAll基因mRNA的表达水平,经mRNA的定量分析及统计处理判定KAIl基因与肝细胞癌患者临床特征的关系.结果肝硬化和肝细胞癌组织中KAll mRNA表达水平(0.113±0.110;0.139±0 078)显著低于正常肝组织中的表达(0.316±0.121),(P=0.0003;P=0.0000);肝硬化和肝细胞癌组织中KAll基因mRNA的表达无显著差异(p=0.4152);KAIlmRNA在不同分化程度的肝细胞癌组织中的表达无显著差异(P=0.8261),而Ⅲ期肝细胞癌组织中的KAll基因表达显著低于Ⅱ期的肝细胞癌组织(P=0.0221)结论转移抑制基因KAI1在肝硬化阶段亦有低表达;肝癌组织中KAI1基因的低表达与肝癌的转移有关.     

长链非编码RNA XLOC-007123在乙型肝炎相关肝细胞癌中的表达及临床意义

目的检测长链非编码RNA(lncRNA)XLOC-007123在乙型肝炎相关肝细胞癌(HCC)患者组织(癌、癌旁)及肝癌细胞系中的表达,并分析其表达水平与临床病理特征的关系。方法选取2013年12月-2015年12月于解放军三〇二医院肝胆外科行HCC切除术的52例乙型肝炎相关HCC患者的肝癌组织;同时取同一患者的癌旁组织作为对照。应用荧光实时定量PCR检测lncRNA XLOC-007123在乙型肝炎相关HCC患者癌组织、配对癌旁组织以及肝癌细胞系中的表达水平。其中研究所用细胞系L02、HuH7、HepG2、SMMC-7721均由解放军三○二医院临床管理中心提供。非参数Wilcoxon秩和检验比较lncRNA XLOC-007123在癌组织和配对癌旁组织的表达水平;独立样本t检验比较不同HCC细胞系与正常肝细胞系间lncRNA XLOC-007123表达水平。临床指标差异分析采用χ~2检验。结果与癌旁组织相比,lncRNA XLOC-007123在乙型肝炎相关HCC患者的癌组织中表达显著下调(P<0.01);与正常肝细胞株相比,IncRNA XLOC-007123在3种肝癌细胞系中均呈低表达(P值均<0.05)。lncRNA XLOC-007123表达水平与患者的血清AFP水平和肿瘤分期相关,差异有统计意义(χ2值分别为7.738、7.589,P值均<0.05)。结论 lncRNA XLOC-007123在乙型肝炎相关HCC组织中表达降低,且与临床患者血清AFP水平和病理分期有关联,推测lncRNA XLOC-007123在乙型肝炎相关HCC发生发展过程中发挥着调控作用,有望成为乙型肝炎相关HCC临床诊断的潜在标志物。     

C-met-siRNA在肝癌细胞株MHCC97-H侵袭和转移中的作用

目的探讨c—met-siRNA对肝细胞癌生长和侵袭的影响。方法采用脂质体法将pSuppressorRetro／c—met—siRNA导入包装细胞Phoenix A中获得含c-met-siRNA的逆转录病毒颗粒，进一步感染靶细胞MHCC97-H，Western blot检测c—Met的表达，通过生长曲线、运动试验及侵袭试验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力。结果肝细胞癌MHCC97-H细胞中c—Met的表达显著降低；细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制。结论c—met—siRNA能抑制肝细胞癌细胞MHCC97-H的生长、运动及侵袭，这对肝细胞癌的生长、转移具有重要的临床意义。     

Oncoprotein 18在肝癌侵袭转移过程中的作用

目的:探讨原癌蛋白18(Oncoprotein 18,Op18)在肝癌侵袭转移过程中的作用机制.方法:采用R N A干扰,抑制人肝癌细胞HCCLM3中Op18的表达,RT-PCR和Westernb l o t评价干扰效率;通过细胞粘附分析、体外Transwell分析法检测Op18表达缺失后对HCCLM3细胞粘附、运动和侵袭能力的改变;RT-PCR和免疫组织化学分别在48例未伴转移的肝癌组织和48例伴转移的肝癌组织中解析Op18表达与肝癌侵袭转移的关系.结果:RT-PCR和Western blot结果显示:在HCCLM3细胞中行RNAi后Op18表达被有效抑制,抑制率达到80%以上;Op18表达缺失后,在不同时间点(20、40和60 min)实验组细胞粘附能力(0.616±0.057、0.740±0.0713和1.001±0.083)较阴性对照组(0.944±0.068、1.196±0.115和1.441±0.053)明显下降(P<0.05);Transwell实验结果提示:经RNAi后实验组细胞运动、侵袭能力(运动:0.145±0.011,侵袭0.127±0.008)较阴性对照组(运动:0.206±0.008,侵袭:0.168±0.012)显著降低(P<0.01);分别在伴转移和未伴转移的肝癌组织中检测Op18的表达,RT-PCR(Op18与GAPDH相对比值:0.560±0.128vs 0.414±0.086)和IHC(积分吸光度值为:624.771±100.032 vs 413.786±71.833)实验结果均提示Op18在伴转移的肝癌组织中的表达更高(P<0.01).结论:Op18在肝癌的侵袭转移过程中发挥重要作用.     

沉默热休克蛋白70-2基因经线粒体依赖通路介导肝癌细胞凋亡

目的 探讨沉默热休克蛋白(HSP)70-2对肝癌细胞生长、凋亡的影响,以及诱导肝癌细胞凋亡的详细作用机制. 方法 Westem blot、免疫细胞化学法检测HSP70-2在4种肝癌细胞和正常肝细胞中的表达.设计合成针对HSP70-2基因的特异性短发夹状RNA(shRNA),构建真核表达载体HSP70-2 shRNA1和HSP70-2 shRNA2.转染肝癌细胞后,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖,膜联蛋白/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡情况,罗丹明染色检测细胞线粒体跨膜电位变化,Western blot检测多聚ADP-核糖聚合酶、caspase-3、caspase-9蛋白切割情况,以及细胞色素C、Bax,Bcl-2蛋白的表达变化. 结果 HSP70-2在4种肝癌细胞中均高表达,在L02细胞中仅有微量表达.HSP70-2 shRNA1、shRNA2均能有效抑制肝癌细胞中HSP70-2的表达.沉默HSP70-2基因显著抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,转染48 h后,shRNA1和shRNA2诱导HepG2细胞的凋亡指数分别为55.8%±1.8%和57.1%±1.6%,诱导Huh细胞凋亡指数分别为54.9%±1.1%和60.2%±2.6%,与对照组相比,差异均有统计学意义,P值均＜0.01.转染HSP70-2 shRNA 48 h后,肝癌细胞线粒体跨膜电位显著下降,细胞色素C从线粒体释放到胞质中,caspase-3、caspase-9激活,多聚ADP核糖聚合酶被剪切降解,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达明显增加.结论 沉默HsP70-2能通过激活线粒体凋亡通路导致肝癌细胞凋亡.     

微小RNA在HBx缺失突变体致肝细胞增殖中的作用及其机制

目的 研究微小RNA (miRNA)在HBx缺失突变体致人肝细胞异常增殖中的作用及其相关机制. 方法 利用miRNA芯片技术检测稳定表达HBx-d382及HBx的L02(即分别含HBx基因缺失突变体HBx-d382及野生型HBx基因)细胞系中miRNA的表达,实时荧光定量PCR对上述miRNA进行验证.选取在L02/HBx-d382和L02/HBx细胞中均表达明显下调的两个miRNA:miR-338-3P、miR-551b进行功能研究,分为实验组(转染miRNA模拟物组)、阴性对照组(NC,转染miRNA阴性对照)及脂质体组(lipo,单加转染试剂),通过脂质体转染到细胞中,四甲基偶氮唑盐法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期,实时荧光定量PCR和Wstern blot检测细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白G1和E2F转录因子的改变.采用SPSS 16.0统计软件,数据均进行了正态检验并符合正态性,组间均数比较采用成组t检验. 结果 (1)与L02/pcDNA3.0细胞比较,L02/HBx-d382细胞有6个miRNA表达上调,5个miRNA表达下调; L02/HBx细胞有4个miRNA表达上调,12个miRNA表达下调.实时荧光定量PCR验证的结果与芯片相一致.(2)转染了miR-338-31p-模拟物和miR-551b-模拟物后,L02/HBx-d382及L02/HBx细胞增殖均受抑制,细胞周期均阻滞在G1期,细胞增殖能力减弱.L02/HBx-d382细胞中,细胞增殖能力:lipo组、NC组、miR-338-3p组和miR-551b组分别为90.0％±1.3％、88.0％±1.6％、56.0％±6.1％和62.0％±6.4％,miR-338-3p组与:lipo组、NC组比较,t值分别为10.402、9.133 ;miR-551b组和与lipo组、NC组比较,t值分别为8.763、7.403,P值均＜0.01.L02/HBx细胞中,细胞增殖能力:lipo组、NC组、miR-338-3p组和miR-551b组分别为91.0％±1.7％、89.0％±2.1％、60.0％±7.7％和66.0％±9.3％,miR-338-3p组与lipo组、NC组比较,t值分别为9.105、8.074;miR-551b组与lipo组、NC组比较,t值分别为7.673、7.52,P值均＜0.01.实时荧光定量PCR检测结果显示细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白G1和E2F转录因子的mRNA水平均无明显改变,但Western blot法发现上述基因的蛋白表达均明显下调,差异有统计学意义. 结论 ①HBx及其缺失突变体能影响L02细胞的miRNA表达谱;②在L02/HBx-d382细胞中下调更明显的miR-338-3p和miR-551b可能通过调控细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白G1和E2F转录因子的表达而调节了细胞的生长.     

肝细胞癌中耐药基因的表达及意义

目的通过对肝细胞癌（HCC）中3种耐药基因MDR1、MRP、GST-π的检测,探讨肝细胞癌中耐药基因的表达特点及临床意义。方法应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测3种耐药基因在51例肝细胞癌组织和10例正常肝组织中的表达。结果 （1）MDR1、MRP、GST-π在肝细胞癌中的表达分别为0.55±0.27、0.62±0.29、0.64±0.31,正常肝组织中的表达分别为0.23±0.10、0.25±0.07、0.26±0.12,耐药基因在肝细胞癌中的表达高于正常肝组织,差异具有统计学意义（P〈0.05）;（2）耐药基因的表达与肿瘤Edmondson分级呈正相关（P〈0.05）;（3）MRP与GST-π的表达相关。结论肝细胞癌中存在有原发性耐药的现象,且多种机制并存。MDR1、MRP、GST-π在肝细胞癌中有较高的表达。联合检测对制定科学有效的治疗方案有一定价值。     

Stathmin对肝癌细胞HCCLM3增殖及其肿瘤相关基因表达的影响

目的 探讨人stathmin基因在肝癌发生、发展过程中的作用及其机制.方法 化学合成stathmin序列特异性小干扰RNA,用脂质体LipofectamineTM2000转染人肝癌细胞株HCCLM3细胞.采用RT-PCR和Western blot技术检测stathmin的RNA干扰效率;用细胞计数试剂检测干扰细胞的生长增殖情况;用膜联蛋白V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测细胞凋亡;并用荧光定量PCR检测肿瘤增殖凋亡的相关基因.均数两两比较用配对t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析.结果 RNA干扰HCCLM3细胞后,stathmin的表达被显著抑制(P＜0.05),抑制率达90%;在RNA干扰24、48 h和72 h时,HCCLM3细胞的增殖抑制率分别为13.04%±0.10%、28.10%±0.41%和37.36%±2.1 5%(F=4.21,P＜0.05); RNA干扰后,细胞凋亡比例从9.20%±0.64%上升至25.11%±1.62%(F=44.67,P＜0.01);且RNA干扰组细胞癌基因c-myc、c-fos和增殖相关基因ki-67的mRNA表达水平明显下降,促凋亡基因caspase-3、bax和p53的mRNA表达水平升高(P值均＜0.05).结论 stathmin可能通过调节肿瘤增殖相关基因的表达水平来促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,参与肝癌的发生和发展进程.