静脉移植骨髓间充质干细胞联合重组人生长激素对充血性心肌病大鼠心肌和血管组织的修复**☆

背景：骨髓间充质干细胞静脉移植后,能否归巢至心脏受损部位和分化为心肌样细胞尚无统一定论。 目的：探讨重组人生长激素联合骨髓间充质干细胞静脉移植对充血性心肌病大鼠心肌和血管新生的影响。 方法：密度梯度离心和贴壁筛选法获得大鼠骨髓间充质干细胞。模型组、细胞移植组、生长激素组、联合组大鼠均在阿霉素诱导下建立心脏衰竭模型。造模后,细胞移植组经静脉注入BrdU标记的骨髓间充质干细胞8×1013 L-1;生长激素组皮下注射重组人生长激素2 U/(kg•d),连续14 d;联合组行骨髓间充质干细胞移植与重组人生长激素注射。4周后取材,BrdU+MHC及BrdU+Actin免疫组化染色确定骨髓间充质干细胞的归巢情况,评价移植细胞向心肌样细胞和血管内皮细胞的分化,苏木精-伊红染色检测血管密度。 结果与结论：与细胞移植组比较,联合组BrdU免疫组化阳性率显著升高(P < 0.001);BrdU+MHC双染和BrdU+Actin双染后心肌样细胞、血管内皮细胞均显著增多(P < 0.001)。与模型组比较,生长激素组、细胞移植组、联合组的总血管密度、微血管密度、毛细血管密度均显著升高(P < 0.001),后3组间比较无明显差异(P > 0.05)。结果证实骨髓间充质干细胞静脉移植后可归巢到心脏,对充血性心肌病大鼠心肌和血管有明显修复作用,能在损伤处区存活、生长,并向心肌样细胞、血管内皮细胞方向分化,增加损伤处血管密度;生长激素可以改善微环境,加强骨髓间充质干细胞向心肌样细胞、血管内皮细胞的转化率。     

自体骨髓间充质干细胞心肌移植后的分化及存活*☆

背景：骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后是否能迁移、分化及存活,目前尚不清楚。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后,在体内的迁移、分化及其存活。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,体外DAPI标记细胞。结扎兔左前降支制作急性心肌梗死模型,造模成功后30只新西兰大耳兔抽签法分为骨髓间充质干细胞组和对照组,每组15只。骨髓间充质干细胞组于冠状动脉结扎后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射自体骨髓间充质干细胞。对照组于相同部位注射等量生理盐水。每点注射体积30 μL。分别于移植后10 min,3 d,4周时各组各处死5只动物。取心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记骨髓间充质干细胞的分布情况;免疫荧光法检测标记细胞是否表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ和α-肌动蛋白。 结果与结论：DAPI标记的骨髓间充质干细胞在兔急性心肌梗死模型心脏微环境中,蓝色细胞核分布广泛,呈椭圆形,似心肌细胞核,其排列方向与宿主心肌纤维方向一致,间接免疫荧光法检测胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白均为阳性。说明缺血心肌内移植入骨髓间充质干细胞,可在局部微环境的刺激下向心肌细胞定向分化。     

骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬心肌内分化及对心肌细胞凋亡的影响

背景：体内移植骨髓间充质干细胞对实验动物的心肌梗死和心力衰竭有较好的改善作用，但具体机制尚不清楚。 目的：观察骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬梗死区的分化以及对心肌细胞凋亡的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-03/2007-12在美国Texas Heart Institute干细胞研究室进行骨髓间充质干细胞移植，在第三军医大学完成免疫组织化学染色。 材料：成年杂种犬，平均体质量25~35 kg。 方法：采用密度梯度离心法提取犬骨髓间充质干细胞，移植前以BrdU标记骨髓间充质干细胞。采用外科手术于近端冠状动脉左前降支植入布洛芬缩肌装置并结扎相连分支的方法制作犬心肌梗死模型。造模后分为实验组与对照组，实验组于损伤缺血部位注射同种异体骨髓间充质干细胞。对照组注射等量生理盐水。 主要观察指标：对移植BrdU标记的骨髓间充质干细胞的心肌梗死犬心肌梗死区组织细胞进行免疫组织化学染色，同时采用DeadEndTM Colorimetric TUNEL System对心梗标本进行凋亡细胞的染色观察。 结果： 注射骨髓间充质干细胞的心脏组织切片BrdU免疫组织化学染色可见大量细胞核呈现深褐色或黑色的阳性反应，在心脏组织的不同区域表现出不同的形态特征，其中大多数植入心肌细胞间的骨髓间充质干细胞，形态上与心肌细胞无异，而其他区域的骨髓间充质干细胞则与间质细胞较相似，无特定的形状。骨髓间充质干细胞移植组心肌梗死区凋亡的心肌细胞数少于未移植组。 结论：骨髓间充质干细胞心肌内移植后可在心肌梗死区分化成心肌细胞，并减轻犬心肌梗死后的细胞凋亡。     

同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植：急性心肌梗死后血管新生及相关细胞因子的变化*☆

背景：骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植,但存在迁移缺少靶向性,价格高昂等局限性。 目的：观察同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植兔急性心肌梗死后梗死区血管新生及相关细胞因子的变化。 方法：提取兔骨髓进行骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化、扩增、鉴定,并标记。将55只兔随机分为正常组与手术组。手术组急性心肌梗死后1周,再随机分为3组：穴位注射干细胞组、模型对照组、穴位注射生理盐水组。5周后,取心肌组织进行免疫组织化学BrdU染色、心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测;免疫组织化学法检测梗死心肌组织血小板内皮细胞黏附因子1水平;免疫组织化学法、夹心酶联免疫法、RT-PCR法、Western-Blot法检测血管内皮细胞生长因子及免疫组织化学法检测碱性成纤维细胞生长因子。 结果与结论：穴位注射的骨髓间充质干细胞可迁移至梗死区,并可以在梗死区分化为心肌样细胞。与模型对照组及穴位注射生理盐水组比较,穴位注射骨髓间充质干细胞可使梗死区及周围组织血小板内皮细胞黏附因子1表达上调,诱导梗死区及周围组织血管新生,其机制是刺激心肌组织中碱性成纤维细胞生长因子表达上调。穴位注射骨髓间充质干细胞组梗死心肌组织中和血清中血管内皮细胞生长因子表达均无上调趋势,因此推测,血管新生由碱性成纤维细胞生长因子及未知因素诱导。     

不同方法移植骨髓间充质干细胞在体内重要器官的分布及分化

背景：大量实验显示心肌损伤后,趋化或直接心肌内注射的骨髓干细胞可以在体内分化为心肌细胞、血管内皮细胞或血管平滑肌细胞。 目的：观察不同方法移植的骨髓间充质干细胞体内重要器官的分布、生长和分化情况。 方法：选用3月龄日本大耳白兔39只,均制作急性心肌梗死动物模型并随机分为4组,3个组为实验组分别以心肌内直接注射、经冠脉注射、经静脉注射3种不同移植经BrdU标记的自体骨髓间充质干细胞。对照组分为3个亚组,分别经冠脉、静脉和心肌内直接注射等量的生理盐水。4周后处死动物,取心、肺、肝、肾制作组织切片并观察BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞。 结果与结论：①骨髓间充质干细胞移植各实验组在梗死区及其周边均可见到BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞。BrdU阳性细胞间及与宿主心肌细胞间有细胞突起相连,并可见明显的横纹和肌小节。②各实验组新生毛细血管密度较对照组都有增加(P < 0.05),其效果顺序由好到差依次为冠脉注射组、心肌注射组和静脉注射组。③经冠脉和静脉移植组非目的器官肺、肝、肾的标本切片内均发现BrdU阳性细胞表达,且静脉移植组肺内BrdU阳性细胞数多于肝、肾,但均未见有分化趋势和恶性细胞表达。结果提示骨髓间充质干细胞经3种方法移植均能使心肌梗死区及其周边区心肌细胞和毛细血管再生,除心肌注射组外非目的器官都有BrdU阳性细胞表达,但仍以目的器官表达为主。     

80005同种异体骨髓间充质干细胞单独及联合生长因子移植对缺血心肌心功能的影响

背景：骨髓间充质干细胞拥有多向分化的潜能，生长因子在细胞的移行，存活以及分化中具有重要作用。 目的：观察肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子联合干细胞移植对兔心肌梗死后心功能的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-11/2008-03在中国医科大学动物实验中心完成。 材料：取健康成年兔28只，雌雄不拘，体质量2.0~2.5 kg。 方法：体外培养扩增兔骨髓间充质干细胞，在冠状动脉左室支主干第1，2对角支之间闭塞血管1 h后再灌注，建立缺血再灌注心肌梗死模型。将28只成年兔随机抽签法分为4组，每组7只。联合应用治疗组：造模后3 d注射5×1011 L-1密度间充质干细胞40 μL和含150 μg/L肝细胞生长因子及200 μg/L胰岛素样生长因子1的DMEM培养液8 μL；单纯干细胞治疗组：单独给予5×1011 L-1密度间充质干细胞40 μL；生长因子治疗组：注射含150 μg/L肝细胞生长因子和200 μg/L胰岛素样生长因子1的DMEM培养液8 μL；对照组：给予相同剂量DMEM培养液。采用IE33型超声仪，三维探头X-3获取左室三维全容积图像。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞荧光标记检测结果；三维超声测定造模后6周各组动物左室舒张末期容积、左室收缩末期容积及射血分数变化。 结果：28只成年兔均进入结果分析。①骨髓间充质干细胞贴壁生长，形态各异，1周后贴壁细胞逐渐呈细胞集落，为纺锤形、梭形的成纤维细胞形态，2周后达到80%~90%融合。荧光显微镜观察发现，除对照组及生长因子治疗组以外，联合应用治疗组和单纯干细胞治疗组心脏标本中均发现有DAPI标记的阳性细胞，在宿主兔心肌内呈散在分布于瘢痕周边区并沿心肌纤维排列方向走行。②与对照组和生长因子治疗组相比，联合应用治疗组和单纯干细胞治疗组心功能均有明显改善(P < 0.05)；但联合应用治疗组与单纯干细胞治疗组相比，射血分数值差异无显著性意义(P =0.45)。 结论：单纯干细胞移植与联合生长因子应用均能有效改善心肌梗死后心功能。     

兔椎间盘移植人骨髓间充质干细胞的实验观察

背景：国内外动物实验多是研究同种异体骨髓间充质干细胞的移植,但对人骨髓间充质干细胞在活体椎间盘内的存活情况还知之甚少。 目的：观察人骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内的存活情况。 方法：选取新西兰大白兔15只,每只兔子的椎间盘被分为3组,即空白组(L1~2)、生理盐水组(L2~3)、绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组(L3~4,L4~5,L5~6)。空白组不注射,生理盐水组髓核内注射生理盐水25 μL,绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组注射1×109 L-1绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞生理盐水混悬液25 μL。移植后1,2,4,6,8周取材,荧光显微镜观察荧光细胞的分布情况及其数量。 结果与结论：绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组移植后1,2,4,6,8周标本切片,髓核内均可见绿色荧光细胞。移植后6,8周的荧光细胞数量明显少于移植后1,2,4周(P < 0.001)。提示移植后8周以内,人骨髓间充质干细胞可在兔椎间盘内存活。     

高频超声评价干细胞自体移植对兔缺血肢体血管再生的影响

背景：研究发现干细胞可分化为血管内皮细胞，并可进一步分化形成新生毛细血管，自体骨髓间充质干细胞移植促进血管再生正是利用这一原理达到治疗下肢缺血的目的。 目的：采用高频二维超声及彩色多普勒血流成像检测评价自体骨髓间充质干细胞移植后兔缺血肢体血管再生的情况。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007-03/2008-04在无锡市第三人民医院完成。 材料：新西兰大白兔24只，随机分为模型对照组、细胞移植组，12只/组。 方法：2组兔均建立后肢缺血动物模型，造模1周后，细胞移植组取体外分离培养的Brdu标记的自体骨髓间充质干细胞，在腓肠肌部位皮下分多点注射，细胞悬液总体积0.5 mL，细胞总量2×106个；模型对照组于相同部位注射等量生理盐水。 主要观察指标：对兔股动脉及股浅动脉起始段行高频二维超声及彩色多普勒血流成像检测，测量股动脉血管内径、血流峰值速度、血流加速时间；取缺血部位肌肉组织，免疫组织化学染色检测移植细胞分布情况及病理学检查血管再生情况。 结果：移植后2周，高频超声检查细胞移植组兔股动脉内径、血流峰值速度均大于模型对照组，血流加速时间小于模型对照组(P < 0.01)。免疫组织化学染色后移植部位可见抗Brdu染色阳性细胞的存在，病理切片示细胞移植组血管密度明显高于模型对照组。 结论：自体骨髓间充质干细胞移植具有促进血管生成的作用，有望成为一种简单有效的治疗下肢缺血的方法，同时高频超声检测股动脉为自体骨髓间充质干细胞移植效果评价提供了有效实用的方法。     

非人工通气下建立大鼠心肌内干细胞移植模型

小动物心肌内干细胞移植术较多采用气管插管呼吸机辅助通气和剪断胸骨或肋骨而开胸造模,其损伤大、操作复杂、且影响模型存活率。 目的：在非人工通气条件下,以较小创伤,简单快速建立正常及心肌梗死大鼠心肌内干细胞移植模型。 方法：将SD大鼠随机均分2组：心肌梗死移植组建立心肌梗死模型后接受骨髓间充质干细胞移植,在心肌梗死周边区分5点迅速注射骨髓间充质干细胞;正常移植组于左心室前壁心外膜下进行注射,方法及注射量同心肌梗死移植组。移植后4 d,取大鼠心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞存活与分布,免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞心肌特异性蛋白的表达。 结果与结论：心肌梗死移植组模型存活率为80%,正常移植组存活率为93%。移植后4 d,移植区可见大量骨髓间充质干细胞,呈带状分布,排列方向与心肌纤维一致,并表达缝隙连接蛋白Connexin43和肌球蛋白重链MYH。结果提示：在非人工通气条件下,快速、简单、有效地建立了大鼠心肌内干细胞移植模型。     

5000/骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死及随后心肺复苏的实验研究 (英文发表,作者希望加急到9月)

背景：至目前为止发表的心肺复苏论文所使用的基本为健康动物,而临床实际情况是在心肺复苏发生之前患者大多有严重的心脏疾病,并导致了心室颤动的发生。 目的：实验力图接近临床实际,观察骨髓间充质干细胞移植后心肌梗死大鼠心功能的变化,及对其心肺复苏结果的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-04/08在美国南加州大学和中山大学附属第二医院联合完成。 材料：成年SD雄性大鼠18只,随机分为模型对照组、细胞移植组,9只/组。另取1月龄SD大鼠1只用于制备骨髓间充质干细胞。 方法：两组大鼠均结扎左前降支冠状动脉建立心肌缺血模型,4周后再次开胸,细胞移植组梗死心肌局部注射PKH26荧光标记的骨髓间充质干细胞悬液0.1 mL(5×106个细胞),模型对照组同法注射等量PBS。4周时诱导心室颤动及进行心肺复苏。 主要观察指标：移植后2,4周用超声心动图测量心功能;测量心肺复苏前及心肺复苏后4 h内的血液动力学参数的变化;在心肺复苏 72 h 后取心肌组织进行病理切片检查。 结果：与模型对照组比较,移植后2,4周细胞移植组射血分数均明显升高(P < 0.01)。在心肺复苏前及心肺复苏后4 h内,与模型对照组比较,细胞移植组心脏指数、左心室收缩压力上升到40 mm Hg(1 mm Hg= 0.133 kPa)时的上升速率、左心室舒张速率、左心室舒张末压均有明显改善(P < 0.01, P < 0.05)。与模型对照组比较,细胞移植组大鼠心肺复苏后可生存至72 h,生存时间明显延长(P < 0.05)。病理切片结果显示心肌内存在大量PKH26标记的骨髓间充质干细胞。 结论：大鼠心肌梗死后,骨髓间充质干细胞移植治疗能明显改善其心功能、心肺复苏前后的血流动力学参数以及生存时间。