整合素介导微泡声学造影剂与白细胞粘附的实验研究

目的:研究白细胞与蛋白微泡声学造影剂的粘附过程及机制。方法:光镜和电镜观察离体不同状态下的白细胞与蛋白微泡的粘附过程,流式细胞仪测定白细胞与微泡混合后,在存在或缺乏白细胞整合素的情况下,荧光强度的变化。结果:蛋白微泡与PMA激活的白细胞接触后 5min大量结合到白细胞表面,未经激活的白细胞表面少有微泡粘附 (20.30±2. 67vs4.50±1.43,P <0.01)。15min时微泡被吞噬入细胞内,并保持形态完整至 30min。两者的结合可被Mac-1mAb大部分阻止 (P <0.01),VLA-4mAb轻度阻止 (P <0.05)。结论:蛋白微泡声学造影剂可经 β₂ 整合素Mac-1和VLA-4介导与激活的白细胞结合,并进入细胞内从而在炎症部位停留,保持形态完整约15min,仍不失声学活性     

神经母细胞瘤细胞中MYCN调控miRNA的研究进展

转录因子MYCN是MYC癌家族的一员,与人类多种肿瘤有关,最常见的为神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB).MYCN通过激活和抑制靶基因的转录,以调节细胞的生命活动和肿瘤发生.近年来,越来越多的研究证实,在神经母细胞瘤中MYCN介导的致癌作用是通过调控一些与肿瘤相关的miRNAs来实现的.     

氯化钴对神经型一氧化氮合酶在人神经母细胞瘤细胞表达的影响

目的研究CoCl2刺激后nNOS及其产物在人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH细胞中的表达变化。方法培养SK-N-SH细胞,用CoCl刺激细胞,Real-TimePCR检测nNOS mRNA表达变化,Western-blot检测蛋白表达,荧光法检测NO产量的变化。结果 CoCl2刺激后nNOS mRNA和蛋白在SK-N-SH细胞表达水平从刺激后12h开始表达增强,持续到48h,同时NO的生成量也明显升高。结论 CoCl2刺激引起SK-N-SH细胞nNOS表达水平及其产物NO明显升高。     

白藜芦醇对神经母细胞瘤SH-SY5Y增殖的影响

目的:探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y增殖变化规律和生长状况的影响。方法:通过不同浓度(0.15～500)μmol/LRes作用于SH-SY5Y,检测药物作用5d后各组细胞增殖率和细胞生长状态,同时通过增殖率曲线获得其半数生长抑制浓度(IC50)和杀伤浓度,并对各组细胞进行Hochest染色,检测其细胞凋亡情况。结果:Res5μmol/L组细胞增殖率为(117.00±15.30)%显著高于空白对照组(P0.05),15μmol/L组细胞增殖率为(31.33±2.89)%,50、150、500μmol/L组,细胞出现负增长。Res对SH-SY5Y的IC50为12.78μmol/L,细胞杀伤浓度(即增殖率为0%)为19.88μmol/L。Res50～500μmol/L各组内,部分细胞皱缩,突起减少或消失,并出现凋亡细胞。结论:Res在0.15～500μmol/L浓度范围内对SH-SY5Y的增殖影响存在浓度依赖性,并依次表现为促进增殖、抑制增殖和杀伤细胞三个方面效应。其中杀伤细胞效应与促进SH-SY5Y的凋亡启动相关。     

节细胞性神经母细胞瘤17例临床病理观察

目的 探讨节细胞性神经母细胞瘤(ganglioneuroblastoma,GNB)的临床病理特点及诊断要点.方法 对17例GNB病例进行临床资料、病理形态学及免疫组化观察,并结合文献探讨其诊断及鉴别诊断.结果 17例患儿发病年龄,<1.5岁者2例,1.5～5岁者9例,>5岁者6例,年龄0~13岁,其中男性8例,女性9例,男女比例1:1.12.肿瘤位于腹膜后占58.8%(10/17),纵膈占17.6%(3/17),肾上腺占23.5%(4/17).17例依据肿瘤内节细胞与神经母细胞的比例和分布不同,参照Shimada分类法分为混杂型12例和结节型5例;免疫组化染色结果:神经母细胞及神经节细胞Syn、CgA和NSE均(+),CD99(-);施万细胞间质S-100、vimentin和NF均(+);结节内神经母细胞Ki-67增殖指数2%～50%.结论 GNB分为结节型、混杂型2个亚型,具有其独特的临床、病理学特征,极易被误诊,大体及镜下观察是诊断的关键,因此提高GNB的认识对避免误诊至关重要.     

原发于颈部的多形性间变型神经母细胞瘤1例报道并文献复习

目的 探讨多形性间变型神经母细胞瘤(pleomorphic anaplastic neuroblastoma,PANB)的临床病理特征.方法 对1例颈部PANB进行临床病理和免疫组化分析,并复习相关文献.结果 患儿男性,8岁,发现左颈部包块2个月,大小3.5 cm×3 cm×3 cm.镜检肿瘤细胞具有明显的多形性和间变性特征,可见病理性核分裂,部分区域由形态较一致的小圆形、胞质稀少的未分化细胞构成,可见Schwannian基质发育(神经毡)及分化不成熟的神经节样细胞.免疫组化:肿瘤细胞弥漫性强阳性表达NSE、Syn,片、灶性表达NF,而CgA、S-100、HMB45、CD99、CK、desmin、vimentin、CD45、CD15、CD30及CD34呈阴性表达.肿瘤细胞Ki-67增殖指数<25%.结论 PANB是一种好发于儿童,罕见的伴不同分化程度的神经母细胞瘤亚型,属于高度恶性肿瘤.     

SAHA联合MG132对神经母细胞瘤的抗肿瘤作用及分子机制

目的研究SAHA和MG132对神经母细胞瘤的抗肿瘤作用及其相关分子机制。方法用SAHA和MG132共同处理SH-SY5Y细胞,检测其增殖、细胞周期、凋亡、迁移、侵袭和表型相关蛋白。结果 SAHA和MG132可协同抑制SH-SY5Y细胞的增殖(P0.05)、糖代谢(P0.05)、细胞迁移和侵袭(P0.05),诱导G_1期阻滞和凋亡(P0.05),并呈现出时间和剂量依赖性。SAHA和/或MG132能上调ING5、PTEN、p53、Caspase-3、Bax、p21和p27的表达,下调14-3-3、MMP-2、MMP-9、c-myc、CyclinD1的表达。结论 SAHA和MG132联合应用可通过抑制增殖、迁移、侵袭、糖代谢和诱导细胞凋亡,有效逆转神经母细胞瘤恶性表型,二者联合使用有现实高效低毒的杀伤效果。     

XAV939抑制人神经母细胞瘤细胞的增殖

目的探讨小分子抑制剂XAV939对人神经母细胞瘤(NB)细胞系SH-SY5Y细胞的抗增殖和诱导凋亡的作用,及其可能机制。方法采用MTT法检测XAV939对SH-SY5Y细胞活力的抑制作用,并确定最佳作用浓度。然后采用Annexin V-FITC法检测XAV939处理后早期凋亡细胞百分比,Hoechst33342染色法观察凋亡细胞核形态,克隆形成实验检测细胞体外增殖能力的变化。Western blotting检测Wnt/β-连环蛋白(β-catenin信号通路的关键蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2的变化。结果 MTT结果显示,1μmol/L XAV939作用24h后,SH-SY5Y细胞增殖的抑制率有明显上升。XAV939处理后48h及72h,凋亡细胞百分比显著高于对照组,且细胞呈现出不同程度的凋亡形态。此外,XAV939可显著降低SH-SY5Y细胞的体外克隆形成率,降低Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin,Cyclin D1和c-Myc及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论 XAV939可能部分通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而抑制SH-SY5Y细胞的增殖。     

AIF靶向短发夹RNA干扰重组载体对神经母细胞瘤细胞SHSY5Y的沉默作用

目的探讨AIF基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对神经母细胞瘤细胞(SHSY5YAIF)基因的干扰作用。方法根据siRNA设计原则,构建靶向AIF基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/AIF),使用脂质体法转染人神经母细胞瘤细胞,通过RT-PCR和Wester blot印迹检测神经母细胞瘤细胞AIF基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/AIF重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SHSY5Y细胞后,该细胞的AIFmRNA和蛋白表达明显下降(P0.05)。结论成功构建靶向AIF基因的shRNA表达载体转染神经母细胞瘤细胞,有效抑制AIFmRNA和蛋白表达,为AIF基因靶向治疗提供前期的实验依据。     

人神经母细胞瘤中bcl—2基因表达与肿瘤细胞凋亡间的关系及p16…

目的探讨人神经母细胞瘤中ｂｃｌ－２基因表达状况与细胞凋亡的关系，以及ｐ１６基因的表达况状。     

MTA1基因调节神经胶质母细胞瘤细胞U-87-MG侵袭与迁移

目的评价沉默MTA1基因对神经胶质瘤细胞U-87-MG侵袭与迁移能力的影响。方法应用慢病毒转染技术沉默MTA1基因的表达,通过Western blot实验与荧光共聚焦实验检测MTA1蛋白与F-actin蛋白的表达;通过Transwell实验评估细胞侵袭与迁移能力;Western blot实验检测E-cadherin,N-cadherin蛋白的表达。结果沉默MTA1基因可下调F-actin蛋白的表达水平,抑制U-87-MG细胞的侵袭与迁移能力,并且上调N-cadherin蛋白,下调E-cadherin蛋白的表达。结论沉默MTA1基因抑制胶质母细胞瘤细胞系U-87-MG的侵袭与迁移能力与影响F-actin的集聚与EMT相关蛋白N-cadherin与E-cadherin表达相关。     

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞脑啡肽酶基因的表达与启动子区甲基化和组蛋白修饰相关

目的研究小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a(N2a)细胞中脑啡肽酶(NEP)基因表达的表观调控机制,探讨DNA甲基化与组蛋白乙酰化之间的相互作用。方法体外培养N2a细胞,以3μmol/L、5μmol/L DNA甲基化酶抑制5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-dc)及(300、500、700)nmol/L组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)分别处理N2a细胞48 h和24 h。采用逆转录PCR(RT-PCR)、Western blot法分别检测NEP的mRNA、蛋白表达;亚硫酸氢盐测序聚合酶链反应(BSP)法检测NEP基因启动子区DNA的甲基化水平;染色质免疫共沉淀(ChIP)法检测NEP基因启动子区组蛋白H3的乙酰化水平。结果 5-Aza-dc和TSA均能剂量依赖地提高NEP基因的表达(P0.01);5-Aza-dc可诱导NEP基因去甲基化(P0.01);TSA可增高NEP组蛋白H3乙酰化水平(P0.05),但不能明显改变NEP基因DNA的甲基化水平(P0.05)。结论在小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中NEP基因的表达受DNA甲基化及组蛋白乙酰化的调控,组蛋白乙酰化水平并不影响DNA甲基化状态。     

miR-221促进神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞N-MYC表达和细胞增殖

目的探讨过表达miR-221对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中N-MYC表达及其细胞增殖能力的影响。方法构建miR-221过表达慢病毒载体并建立稳定转染细胞系,实验设未处理组、空载组和miR-221组,以实时定量荧光PCR(RT-q PCR)检测miR-221表达;以RT-q PCR和Western blot检测N-MYC mRNA及蛋白表达;流式细胞术检测细胞周期;CCK8法检测细胞增殖。结果经测序证实慢病毒载体构建成功,与未处理的SH-SY5Y细胞相比,稳定表达miR-221的SH-SY5Y细胞(miR-221组)miR-221表达升高约7倍(P0.01);miR-221组N-MYC mRNA和蛋白表达水平较未处理组显著增多(P0.01);miR-221组G0/G1期细胞比例明显减少(P0.05),S期细胞比例显著增多(P0.05);miR-221组细胞增殖能力明显增强(P0.01)。结论过表达miR-221能够上调神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中N-MYC的表达,并可能通过促发细胞从G0/G1期向S期转化促进细胞增殖。     

周期蛋白依赖性激酶2对小鼠神经母细胞瘤免疫微环境的影响北大核心CSCD

目的探讨周期蛋白依赖性激酶(CDK2)对小鼠神经母细胞瘤免疫微环境的影响。方法评估CDK2抑制剂PF-07104091对皮下MYCN阴性神经母细胞瘤细胞SH-EP在C57BL/6N WT小鼠体内肿瘤生长的影响。评估CDK2稳定敲低MYCN的阴性神经母细胞瘤细胞在C57BL/6N WT小鼠体内的成瘤能力。评估CDK2抑制剂或者敲低CDK2对MYCN阴性神经母细胞瘤细胞增殖水平和凋亡水平的影响。探索CDK2抑制剂或者敲低CDK2是否影响MYCN阴性神经母细胞瘤免疫微环境。结果PF-07104091显著抑制MYCN阴性神经母细胞瘤生长并增加小鼠总生存率。CDK2敲低能够显著抑制肿瘤生长并增加小鼠总生存率。CDK2抑制剂或者敲低CDK2并不影响MYCN阴性神经母细胞瘤细胞的增殖水平和凋亡水平。CDK2抑制剂或者敲低CDK2的MYCN阴性神经母细胞瘤中观察到的CD3+T细胞、CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞和DC细胞的比例显著升高。CDK2抑制剂处理或者敲低CDK2后,MYCN阴性神经母细胞瘤中IFN-γ的水平上升,并且IFN-γ通路中的关键基因IFNB1、STAT1、TLR3、DDX58、CCL17、TAP1、TX2表达上调。腹腔注射或不注射CDK2抑制剂PF-07104091并不影响IFNGR1^(-/-)小鼠的生长速度和生存率。敲低与未敲低CDK2的MYCN阴性神经母细胞瘤在IFNGR1^(-/-)小鼠身上生长肿瘤的速度相似并且生存率相似。结论CDK2通过IFN-γ通路影响肿瘤免疫微环境中CD3+T细胞、CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞和DC细胞的比例。     

小鼠神经母细胞瘤细胞中神经型钙黏蛋白超表达对突起形成及连环蛋白表达的影响

目的 探讨神经型钙黏蛋白（N-cadherin）调控连环蛋白（catenin）对小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）形态的影响。 方法 构建鼠源的N-cadherin融合蛋白超表达载体,利用脂质体转染的方法将空载体pCAG-MCS-EGFP和超表达载体pCAG-N-Cad-EGFP分别转染至N2a细胞,作为对照组和实验组;细胞划痕和黏附实验检测N-cadherin超表达对N2a细胞迁移和黏附的影响,免疫荧光检测N-cadherin超表达对N2a细胞形态的影响,并结合Western blotting检测连环蛋白家族的表达情况。 结果 与对照组相比,N-cadherin超表达促进细胞突起的形成,使得N2a细胞突起增多和伸长;N-cadherin超表达增强了黏附性而抑制了细胞的迁移能力;N-cadherin超表达使得细胞内连环蛋白家族中α-catenin、β-catenin和p120蛋白表达均显著上升（P<0.05）,而γ-catenin表达下降但差异不显著（P>0.05）;另外,N-cadherin超表达的细胞有明显的聚集现象。 结论 N-cadherin超表达促进N2a细胞突起形成,增强细胞的黏附性从而抑制细胞的迁移能力,调控连环蛋白家族成员的表达并促使细胞聚集。     

人神经母细胞瘤中bcl-2基因表达与肿瘤细胞凋亡间的关系及p16基因的表达

目的探讨人神经母细胞瘤中ｂｃｌ－２基因表达状况及与细胞凋亡的关系，以及ｐ１６基因的表达况状。方法应用原位杂交和免疫组化技术检测神经母细胞瘤中ｂｃｌ－２及ｐ１６两种基因的表达，并采用凋亡细胞原位检测方法对神经母细胞瘤组织切片中凋亡细胞数进行检测。结果原位杂交检测发现，２０例人神经母细胞瘤中，ｂｃｌ－２和ｐ１６基因表达阳性率均为９５％；免疫组化检测发现ｂｃｌ－２和ｐ１６蛋白表达阳性率均为１００％。χ２检验表明两种方法检测阳性率差异无显著性。凋亡细胞原位检测结果显示，肿瘤组织凋亡细胞数量随ｂｃｌ－２基因表达增强而减少。结论人神经母细胞瘤中ｂｃｌ－２基因有较普遍的表达，直接影响神经母细胞瘤中凋亡细胞的数量，ｐ１６基因未见明确的表达缺失。     

血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞整合素β3表达的影响

目的和方法：本实验采用细胞ＥＬＩＳＡ和ＲＴ－ＰＣＲ的方法分别从蛋白质和ｍＲＮＡ水平对血管紧张素Ⅱ（Ａｎｇ－Ⅱ）作用下的内皮细胞表面整合素β３的表达进行检测。结果：１０－８ｍｏｌ／Ｌ～１０－５ｍｏｌ／Ｌ的Ａｎｇ－Ⅱ在蛋白质水平能够促进内皮细胞整合素β３表达（Ｐ＜０．０５），且呈剂量依赖性。１０－６ｍｏｌ／Ｌ的Ａｎｇ－Ⅱ作用培养的人脐静脉内皮细胞１８ｈ后，细胞整合素β３ｍＲＮＡ量为正常对照组的１５倍。结论：提示Ａｎｇ－Ⅱ促进内皮细胞表面整合素β３的表达可能是单核细胞和内皮细胞之间粘附功能增加的机制之一。