含表皮干细胞组织工程皮肤的构建研究

目的用表皮干细胞和成纤维细胞作为种子细胞研制一种增殖能力强的具有表皮、真皮的组织工程化人工复合皮肤。方法从幼儿包皮中分离表皮干细胞,用胶原Ⅳ纯化、富集表皮干细胞,接种在3T3细胞滋养层上,将体外传代培养的表皮干细胞和真皮成纤维细胞分别接种在经冷冻干燥及戊二醛交联的Ⅰ型胶原基质网架的两侧,在液面下培养3周后,改为气-液界面培养,构建含表皮干细胞的复合皮肤,并进行组织学、免疫组织化学及电镜观察。结果表皮干细胞呈克隆状生长,G0/G1期细胞和α6briCD71dim细胞百分率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),实验组K19免疫细胞化学染色呈阳性,对照组呈阴性。光镜下观察可见体外培养的含表皮干细胞的人工复合皮肤,具有表皮和真皮,表皮层由基底至浅层可见3~5层细胞,角蛋白免疫组化染色阳性。结论表皮干细胞种植于胶原海绵膜上,可生成全层组织工程皮肤,具备了同正常皮肤类似的结构,表明其具有在体外分化成表皮的能力。     

应用胶原凝胶构建组织工程化皮肤的研究

目的探讨以胶原凝胶为支架材料构建组织工程化皮肤的可行性。方法体外分离、培养人皮肤表皮细胞和成纤维细胞;利用自制的胶原蛋白制成胶原凝胶作为组织工程支架材料;在成功构建人工真皮的基础上种植表皮细胞,构建复合人工皮肤;采用HE染色与免疫组织化学的方法对复合人工皮肤进行组织学检测。结果HE染色可见,构建的复合人工皮肤具有表皮和真皮双层结构;免疫组织化学染色显示,Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白阳性,在形态结构上与正常皮肤相似。结论培养的人表皮细胞和成纤维细胞种植于胶原凝胶支架上,气-液界面培养可构建出具有类似正常皮肤结构的组织工程化皮肤。     

表皮干细胞活性复合皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损

目的用表皮干细胞和成纤维细胞作为种子细胞，研制一种增殖能力强具有表皮、真皮的组织工程化人工复合皮肤。方法从幼儿包皮中分离表皮干细胞，用胶原Ⅳ纯化、富集表皮干细胞，接种在3T3细胞滋养层上，将体外传代培养的表皮干细胞和真皮成纤维细胞分别接种在经冷冻干燥及戊二醛交联的I型胶原基质网架的两侧，在液面下培养2周后，改为气-液界面培养，构建复合皮肤，移植到裸鼠全层皮肤缺损处，以表皮细胞胶原海绵复合皮肤和无细胞接种的胶原海绵膜作为对照。术后进行大体观察，在第7、14、21天取材行组织学、免疫组织化学及电镜观察。结果用表皮干细胞构建的复合人工皮肤增殖能力强，新生的皮肤瘢痕轻，形态满意，创面愈合的速度和质量均优于对照组。结论在胶原海绵上用表皮干细胞构建的复合人工皮肤增殖能力强，较好地解决了种子细胞的老化问题，可望成为一种较为理想的皮肤替代物。     

小鼠皮肤表皮和真皮细胞共移植诱导毛囊再生实验研究

目的探讨绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的C57小鼠皮肤表皮和真皮细胞共移植诱导裸鼠毛囊重建的实验研究。方法取C57-GFP新生及成年小鼠分离表皮与真皮,分别制备成年小鼠原代真皮-表皮混合细胞(按1∶1比例混合)、成年小鼠原代真皮细胞、新生小鼠第3代真皮细胞,荧光显微镜观察细胞激发绿色荧光情况,免疫细胞化学检测培养的新生小鼠第3代真皮细胞毛囊干细胞标志。取Balb/c裸鼠,分别将成年小鼠原代真皮-表皮混合细胞(A组)、成年小鼠原代真皮细胞(B组)、新生小鼠第3代真皮细胞(C组)及生理盐水(D组)移植至裸鼠皮下,术后4、5、6周行大体观察,6周时取移植部位皮肤行GFP免疫组织化学染色观察各组毛囊形成情况。结果荧光显微镜观察示,分离、培养的C57-GFP新生及成年小鼠表皮及真皮细胞均能激发绿色荧光;免疫细胞化学检测培养的第3代真皮细胞中毛囊干细胞标志,显示波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白强阳性,表明细胞多为真皮鞘细胞;部分细胞表达毛乳头细胞标志CD133、多能聚糖及毛囊隆突部标志角蛋白15。裸鼠皮下移植实验:大体观察示A组可见接种部位皮下呈灰黑色,但未见毛发穿出皮肤表面;B、C、D组裸鼠皮肤均无着色。免疫组织化学染色示,A组形成新的、完整的毛囊结构或参与形成毛囊;B组GFP阳性细胞多表达于毛囊真皮鞘、外根鞘;C组GFP阳性细胞主要分布于毛囊真皮鞘、外根鞘、毛乳头,在汗腺中也有表达;D组GFP染色呈阴性。结论小鼠皮肤的表皮和真皮细胞在裸鼠体内相互作用可形成完整的毛囊结构,而仅移植新鲜分离或培养的真皮细胞则主要参与毛囊形成,无法形成完整的毛囊结构。     

应用胶原凝胶构建组织工程化皮肤的研究

目的探讨以胶原凝胶为支架材料构建组织工程化皮肤的可行性。方法体外分离、培养人皮肤表皮细胞和成纤维细胞；利用自制的胶原蛋白制成胶原凝胶作为组织工程支架材料；在成功构建人工真皮的基础上种植表皮细胞，构建复合人工皮肤；采用HE染色与免疫组织化学的方法对复合人工皮肤进行组织学检测。结果HE染色可见，构建的复合人工皮肤具有表皮和真皮双层结构；免疫组织化学染色显示，Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白阳性，在形态结构上与正常皮肤相似。结论培养的人表皮细胞和成纤维细胞种植于胶原凝胶支架上，气一液界面培养可构建出具有类似正常皮肤结构的组织工程化皮肤。     

毛囊单位促进组织工程皮肤形成的体外实验研究

目的 通过插入分离的毛囊单位,构建带有皮肤附属器的组织工程皮肤,探讨毛囊对组织工程皮肤形成的作用.方法 将头皮分离成毛囊单位,插入由Ⅰ型鼠尾胶原、成纤维细胞和角质形成细胞构建的组织工程皮肤模型中,浸没培养1周,气-液界面培养3周.通过镜下观察、HE染色和免疫组化检测组织工程皮肤和毛囊的生长状态.结果 相对于悬浮培养的毛囊,实验组毛囊体外生长期延长,结构更完整.HE染色显示,实验组组织工程皮肤可见毛囊和皮脂腺存在.免疫组化染色显示,带有毛囊的组织工程皮肤中可见反映基底膜完整性的Laminin和Ⅳ型胶原呈线状连续分布于表皮、真皮连接处;而反应表皮成熟度的CK4和CK10/13则呈阳性分布于基底上层非角化细胞.结论 复合毛囊单位可以促进组织工程皮肤表皮组织的分化和成熟.本方法为组织工程皮肤的构建和毛囊的体外培养提供了新的思路和方法.     

TGF-β各亚型与其受体在猪皮肤及毛囊中的表达

目的：探讨转化生长因子-β的两种异构体（TGF—β1和β2）及其受体（TGF—ORII）在黑毛白皮小香猪皮肤及毛囊中的表达特征。方法：用免疫组化方法确定TGF-D亚型及其受体在黑毛白皮小香猪皮肤及毛囊中的定位和表达量的变化规律。结果：TGF-β蛋白颗粒主要分布于表皮角质形成细胞、生长后期及退行期的毛囊外根鞘和内根鞘细胞,在皮下脂肪细胞中亦有弱阳性表达。TGF—β2的蛋白颗粒在表皮角质形成细胞有阳性表达,在真皮乳头层大部分成纤维细胞和血管内皮细胞中均有强阳性表达。在毛囊的退行期,毛囊外根鞘细胞、毛隆突细胞和结缔组织鞘成纤维细胞中有阳性表达。TGF-β R Ⅱ主要存在于表皮角质形成细胞,在毛囊结缔组织鞘中部分成纤维细胞和外根鞘细胞中有阳性表达,特别是在退行期早期的毛乳头基质细胞、外根鞘细胞中有强阳性表达,在退行中晚期的外根鞘部分细胞中有阳性表达,但明显减弱。TGF-β1、TGF—β2和TGF—β R Ⅱ在猪皮肤中蛋白表达量分别为17．0±2．5,24．2±3．1,13．2±2．9。结论：TGF—D的异构体及其受体主要表达于毛囊生长期晚期和退行期早期,可能在毛囊从生长期向退行期转化的过程中起重要的作用。     

复合型组织工程皮肤的体外快速构建

目的寻找一种体外快速构建复合型组织工程皮肤的方法,为大面积烧伤、创伤创面的覆盖提供足够的自体皮源。方法取人的包皮,进行表皮细胞及成纤维细胞的分离鉴定及体外培养扩增,对表皮细胞群行广谱角蛋白抗体-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）、角蛋白19（cytokeratin19,K19）-FITC免疫荧光染色及K19流式细胞仪鉴定;对成纤维细胞行波形蛋白-FITC免疫荧光鉴定。将表皮细胞接种于异体脱细胞真皮（acellular dermalmatrix,ADM）乳头面,于气-液平面培养构建表皮层,实验分两组进行,实验组培养基中添加25ng/ml角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）,对照组不添加。6d后,接种成纤维细胞于两组ADM的另一面,继续培养24h。收集构建的组织工程皮肤,切片行苏木素-伊红染色,观察所构建皮肤的镜下结构,并对比添加KGF对其影响。结果免疫荧光染色培养扩增的表皮细胞群广谱角蛋白抗体-FITC染色均为阳性、K19-FITC染色部分阳性,流式细胞仪鉴定其中K19阳性表达的细胞接近17%。成纤维细胞体外培养7d可扩增超过100倍,波形蛋白-FITC免疫荧光染色呈阳性。经过7d的体外培养构建,可以得到复合型皮肤,经苏木素-伊红染色镜下观察显示,实验组表皮层连续,形成细胞层数2-3层的复层结构,真皮中含有成纤维细胞;对照组表皮层不连续,细胞层数少,两组比较差异有统计学意义（P〈0.01）。结论利用胶原酶结合胰蛋白酶消化法进行种子细胞的分离,应用添加KGF的条件培养基,采用分步接种构建的方法,可在7d内构建出复合型组织工程皮肤。     

以活性复合真皮基质为载体构建组织工程皮肤的研究

目的 构建含活性真皮基质的组织工程皮肤. 方法将人成纤维细胞(Fb)与Ⅰ型牛胶原混合接种于猪脱细胞真皮基质(PADM)的表面,构建活性真皮替代物.其上接种人表皮细胞进行气-液面培养,获得组织工程皮肤,进行组织学观察. 结果 Fb在胶原内结构完整,与PADM形成复合真皮基质.所构建的组织工程皮肤表皮层结构与人正常皮肤相似,具备基底层、棘层、颗粒层和角质层,细胞之间有桥粒连接,细胞分化良好. 结论 Fb-胶原-PADM真皮替代物可作为较好的构建组织工程皮肤的真皮支架.     

组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的 探索由人表皮干细胞、成纤维细胞与纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性. 方法 将人全层皮肤采用胰蛋白酶消化法使表皮干细胞和真皮成纤维细胞分离后,分别在无血清培养基中行原代及传代培养.将体外扩增培养至第3、4代的表皮干细胞(5×104/mL)和真皮成纤维细胞(1×104/mL)共0.5 mL与纤维蛋白支架(0.5 mL)混合凝固构建组织工程皮肤.取4～5周龄雄性裸鼠45只,体重19.5～20.3 g,平均20.0 g,制备背部全层皮肤缺损模型.随机分为5组,每组9只,分别为空白对照组(C组),创面仅覆盖凡士林油纱,自然愈合;单纯支架组(F组),创面移植无细胞的纤维蛋白支架;表皮支架组(S组),创面移植含有表皮干细胞的纤维蛋白支架复合物;成纤维细胞支架组(Fb组),创面移植含有成纤维细胞的纤维蛋白支架复合物;组织工程皮肤组(T组),创面移植组织工程皮肤.术前及术后1、3、6、8周行全身及移植部位大体观察;移植后3、6、8周,取材行组织学、免疫组织化学及扫描电镜观察. 结果 细胞培养4周后,表皮干细胞培养皿内可见圆形细胞,在加有BrdU的培养液中培养6 d后可见BrdU染色阳性细胞;成纤维细胞培养皿内可见梭形细胞.构建的组织工程皮肤可见CK19免疫荧光染色阳性细胞、Nestin染色阳性细胞.移植后T组新生皮肤较其余各组生长快、瘢痕轻.术后6周,C、F、S、Fb及T组皮肤厚度分别为(0.460 ±0.049)、(0.480 ±0.055)、(0.540 ±0.043)、(0.510 ±0.032)及(0.60 ±0.047)mm,T组明显厚于其余各组,且差异有统计学意义(P＜0.05).术后3、6、8周,HE染色及扫描电镜示,T组新生表皮层数及真皮成纤维细胞、血管数量均多于其余各组,且T组真皮血管及胶原纤维排列均较其余各组整齐;术后3周,Ⅳ型胶原免疫组织化学染色显示,T组已形成连续的染色带,而其余各组均不连续;术后6周,CK14免疫组织化学染色显示,T组可见阳性细胞,其余各组均未见. 结论 用表皮干细胞、成纤维细胞及纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤移植后能使创面迅速愈合,可望成为一种较理想的组织工程皮肤.     

毛乳头细胞诱导毛囊形成的研究

目的 探讨培养的毛乳头细胞在体内外条件下诱导毛囊形成的可能性。方法 采用酶消化法获得毛乳头细胞、真皮鞘细胞、毛囊上、下段及球部细胞，进行毛囊组织工程重建，或用游离细胞混合移植于棵鼠，组织学观察毛囊形成情况。结果 毛囊间表皮细胞、毛囊上段上皮细胞、下段上皮细胞和球部细胞在间质细胞凝胶上均可形成双层结构的组织工程皮肤，在真皮鞘细胞胶原凝胶上毛囊的上、下段上皮细胞形成了毛囊结构，移植于棵鼠后8周毛乳头细胞胶原凝胶诱导毛囊上、下段细胞形成了毛囊。低代毛乳头细胞与毛囊上皮细胞混合移植形成了数量较多、结构典型的毛囊，并有肉眼可见的毛发纤维产生。结论 毛囊的真皮成分细胞即毛乳头细胞、真皮鞘细胞在体内、外均具有诱导毛囊形成的能力，通过与毛囊上皮细胞之间的相互作用，可诱导毛囊形成。     

人毛囊外根鞘细胞的分离及培养

目的 建立毛囊外根鞘细胞的分离和培养方法.方法 利用中性蛋白酶分离得到单个毛囊,采用组织块法和消化法进行细胞培养,倒置显微镜、扫描及透射电镜观察细胞形态,培养各代细胞做生长曲线,RT-PCR检测干细胞相对特异性标识分子K15和细胞分化标识分子外皮蛋白的mRNA表达情况.结果 组织块法和消化法均能培养出毛囊外根鞘细胞,并可传代培养,组织块法细胞生长慢,不易汇合,消化法细胞增殖快.各代细胞中K15和外皮蛋白mRNA均有表达.结论 消化法适合毛囊外根鞘细胞的体外培养,该方法的建立为进一步分离纯化培养毛囊干细胞奠定了基础.     

大鼠毛囊细胞构建组织工程全层皮肤

目的:以大鼠毛囊细胞为种子细胞培养组织工程皮肤。方法:分离培养新生SD大鼠毛囊外根鞘细胞和真皮鞘细胞,以这两种细胞为种子细胞构建全层组织工程全层皮肤。结果:成功构建了具有表皮层和真皮层的组织工程皮肤。结论:毛囊细胞可以用作种子细胞来构建组织工程全层皮肤。     

角蛋白在头皮中的分布及其在干细胞研究中的意义

目的：研究不同类型角蛋白（Cytokeratin，CK）在头皮及毛囊结构中表达分布情况。方法：将头皮病理切片和游离培养的毛囊使用不同类型角蛋白抗体进行免疫组化染色，检测角蛋白的分布情况。结果：CK15主要分布在毛囊隆突部，部分毛囊外根鞘最外层也有一定的表达；CK19主要分布在汗腺、毛囊外根鞘最外层和皮肤的基底层；CK16在表皮层和毛囊外根鞘均有阳性表达；CK10主要分布在头皮表皮的基底上层和皮脂腺腺泡的最外层。结论：不同类型角蛋白在头皮和毛囊结构中具有明显差异性，CK19和CK15阳性表达细胞可能具有干细胞特性。     

游离毛囊体外培养模型构建及形态学检查的实验研究

目的：构建游离毛囊体外培养模型，观察离体培养人头皮毛囊形态变化。方法：在Williams E无血清培养基中，建立离体人头皮毛囊培养模型；通过倒置显微镜观察毛囊的形态变化；目镜测微器测量毛囊长度；3H-TdR掺入检测毛囊DNA合成率；组织学检测用冰冻切片光镜观察和电镜切片透射电镜观察。结果：毛囊有不同程度的生长，随时间后移形态结构由清晰逐渐变为模糊；冰冻切片HE染色后在光学显微镜下可清楚分辨出毛囊的结构；培养3天毛囊的内外根鞘中可见凋亡细胞，内皮根鞘较外皮根鞘明显多见。结论：在离体培养人头皮毛囊时，Williams E无血清培养基是合适的选择，该模型也是筛选促进或抑制毛发生长药物的良好模型；离体培养毛囊组织学检测用冰冻切片可以简化步骤；透射电镜可以用来观察离体培养的毛囊的形态和超微结构的变化，也可以用来协助观察细胞凋亡的状况。目镜测微器测量毛囊长度简单可行，辅以3H—TdR掺入则更为客观。     

男性雄激素源性脱发患者毛囊干细胞增殖和凋亡的初步研究

目的:了解男性雄激素源性脱发(androgenetic alopecia,AGA)患者毛囊干细胞增殖和凋亡情况.方法:对来自15例男性AGA患者和3例正常人的头皮,采用双重免疫荧光的的方法检测毛囊干细胞增殖和凋亡.结果:CK15标记的毛囊干细胞中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)阳性细胞率由高到低依次为:正常对照组、患者枕部、脱发过渡区和脱发区,除脱发过渡区与脱发区间比较无显著性差异(P＞0.05)外,其它各组间比较,均有显著性差异(P＜0.05).各组毛囊中CK15阳性的细胞中均无TUNEL阳性细胞,TUNEL阳性细胞主要分布于内毛根鞘,总的TUNEL阳性细胞率在各组间无明显差异(P均＞0.05).结论:毛囊干细胞增殖活性下降可能参与男性AGA的脱发过程.     

氟对游离毛囊凋亡影响的实验研究

目的观察离体培养条件下氟对人头皮毛囊各部位凋亡的影响及硒对氟影响的拮抗作用。方法构建人头皮游离毛囊培养模型,在模型中,加入不同浓度的氟化钠和亚硒酸钠,筛选浓度后,分为不同组;制作冰冻切片,利用TUNEL法原位检测各组毛囊不同位置的凋亡数量并做统计分析;用透射电镜进行观察照相。结果原位凋亡染色发现,1mmol/L和10mmol/L的氟化钠能使游离培养5d的人头皮毛囊中外根鞘、真皮鞘和毛乳头,及毛球下部的凋亡细胞显著增多,0.01mmol/L的亚硒酸钠能拮抗1mmol/L氟化钠对外根鞘、毛球部的促凋亡作用(P<0.05)。结论不同浓度的氟化钠对游离培养的第5天的人头皮毛囊的凋亡具有不同作用,一定浓度的氟化钠能促进游离毛囊一定部位的细胞凋亡。0.01mmol/L的亚硒酸钠对一定浓度的氟化钠的促凋亡作用具有拮抗性。     

胎儿头皮毛囊内黑素细胞HMB-45和NKI/beteb的表达

目的：观察黑素细胞在胎儿头皮内的定位。方法：获取胎儿头皮（胎龄7月,畸形引产,死亡2h）,制备冰冻切片,分别用HMB-45和NKI/beteb抗体进行免疫荧光染色和免疫组化染色,激光共聚焦显微镜和倒置显微镜观察摄片。结果：NKI/beteb阳性细胞主要位于胎儿头皮的毛囊外根鞘隆突区,也见于毛球处、表皮基底部。HMB-45阳性细胞主要存在于毛球部、毛母质和表皮基底部,外根鞘区表达则阴性。结论：胎儿头皮毛囊内存在不同状态的黑素细胞,位于毛囊外根鞘隆突区的黑素细胞是黑素母细胞。