人YPEL4基因的原核表达及兔血清多克隆抗体的制备与鉴定

目的通过PCR技术扩增，将YPEIA基因亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体，经酶切及测序鉴定后，转化E．coli BL21大肠杆菌，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy—β—D—thiogalactoside，IPTG）诱导融合蛋白表达。融合蛋白在细菌裂解液的包涵体和上清中都有较高的表达，故取其上清液用谷胱甘肽琼脂糖珠（Glutathione SepharoseTM4B）亲和纯化目的蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，进行WesternBlot检测抗体及其效价。结果获得了高效价的特异性兔抗YPEIA多克隆抗体，为YPEL4基因进一步的功能研究奠定了基础。     

肝癌相关抗原Kinectin的多克隆抗体制备、鉴定及初步应用

目的制备本课题组报告的肝癌相关抗原Kinectin的多克隆抗体,并鉴定其免疫学特性。方法以本课题组前期构建的人MBP-Kinectin融合片段重组质粒为基础,原核表达和亲和层析大量纯化MBP-Kinectin融合蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;用间接ELISA法测定抗体效价,用Western blot鉴定抗体的特异性。同时用Kinectin多克隆抗体检测Kinectin在正常成人肝细胞HL-7702和人肝癌细胞株SMMC-7721内的表达。结果通过免疫新西兰兔获得抗Kinectin抗体,ELISA测定纯化的Kinectin抗体效价最高为1∶12 800,Western blot结果显示Kinectin抗体具有较好的特异性。免疫细胞化学和western blot检测发现Kinectin蛋白在肝癌细胞株内的表达显著高于正常成人肝细胞株。结论制备的抗Kinectin抗体具有较高的效价和特异性,能满足Western blot和免疫细胞化学检测Kinectin蛋白的要求,为进一步深入研究Kinectin在肝癌发生发展中的作用奠定基础。     

DNA修复基因OGG1融合蛋白表达及多克隆抗体的制备

目的 表达及纯化8羟基脱氧鸟苷DNA糖苷酶-1(OGG1)融合蛋白制备多克隆抗体.方法 在大肠杆菌BL21中诱导表达OGG1融合蛋白,应用Ni-NTA亲和树脂进行纯化.纯化后的OGG1融合蛋白多次免疫大耳白兔,应用Westernb1otting的方法检测抗体活性,间接酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测抗体效价.结果 ...     

兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备兔抗人羧酸酯酶1(CES1)多克隆抗体(pAb), 并对抗体进行特性鉴定.方法: 以人正常肝cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CES1(即CES1-GST)和pET-32a-CES1(即CES1-His).CES1-GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb, 辛酸-硫酸铵法纯化抗体, 采用Western blot和免疫组化鉴定抗体的特异性.结果: CES1-GST和CES1-His融合蛋白均在大肠杆菌中以包涵体形式大量表达.兔抗人CES1 pAb效价为1∶ 64 000.Western blot鉴定表明, 该抗体可识别重组人CES1蛋白, 也可特异地识别人肝微粒体中的CES1亚基.免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性识别正常肝组织中的CES1蛋白.结论: 成功地制备了兔抗人CES1 pAb, 该抗体可应用于ELISA、 Western blot、免疫组化等实验, 为进一步研究CES1的功能提供了特异性检测工具.     

抗人胃癌相关蛋白GCRG224多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的: 制备胃癌相关蛋白GCRG224的多克隆抗体.方法: 在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,并以所获蛋白免疫新西兰白兔,制备抗GCRG224的多克隆抗体.ELISA、 Western blot法鉴定抗体的效价及特异性.免疫组化染色观察GCRG224在胃癌和正常组织中的表达.结果: 在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约为16 800的Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品.制备了抗GCRG224多克隆抗体.ELISA法检测抗体的效价达到1∶256 000,Western blot证实该抗体可与原核表达的GCRG224蛋白特异性结合.免疫组化染色显示GCRG224在胃癌组织中的表达明显强于正常胃黏膜组织.结论: GCRG224多克隆抗体的成功制备,为进一步深入研究GCRG224的生物学功能及其在胃癌发生发展中的作用奠定了基础.     

小鼠抗人Myosin Va多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备Myosin Va多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具.方法:PCR扩增编码人Myosin Va C末端(MyoVaCT)278个氨基酸的cDNA片段,DNA重组入原核表达质粒pET28a,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基β-D硫代半糖苷(IPTG)诱导表达His-MyoVaCT融合蛋白.经电泳纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗血清.通过ELISA和免疫荧光法鉴定血清特异抗体效价和特异性.结果:成功构建了pET28a/MyoVaCT原核表达载体,转化BL21后可高效表达融合蛋白His-MyoVaCT,纯化蛋白免疫小鼠后产生的Myosin Va多抗可特异检测细胞内源性Myosin Va的表达及定位情况,同时能特异识别细胞内外源表达的Myosin Va分子.结论:获得了效价和特异性都良好的Myosin Va抗体,适合应用于Myosin Va的检测.     

DnaJ类分子伴侣PBP基因的原核表达及兔抗PBP抗体的制备

目的:在原核系统中表达DnaJ类分子伴侣感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)基因,并制备兔抗PBP的抗体鉴定其特性。方法:应用RTPCR从人胎脑组织总RNA中扩增PBPcDNA。测序后将其克隆到表达载体pET28a中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达。表达产物经NiNTA亲和层析柱纯化后,用SDSPAGE进行鉴定。以所获纯化的PBP免疫新西兰白兔,制备兔抗PBP抗体。抗体的效价及特异性用Westernblot进行测定和分析。结果:扩增和克隆出了720bp的PBP基因。构建的重组质粒pET28aPBP在大肠杆菌中得到高表达,诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清中,纯化的PBP经SDSPAGE鉴定呈单一条带。以纯化的PBP免疫兔,制备了兔抗PBP抗体。Westernblot鉴定证实,该抗体可与原核表达的PBP特异性结合,抗体效价为1∶1600。结论:在原核细胞中表达了具有生物学活性的PBP,并以其为免疫原制备了兔抗PBP的抗体,为进一步研究PBP的结构与生物学活性奠定了基础。     

人UNC5CL原核蛋白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建UNC5CL基因的原核表达载体,纯化GST-UNC5CL融合蛋白,并以其为抗原免疫家兔,制备抗人UNC5CL多克隆抗体,并鉴定其反应性和特异性。方法:用PCR方法扩增UNC5CL基因(表达其280-518位氨基酸)片段并克隆至pGEX-4T-2原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21诱导融合蛋白GST-UNC5CL(aa 280-518)表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化,免疫家兔制备抗血清,再采用ELISA、Western blot和免疫组化的方法检测抗体的效价及特异性。结果:测序证实原核重组质粒构建成功;经IPTG诱导,可表达Mr为52 000的GST-UNC5CL(aa280-518)的融合蛋白;谷胱甘肽亲和层析柱纯化的融合蛋白免疫家兔制备的抗血清经Western blot和免疫组化检测证实可识别目的蛋白。结论:制备了兔抗人UNC5CL的多克隆抗体,且抗体对内源性UNC5CL具有较好的反应性和特异性,为进一步研究UNC5CL的功能奠定了基础。     

FILIP-1L 蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的： 表达、纯化GST-FILIP-1L融合蛋白,制备FILIP-1L多克隆抗体。方法：pGEX-4T3-FILIP-1L重组质粒转化E-coliBL21大肠杆菌,IPTG诱导GST-FILIP-1L融合蛋白表达,Glutathion Sepharse 4B纯化GST-FILIP-1L融合蛋白。将纯化的GST-FILIP-1L融合蛋白免疫新西兰大耳白兔,制备FILIP-1L多克隆抗体,用ELISA方法检测多克隆抗体效价,Western blot检测多克隆抗体与FILIP-1L蛋白、细胞转染FILIP-1L蛋白及细胞FILIP-1L蛋白的结合能力。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的FILIP-1L融合蛋白,经Glutathion Sepharse 4B纯化后免疫新西兰大耳白兔,获得了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,亲和层析获得纯度较高的多克隆抗体,WB检测显示多克隆抗体能够与FILIP-1L蛋白、293细胞转染FILIP-1L蛋白及肝癌细胞FILIP-1L蛋白结合。结论：成功表达、纯化了GST-FILIP-1L融合蛋白,制备了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,为研究FILIP-1L蛋白生物学功能提供了有用的实验工具。     

抗大肠杆菌curli菌毛CsgA蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的 为进一步研究curli菌毛主要蛋白csgA的功能,利用MBP-CsgA融合蛋白免疫兔子制备抗体.方法 用PCR方法扩增大肠杆菌MHCA4100株的csgA基因,在大肠杆菌中表达MBP-CsgA融合蛋白,免疫家兔以制备抗血清,用Western blotting和免疫电镜鉴定抗MBP-CsgA融合蛋白抗体的特异性.结果 PCR扩增出约476 bp的esgA基因,在大肠杆菌XL1-Blue 中成功地表达了Mr约为58 000的MBP-CsgAm融合蛋白,Western blotting和免疫电镜检测证明,针对MBP-CsgA融合蛋白的抗血清,不仅可特异性地识别MBP-CsgA,也可识别源于大肠杆菌的esgA蛋白,抗血清的最高滴度达1:50 000.结论 亚克隆csgA 基因,成功表达MBP-CsgA融合蛋白,制备并获得其特异性抗curli菌毛抗体.     

兔抗胃癌相关蛋白GCRG213抗体的制备及鉴定

目的 :制备胃癌相关蛋白GCRG2 13的多克隆抗体。方法 :在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG2 13融合蛋白 ,并以所获蛋白免疫新西兰白兔 ,制备兔抗GCRG2 13的抗体。抗体的效价及特异性 ,分别用ELISA、Westernblot法鉴定。结果 :在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量 (Mr)约为 2 940 0的Thiore doxin/GCRG2 13融合蛋白 ,经凝胶回收法得到纯度近 10 0 %的蛋白产品。制备了兔抗GCRG2 13的抗体。ELISA法检测抗体的效价达到 1∶2 560 0 0 ,Westernblot证实该抗体可与原核表达的GCRG2 13蛋白特异性结合。结论 :兔抗GCRG2 13抗体的成功制备 ,为进一步深入研究GCRG2 13的生物学功能及其在胃癌发生发展中的作用奠定了基础     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

Notch信号途径效应分子HES1的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的 原核表达HES1分子，并制备其特异性多克隆抗体，以研究该分子在肿瘤细胞中的表达情况。方法 诱导表达GST-HES1融合蛋白和GST，经谷胱甘肽-Sepharose4B亲和纯化后，用GST偶联预激活的Sepharose4B，以GST-HES1为免疫原制备兔抗血清，得到的抗血清经GST-Sepha-rose4B吸收抗GST成分，以间接ELISA和Western blot鉴定抗本特异性，以Western blot分析胃癌，结肠癌及其相应非癌变组织中HES1的表达水平。结果 成功地表达并纯化了GST-HES1融合蛋白，制备的抗HES1多克隆抗体具有很高的特异性，与GST或大肠杆菌成分无交叉反应，用于进行天然HES1分子的Wistern blot检测时效果良好，初步检测发现，胃癌和结肠癌中HES1的表达水平明显高于相应的正常组织。结论 通过原核表达并纯化HES1，成功地制备了该分子的特异性多克隆抗体，初步应用效果满意。     

PCGF1蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的:原核表达人表观抑制因子Polycomb家族成员PCGF1蛋白片段,并制备其鼠源单克隆抗体(mAb)。方法:应用PCR技术扩增人PCGF1基因编码区部分序列(CDS区第382～567bp的DNA片段)并插入到pET-32a(+)质粒中,在大肠杆菌BL21中进行His-PCGF1-128/189融合蛋白(简写为His-N128/189)的原核表达。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和层析纯化。用所获得的纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,分别通过ELISA和Western blot法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定mAb的Ig亚类。取1株杂交瘤细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore公司的mAb纯化试剂盒纯化mAb,用Western blot法检测mAb的效价。结果:表达纯化了重组人His-N128/189蛋白;筛选出2株可稳定分泌特异性抗人PCGF1 mAb的杂交瘤细胞株,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得高效价(1∶6000)、高特异性的鼠抗人PCGF1 mAb。结论:原核表达的PCGF1片段融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应mAb可特异识别内源性和外源性PCGF1蛋白,可以运用于PCGF1基因功能的研究。     

人MAGE-1基因的克隆、原核表达及其抗体的制备

目的 获得MAGF-1蛋白，制备其多克隆抗体。方法 采用RT-PCR方法从人肝细胞癌HepG2中克隆MAGE-1基因，构建其原核表达质粒，并进行原核表达与蛋白分离纯化。免疫动物，制备MAGE-1的抗血清。经固化GST蛋白的Sephamse 4B交叉吸收后，采用琼脂双扩实验和ELISA方法检测其效价和特异性。结果 所得MAGE-1 cDNA序列与GeneBank中公布的一致。构建了MAGE-1194-309 aa片段的原核表达质粒pGEX-MAGE-1，经诱导及分离纯化，得到-M1约42000的融合蛋白。免疫动物，分离血清，经交叉吸收后，琼脂双扩及ELISA实验结果显示多克隆抗体能够与MAGE-1蛋白特异性结合。结论本研究成功地获得MAGE-1蛋白，制备的抗MAGE-1多克隆抗体，经交叉吸收后能够特异性地与MAGE-1蛋白结合，为研究MAGE-1在肿瘤诊断和免疫治疗中的应用提供了实验条件。     

兔抗人细胞色素P450 1A2多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人细胞色素P4501A2（CYP1A2）抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列，根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列，合成CYP1A2多肽，与载体蛋白钥孔戚血蓝素（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联，免疫日本大耳白兔制备抗CYP1A2抗体。辛酸-硫酸铵法纯化抗体，间接ELISA法测定抗体的效价及相对亲和力常数，Western blot鉴定其特异性，免疫组化进行定位。结果：获得针对小分子CYP1A2的抗体。该抗体效价为1∶16000；相对亲和力常数在10^5-10^6/M，具有实用价值；可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应；可识别正常人肝脏组织CYP1A2；Western blot的结果显示，该抗体识别的相应抗原的相对分子质量为58000。结论：合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP1A2合成肽抗体可应用于酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫组化实验。     

人心肌肌钙蛋白I的原核表达及其兔抗体的制备

目的:构建人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,并制备兔抗hcTnI抗体。方法:以化学方法合成hcTnI基因并插入融合表达载体pET21a( )的多克隆位点,构建重组表达质粒pET21a( )hcTnI。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,筛选阳性重组子,经IPTG诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Westernblot进行鉴定。以表达的hcTnI蛋白免疫家兔,制备抗hcTnI的抗体并进行纯化及特性鉴定。结果:成功地合成hcTnI基因,测序证实序列正确后亚克隆于表达载体pET21a( )中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,序列分析表明其中的插入序列与cTnI基因完全一致。在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为24000的目的蛋白,约占菌体总蛋白的28%,Westernblot分析显示,表达的hcTnI蛋白具有良好的免疫反应性。以纯化的hcTnI免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价为3×10-4,且具有良好的特异性。结论:成功地构建hcTnI基因的原核表达载体pET21a( )hcTnI,并在大肠杆菌中获得高效表达。制备出兔抗hcTnI的抗体,且效价及特异性均较良好,为进一步建立酶联免疫吸附法检测hcTnI奠定了基础。     

Administration of neutralizing antibody against rabbit IL-1 receptor antagonist exacerbates lipopolysaccharide-induced arthritis in rabbits

Endogenous IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) may down-regulate part of IL-1 actions. We examined the participation of endogenous IL-1ra in the production of IL-1 in vitro. Macrophages cultured on adherent IgG produced a 100-fold molar excess of IL-1ra, compared with IL-1. In the presence of a neutralizing monoclonal antibody (mAb) against rabbit IL-1ra, the production of antigenic IL-1 increased by 20–60%. Since the molar ratio of IL-1ra over IL-1 was 160- to 400-fold in synovial fluid (SF) of lipopolysaccharide (LPS)-induced arthritis, we examined the functional role of endogenous IL-1ra in the regulation of inflammatory responses. When measured in the presence of anti-IL-1ra mAb, masked IL-1 activity in SF became evident, with a 3- to 4-fold increment. The administration of anti-IL-1ra mAb with LPS into rabbit knee joints increased the IL-1 activity 4-fold and the production of antigenic IL-1 by 30–50%. The treatment also enhanced by 20–40% LPS-induced leukocyte infiltration and protein leakage. Therefore, endogenous IL-1ra apparently acts as a down-regulating factor for limiting delecterious effects of IL-1 by masking the biological activity and by inhibiting the production.accepted by M. Katori     

兔抗mLAIR-1胞外区抗体的制备、纯化和鉴定

目的:表达并纯化小鼠白细胞相关免疫球蛋白样受体-1(mLAIR-1)胞膜外区与人IgGFc段的融合蛋白,制备兔抗mLAIR-1胞膜外区的抗体。方法:构建真核表达载体,表达并纯化mLAIR-1-Fc融合蛋白。以mLAIR-1-Fc融合蛋白免疫家兔,用偶联mLAIR-1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化多克隆抗体。用间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定多克隆抗体的特异性。结果:表达并纯化了mLAIR-1-hIgFc融合蛋白。以其免疫家兔,用亲和层析的方法纯化得到兔抗mLAIR-1胞膜外区的抗体,能与转染细胞和细胞表面天然mLAIR-1分子结合。结论:成功地构建了mLAIR-1胞膜外区基因的真核表达载体,表达并纯化了mLAIR-1-Fc融合蛋白。用偶联mLAIR-1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化的兔抗mLAIR-1胞外区抗体,具有高特异性和高效价,为进一步研究mLAIR-1分子的结构和功能提供了新的手段。