表皮细胞、成纤维细胞、毛囊同时移植修复全层皮肤缺损的实验研究

我们利用组织工程技术，在修复全层皮肤缺损时，除移植自体表皮细胞与成纤维细胞外，同时移植自体毛囊，在组织工程化皮肤中增加毛囊成分，使其与正常皮肤更加接近。     

毛囊干细胞表皮膜片修复裸鼠皮肤缺损的实验研究

目的开发新的组织工程表皮替代物,利用毛囊干细胞-壳聚糖明胶膜片(Chitosan-gelatin membrane,CGM)进行修复裸鼠皮肤缺损的实验研究。方法将体外扩增培养的毛囊干细胞接种于CGM,构建组织工程表皮膜片,裸鼠背部作直径1cm的全层皮肤缺损,将毛囊干细胞-CGM复合物覆盖创面。回植后1周、4周和12周分别进行组织学和免疫组织化学检测。结果毛囊干细胞在CGM上生长良好。毛囊干细胞-CGM修复裸鼠后1周切片示创面有新生上皮覆盖,表皮分化良好,而对照组残留较大未愈创面。修复后4周和12周可见对照组收缩较实验组显著。结论体外构建的毛囊干细胞-CGM可以修复裸鼠皮肤缺损。     

毛囊单位促进组织工程皮肤形成的体外实验研究

目的 通过插入分离的毛囊单位,构建带有皮肤附属器的组织工程皮肤,探讨毛囊对组织工程皮肤形成的作用.方法 将头皮分离成毛囊单位,插入由Ⅰ型鼠尾胶原、成纤维细胞和角质形成细胞构建的组织工程皮肤模型中,浸没培养1周,气-液界面培养3周.通过镜下观察、HE染色和免疫组化检测组织工程皮肤和毛囊的生长状态.结果 相对于悬浮培养的毛囊,实验组毛囊体外生长期延长,结构更完整.HE染色显示,实验组组织工程皮肤可见毛囊和皮脂腺存在.免疫组化染色显示,带有毛囊的组织工程皮肤中可见反映基底膜完整性的Laminin和Ⅳ型胶原呈线状连续分布于表皮、真皮连接处;而反应表皮成熟度的CK4和CK10/13则呈阳性分布于基底上层非角化细胞.结论 复合毛囊单位可以促进组织工程皮肤表皮组织的分化和成熟.本方法为组织工程皮肤的构建和毛囊的体外培养提供了新的思路和方法.     

大鼠毛囊细胞构建组织工程全层皮肤

目的:以大鼠毛囊细胞为种子细胞培养组织工程皮肤。方法:分离培养新生SD大鼠毛囊外根鞘细胞和真皮鞘细胞,以这两种细胞为种子细胞构建全层组织工程全层皮肤。结果:成功构建了具有表皮层和真皮层的组织工程皮肤。结论:毛囊细胞可以用作种子细胞来构建组织工程全层皮肤。     

利用胎儿表皮干细胞构建组织工程皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损创面

DMEM培养基、角质形成细胞无血清培养基、重组人表皮生长因子、霍乱毒素、dispase酶（美国Gibco公司），小鼠Ⅳ型胶原、L-谷氨酰胺、纤维蛋白、牛胰岛索（美国Sigma公司）．角蛋白14单克隆抗体、角蛋白19、整合素B，（美国ADI公司），重组人成纤维细胞生长因子2（FGF2，珠海亿胜生物制药有限公司）．凝血酶（奥地利Immuno AG公司），聚乙醇酸（PGA，日本Synthecon公司，[第一段]     

自体组织工程化全层皮肤缺损修复实验研究

目的 为制成含表皮细胞与成纤维细胞的双层皮肤替代物，直接用于修复全层皮肤缺损。方法 选用长枫杂交仔猪10只，酶消化法获取皮肤表皮细胞与成纤维细胞，将原代培养处于对数生长期的表皮细胞、成纤维细胞分别与30％氧化异丙烯F－127混匀成细胞悬液后，种植聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA)形成细胞－生物材料复合物，用于修复自体动物背部直径4cm全层皮肤缺损，以单纯生物材料（PGA＋氧化异丙烯）充填的创面作为对照组。修复术后1，2，4，8周取材，通过组织学和基底膜特殊染色等方法对新生组织进行评价。结果 第1周新生组织即出现表皮与真皮2层结构，特殊染色观察到连续的基底膜。第2周表皮与真皮均较前增厚。修复后第8周组织工程化皮肤的形态结构均与正常皮肤相似。对照组则无皮肤形成，仅见大量肉芽组织。结论 应用组织工程技术，以PGA 氧化层丙烯为表皮细胞、成纤维细胞载体构建的组织工程化皮肤可修复全层皮肤缺损。     

角质细胞与成纤维细胞混合移植修复裸鼠全层皮肤缺损的初步报告

目的：利用组织工程原理探讨修复全层皮肤缺损的理想方式。方法：以裸鼠为动物模型,在皮肤全层缺损区域分别移植纤维蛋白胶(n=10),纤维蛋白胶角质细胞悬液（n=10）,纤维蛋白胶成纤维细胞悬液（n=10）以及纤维蛋白胶角质细胞成纤维细胞悬液（n=10）,术后每天对伤口进行大体观察,第5,7,10,14,21,35d,分别取材活检行组织学及免疫组织化学检查。结果：移植有角质细胞组（2和4组）的创面愈合快,术后10d组织学提示创面完全上皮化,抗人特异性HLA－1型抗原、抗involucrin染色和抗Ⅶ型胶原染色阳性证明新生上皮由移植的人角质细胞形成,抗involucrin染色阳性又证明角质细胞分化成熟有角质层形成,抗Laminin染色、抗Ⅶ型胶原染色阳性提示早期基底膜形成。组织学检查提示第4组新生上皮有许多类似皮钉样结构。结论：培养的角质细胞,成纤维细胞结合纤维蛋白胶移植到创面上后,可以形成复层分化良好、接近正常结构和功能的新生成肤组织。     

毛囊再生机制及干细胞诱导毛囊再生的研究进展

治疗脱发的手段主要有药物治疗与手术植发等,而这些治疗方案并不能使已完全微小化的毳毛毛囊得以再生.近年来,干细胞治疗的兴起为毛囊的再生提供了理论基础,通过查阅相关文献,总结归纳毛囊与毛发的基本结构和特性、如何调节毛囊生长、如何影响毛囊周期的转化,对干细胞治疗脱发类疾病的研究有重要意义.现综述如下.     

不同冻存-解冻法处理小鼠皮肤组织对毛囊干细胞生长的影响

目的 观察皮肤组织经不同冻存-解冻法处理后,分离的毛囊干细胞的生长状况,寻找较好的组织冻存方案,为解决无法短期收集足量标本而不能有效获取毛囊干细胞的问题提供实验方法参考.方法 获取大鼠有两撮触须的上唇,经不同方法处理后,分离毛囊隆突部细胞.设立对照组:新鲜标本;实验组1:未加冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组2:4℃保存24 h;实验组3:1.4 moL/L.乙二醇作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组4:1.4 mol/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组5:1.4 tool/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存3个月;实验组6:0.7 mol/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;冻存各组降温速率为0.5℃/min.其中3～6组分别采用单用培养基漂洗快速复苏法和蔗糖+培养基漂洗快速复苏法做对比.比较经以上6种方法处理后分离的毛囊隆突部细胞的活力和贴壁、增殖情况.结果 经冻存+单用培养基漂洗快速复苏法,4℃处理组获得的平均细胞活力为90.38%±4.62%,明显高于其他处理组(P值均＜0.05),仅次于对照组94.00%±5.64%.1.4moL/L DMSO作为冻存保护剂无论冻存24h或3个月均可取得较高的细胞活力(56.00%±3.91%和47.25%±3.55%),明显高于其他处理组(P值均＜0.05).组3～组6经单用培养基漂洗快速复苏法和蔗糖+培养基漂洗快速复苏法复苏所得平均细胞活力分别是25.63%±2.32%和27.25%±2.56%、56.00%±3.51%和54.88%±4.03%、47.25%±3.01%和44.00%±2.98%、27.88%±2.20%和26.75%±2.26%,差异均不显著(P值均＞0.05).各组毛囊干细胞生物学特性(贴壁、增殖等能力)与细胞活力呈相关趋势.结论 皮肤组织在4℃条件短期内可保持原代培养细胞的活力;皮肤组织以1.4 M DMSO为冻存剂-70℃条件下保存可较长时间保持细胞活力,较适合小鼠皮肤组织的保存,为毛囊干细胞的进一步研究提供技术支持.     

皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用

本实验采用新西兰家兔背部中厚皮片，通过组织培养获得成纤维细胞。成纤维细胞经传代培养８天时，发现标本中有不透光的骨小结节形成。培养３７天时，发现一些小结节扩大、延伸，形成骨小梁样结构；也有骨小片状结构形成。经四环素活体标记后，这些结节在蓝紫光荧光显微镜下显示金黄色荧光，表明它们是新生骨组织。该结构的钙盐染色、胶原染色也都呈阳性，充分反映骨结构中的钙及胶原成分，以及皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用     

显微分离培养与免疫磁珠法分离纯化人毛囊干细胞

目的 探讨从人毛囊隆突区细胞(bulge cells,BCs)获取高纯度有活性的人毛囊干细胞(hair folliclestem cells,HFscs)的方法及条件. 方法 取自愿捐献的成人头皮标本,显微分离培养获得BCs,应用免疫磁珠纯化BCs中CD200阳性的HFSCs.苔盼蓝染色比较纯化前后细胞活性;流式细胞仪检测细胞纯化效率;免疫荧光检测纯化前后细胞CD200的表达情况. 结果 显微分离培养获得的人毛囊BCs,培养6 d后细胞生长融合,呈铺路石样.所得细胞角蛋白19组织化学染色阳性.CD200免疫磁珠分选法纯化细胞后,苔盼蓝染色显示纯化前细胞活力为95.0%±0.6%,纯化后为94.2%±1.0%,差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞仪及免疫荧光检测显示纯化前CD200阳性细胞的纯度为8.31%,纯化后CD200阳性细胞纯度为82.31%,纯化后CD200阳性细胞回收率为65.39%. 结论 联用显微分离培养与免疫磁珠法,可获得高纯度HFSCs,且细胞活性不受影响.     

毛囊干细胞参与创面修复及相关的信号转导通路

目的对毛囊干细胞（hair follicle stem cell，FSC）参与创面修复过程及相关信号转导通路的研究进展进行综述。方法广泛查阅近年国内外相关文献，对FSC定位、细胞表面标记物、与创面修复的关系及相关信号转导通路研究进展进行回顾总结与分析。结果FSC在维持毛囊循环和创面修复中具有重要作用。已知参与调控这一过程的信号转导通路有Wnt、骨形成蛋白／转化生长因子β．Notch、Shh和成纤维细胞生长因子等。结论FSC在创面修复等再生医学中有广阔的应用前景，有关其增殖分化调控的研究将成为创面修复及组织工程等领域内新的研究热点。     

毛乳头细胞诱导毛囊形成的研究

目的 探讨培养的毛乳头细胞在体内外条件下诱导毛囊形成的可能性。方法 采用酶消化法获得毛乳头细胞、真皮鞘细胞、毛囊上、下段及球部细胞，进行毛囊组织工程重建，或用游离细胞混合移植于棵鼠，组织学观察毛囊形成情况。结果 毛囊间表皮细胞、毛囊上段上皮细胞、下段上皮细胞和球部细胞在间质细胞凝胶上均可形成双层结构的组织工程皮肤，在真皮鞘细胞胶原凝胶上毛囊的上、下段上皮细胞形成了毛囊结构，移植于棵鼠后8周毛乳头细胞胶原凝胶诱导毛囊上、下段细胞形成了毛囊。低代毛乳头细胞与毛囊上皮细胞混合移植形成了数量较多、结构典型的毛囊，并有肉眼可见的毛发纤维产生。结论 毛囊的真皮成分细胞即毛乳头细胞、真皮鞘细胞在体内、外均具有诱导毛囊形成的能力，通过与毛囊上皮细胞之间的相互作用，可诱导毛囊形成。     

骨髓间充质干细胞分化为皮肤附属器细胞的初步实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)分化为创面皮肤附属器细胞的可能性,及其参与创面修复的可能机制。方法无菌条件下取Wistar大鼠股骨骨髓细胞,密度梯度离心分离、纯化MSCs,体外培养扩增后,用BrdU标记细胞。另于同种雄性Wistar大鼠背部正中,制备1cm×1cm全厚皮肤缺损创面模型,将BrdU标记的1×106/mlMSCs从阴茎静脉输注,术后第3天与第7天切取创面组织,行BrdU免疫组织化学单染色,以及BrdU和广谱角蛋白免疫组织化学双染色。结果BrdU阳性细胞出现在创面皮下组织、皮脂腺、毛囊和骨髓腔中。免疫组织化学双染色结果显示,皮脂腺和毛囊有BrdU阳性细胞,同时表达广谱角蛋白。结论创面愈合过程中,MSCs归巢并参与创面修复;在实验性全身皮肤缺损创面微环境下,MSCs可分化为皮肤附属器细胞。     

成体干细胞与干细胞疾病

目的 结合文献对成体干细胞的特性进行总结，描述干细胞疾病的定义及特性。方法 广泛查阅近期相关文献，回顾成体干细胞及干细胞疾病。结果 成体干细胞是一类位于成熟组织器官内、维持正常组织细胞数量和功能的原始细胞，具有自我更新和多潜能分化能力，随着生物个体生命周期增长，成体干细胞出现老化。起源于干细胞的疾病可视为干细胞疾病。当成体干细胞自我更新能力增强和／或分化障碍时，细胞增殖能力变强，引起增生性疾病特别是肿瘤疾病。当成体干细胞自我更新减弱，提前老化或分化不全时，可导致功能细胞形成减少，如不能满足组织器官功能的需要，将导致相应器官功能衰竭，形成退行性疾病。结论 对成体干细胞自我更新、分化及老化的研究，在理论上将指导干细胞疾病的研究，并有助于发展干细胞疾病的诊断及治疗方法。     

成年山羊皮肤干细胞体外克隆与诱导分化

目的 探索山羊皮肤干细胞的分离方法与培养体系，为进一步研究皮肤干细胞增殖分化的分子机制订下基础。方法 从成年关中奶山羊耳尖获取皮肤，用组织块培养法分离皮肤干细胞，碱性磷酸酶(ALP)染色及体外分化实验鉴定，用条件培养基与细胞因子相结合行皮肤干细胞的体外诱导分化。结果 山羊耳尖皮肤分离得到类干细胞集落并传5代，细胞集落具有典型鸟巢状结构，ALP染色阳性，体外分化能形成类胚体。在细胞因子(IGF—1)及条件培养基的诱导下，所分离获取的皮肤干细胞能分化形成类毛囊，类星形胶质细胞及类成骨细胞。结论 用组织块培养法可以获得多能性皮肤干细胞；在体外培养条件下不仅能进行定向分化，还能进行横向分化。     

胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究

目的探讨兔胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)和兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)体外分离培养、增殖,对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只,采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只,采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志(CD44、CD105、CD34、CD40L)进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d,每条材料接种(1.0~1.5)×106个细胞,苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察,两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强,细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,细胞体外培养10代后,生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105,不表达CD34、CD40L。复合培养5d,PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长,大量黏附,细胞积聚成团,相互连接成网状,孔隙内也可见细胞生长和增殖,并分泌基质。扫描电镜观察:复合培养3d,可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附,呈梭形或多角形;8d两种细胞均已大量增长,呈层状排列,细胞连接紧密,分泌大量基质,细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性,可作为组织工程的另一成体干细胞来源。     

皮肤组织工程

目的 综述近阶段皮肤组织工程研究领域中的进展。方法 广泛查阅国内外近期在皮肤组织工程研究的文献,着重阐述表皮替代物,真皮替代物,培养的表皮真皮复合皮片的研究进展和重要问题。结果 多数学者认为理想的皮肤替代物应及时重建已人的表皮和真皮结构。目前的研究主要集中在如何尽早移植表皮细胞,并保护移植后细胞的活性和功能,以及研制能更有效地促进细胞功能,诱导创床血植入,移植后可降解,无毒性,无病原携带风险的细胞     

组织工程皮肤种子细胞的同期快速分离

目的 寻找一种快速可行的同期分离组织工程皮肤种子细胞——表皮细胞及成纤维细胞的方法。方法 取手术切除包皮，利用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶消化法，同期分离表皮细胞及成纤维细胞，观察细胞形态。对表皮细胞及表皮干细胞行PAN—FITC、K19-FITC荧光免疫染色及K19流式细胞仪鉴定；对成纤维细胞行波形蛋白FITC免疫荧光鉴定。并分别对两种细胞培养7d，观察其生长情况。结果 应用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶，在3h内快速分离得到表皮细胞及成纤维细胞，免疫荧光染色表皮细胞PAN—FITC染色均为阳性、K19-FITC染色部分阳性，流式细胞仪鉴定其K19阳性表达的细胞接近17％。表皮细胞培养48h开始呈克隆样增长，至7d生长停滞，向终末的角细胞分化。成纤维细胞体外培养7d可扩增100倍，波形蛋白FITC免疫荧光染色呈阳性。结论 利用胶原酶结合胰蛋白酶消化法可在3h内同期分离到用于构建复合型组织工程皮肤的种子细胞，为复合组织工程皮肤的快速构建提供了可能。     

成肌分化因子和5-氮杂胞苷联合诱导骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在体外定向分化为骨骼肌细胞的干预条件。方法取健康4周龄Wistar大鼠MSCs制成细胞悬液接种于培养瓶中，置于37C、5％CO2恒温培养箱中培养，倒置相差显微镜下观察，细胞布满瓶底即为1代，取第3代MSCs，以5-氮杂胞苷10μmol／L、成肌分化因子0．1ng／ml、转化生长因子β1 0.1ng／ml、胰岛素样生长因子12ng／ml进行联合诱导，使之分化。诱导后第9天，收集细胞，行MTT比色法、流式细胞仪和免疫组织化学检测鉴定细胞。结果原代培养的MSCs呈贴壁生长，3～5d呈集落样生长，5～7d后有体积不等的多突成纤维细胞、较大的扁平多角形细胞、中等的多角形细胞和较小的三角形细胞。培养12d后，细胞融合，铺满瓶底，MSCs形态变化不明显。联合诱导后，部分细胞死亡，生长缓慢；7d后见细胞明显增殖，体积逐渐增大，呈椭圆形、梭形或不规则形状；14d后，大量增殖的长梭形细胞开始增多；18～22d后，肌管数量增多，体积增大，核数亦明显增多，初生肌管与长梭形成肌细胞呈平行排列，间隔分布。MSCs免疫组织化学法测定CD44反应阳性，胞质呈棕褐颗粒，核周明显，CD34呈阴性反应；诱导后MSCs结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为阳性表达。流式细胞仪测定MSCs和诱导后MSCs大部分处于G0／G1期，分别占79．4％、62．9％，而G2／S／M期仅占20．6％、36．1％。根据MTT绘制生长曲线，可见MSCs生长速度明显高于诱导后的MSCs。两种细胞并未达到平台期，都有继续增殖的趋势。结论在体外，MyoD、5-氮杂胞苷可以诱导MSCs向骨骼肌细胞定向分化，并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达；定向诱导后MSCs增殖期比例大，向骨骼肌细胞分化纯度更高。