MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的:构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法:PCR克隆人MDRl基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果:PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3~5倍。结论:成功构建含MDRl启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

MDR1和Ki67在胃癌中的表达及临床意义

[目的]探讨MDR1和Ki67在胃癌中表达的临床意义。[方法]应用免疫组织化学方法检测100例胃癌组织中MDR1及Ki67的表达。[结果]MDR1和Ki67在胃癌组织中的表达高于癌旁组织，而与年龄、性别、组织学类型、浸润深度以及淋巴结转移均无相关性。MDR1与Ki67之间也无明显相关性。[结论]MDR1和Ki67都不能作为胃癌病人判断预后和临床化疗耐药的单一指标。方达与疗     

转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及鉴定

目的： 利用分子克隆的方法构建转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定其效应。方法： 以乳腺癌MCF7细胞基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增STAT5A基因的启动子序列,并将其克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL3-Enhancer中,经过菌液扩增、酶切、测序等方法获得目的质粒,并通过双荧光报告基因实验进一步验证其功能。结果： 构建的STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-STAT5A-pro-luc-E序列正确,且具有转录活性。在双荧光报告基因实验中发现重组载体pGL3-STAT5A-pro-luc-E荧光素酶的相对活性约为阴性对照pGL3-Enhancer的8倍（P<0.01）,而pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E荧光素酶的相对活性约是阴性对照pGL3-Enhancer的6倍（P<0.01）。结论： 本项目成功构建了转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒,为进一步研究STAT信号转导及转录激活蛋白信号通路提供了重要的研究工具。     

多药耐药相关蛋白和肺耐药蛋白在胃癌组织中的表达

目的　探讨多药耐药相关蛋白 (MRP)和肺耐药蛋白 (LRP)在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法　应用免疫组化S -P法检测 90例胃癌组织和 3 0例正常胃黏膜中MRP和LRP的表达情况。结果　 90例胃癌组织中的MRP、LRP阳性表达率分别为 92 .2 %和 93 .3 % ,均高于正常胃黏膜的阳性表达率 (P <0 .0 5 ) ,在高中分化腺癌中的阳性表达率高于低分化腺癌和黏液癌 (P <0 .0 5 ) ,不同浸润程度及是否有淋巴结转移者的阳性表达率相互比较无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　MRP、LRP在胃癌组织中均呈高表达 ,均在胃癌原发性多药耐药中起重要作用     

PC-1基因在肿瘤组织中的表达及其启动子区的克隆和活性分析

背景与目的：PC－1是在骨转移和雄激素非依赖的前列腺癌细胞株C4－2中高表达的新基因。本文拟研究PC－1基因在多种人肿瘤组织和正常组织中的表达水平,并对该基因的启动子区进行克隆及活性分析。方法：以PC－1基因特异性DNA序列为探针与10对肿瘤和正常组织的总RNA进行杂交;以C4－2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增PC－1基因翻译起始位点上游DNA序列。PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic上,将重组质粒瞬时转染C4－2细胞,荧光素酶定量分析检测启动子活性。结果：多肿瘤组织中PC－1基因的表达水平明显高于相应的正常组织中的表达;翻译起始位点上游340bp的片段没有启动子活性,而ATG前1099bp、1337bp,1579bp,1831bp和4939bp长度的片段都表现出启动子的功能活性。结论：PC－1基因在人前列腺癌以及多种肿瘤组织中被特异激活,表明该基因的功能可能和肿瘤的发生有关;研究的初步结果表明4939bp长度的启动子活性最强,以1831bp和4939bp之间可能含有转录增强子元件。     

ToPoll、MRP、GST-π在胃癌组织中的表达及其与预后的关系

[目的]探讨多药耐药基因相关蛋白在胃癌组织中的表达及其与预后的关系.[方法]免疫组化方法检测109例胃癌组织中ToPoⅡ,MRP,GST-π的表达,并分析他们与胃癌临床病理特征和预后间的关系.[结果]109例胃癌组织中,ToPo Ⅱ,MRP,GST-π阳性率分别为74.3%,40.4%和48.6%.3种蛋白各自表达的阳性组与阴性组比较,1、3、5年生存率均无统计学差异.高危组(2个以上危险因素)1、3、5年生存率分别为85.1%,57.4%,46.8%;低危组(1个危险因素)1,3,5年生存率分别为85.5%、64.5%、61.3%,但差异无统计学意义(X2=0.15,p=0.926).[结论]ToPo Ⅱ,MRP,GST-π与胃癌临床病理特征相关,3种耐药蛋白的联合检测可能成为预测胃癌患者预后的指标.     

ToPoⅡ、MRP、GST-π在胃癌组织中的表达及其与预后的关系

[目的]探讨多药耐药基因相关蛋白在胃癌组织中的表达及其与预后的关系。[方法]免疫组化方法检测109例胃癌组织中ToPoⅡ、MRP、GST-π的表达,并分析他们与胃癌临床病理特征和预后间的关系。[结果]109例胃癌组织中,ToPoⅡ、MRP、GST-π阳性率分别为74.3%、40.4%和48.6%。3种蛋白各自表达的阳性组与阴性组比较,1、3、5年生存率均无统计学差异。高危组（2个以上危险因素）1、3、5年生存率分别为85.1%、57.4%、46.8%;低危组（1个危险因素）1、3、5年生存率分别为85.5%、64.5%、61.3%,但差异无统计学意义（χ2=0.15,P=0.926）。[结论]ToPoⅡ、MRP、GST-π与胃癌临床病理特征相关,3种耐药蛋白的联合检测可能成为预测胃癌患者预后的指标。     

乳癌组织P16蛋白,MDR1,t—PA检测及其临床意义

目的检测Ｐ１６蛋白、多药耐药基因（ＭＤＲ１）及组织纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）在乳腺浸润型导管癌组织中的表达及水平,并探讨三者与其他临床病理资料的关系,以便为乳癌的辅助治疗提供更多的信息。方法分别采用免疫组化ＡＢＣ法、ＲＴ－ＰＣＲ方法、化学底物发色法测定Ｐ１６蛋白、ＭＤＲ１、ｔ－ＰＡ值,统计患者的临床分期、病理分级、激素受体、月经状况等,并作相关性分析。结果Ｐ１６蛋白（８９例）,阴性和低表达共６７例,阳性仅２２例,表达状况与肿瘤临床分期及病理分级无相关性;ＭＤＲ１（５５例）,阳性表达１６例,阴性和低表达共３９例,耐药性在不同的临床分期及激素受体状况组中无差别;ｔ－ＰＡ值在乳癌组（ｎ＝６９）为９８±４７Ｉｕ／ｍｇ蛋白,略高于纤维瘤组（８７±４０,ｎ＝３３）,无统计学差别,激素受体（ＥＲ、ＰＲ）双阳性组ｔ－ＰＡ值（１２５±３７）显著高于其他组,随临床分期Ⅰ→Ⅲ,ｔ－ＰＡ值呈显著下降趋势（Ｐ＜０．０１）。结论乳癌组织存在较大比例的Ｐ１６蛋白丢失和低表达（７５．２８％）,一定比例的ＭＤＲ１高表达（２９．１％）,ｔ－ＰＡ值可作为激素受体的补充说明,并提示临床病程。     

PI3K/Akt途径在朊蛋白介导胃癌耐药中的作用研究

目的:探讨PI3K/Akt途径在朊蛋白(PrPc)介导胃癌耐药中的作用.方法:脂质体基因转染法建立高表达PrPc的胃癌细胞亚系.Western印迹检测转染细胞中Akt蛋白的表达.噻唑蓝(MTT) 比色法测定单独或联用PI3K抑制剂LY294002时转染细胞对化疗药物的敏感性.流式细胞仪检测单独或联用LY294002时转染细胞内阿霉素蓄积和潴留.结果:将PrPc正义载体pcDNA-PrP转入SGC7901,成功建立PrPc高表达胃癌细胞亚系并命名为PS;空载体转染细胞命名为BS.Western-Blot显示磷酸化Akt在PS中的表达较BS及SGC7901增高,而三者的总Akt则无差别.未经LY294002处理时,在阿霉素或长春新碱的作用下,PS的存活率分别为91.4%±3.4%和89.4%±3.8%,较BS(79.2%±4.3%和75.9%±2.1%)明显增高(均 ),PS细胞内阿霉素蓄积量和潴留量分别为4.4±0.3和4.2±0.4,明显低于BS(8.2±0.5和8.0±0.3)(均 );当联合LY294002处理后,PS在两种药物作用下的存活率均随着LY294002浓度的增加逐渐降低,并均在LY294002为30μmol/L时接近BS(均 ),PS细胞内阿霉素蓄积量和潴留量逐渐增高,并均在LY294002为30μmol/L时接近BS(均 ).结论:PrPc介导的胃癌耐药与PI3K/ Akt途径活性密切相关,抑制PI3K/ Akt途径活性可逆转PrPc介导的胃癌耐药.     

TGF-β1对胃癌细胞和多药耐药胃癌细胞抗增殖作用及其机制的探讨

目的:探讨TGF-β1对胃癌细胞和多药耐药胃癌细胞增殖的影响及其机制.方法:采用MTT法、RT-PCR和酶联吸附反应检测24、48和72 h的细胞生存抑制率、C-myc基因的表达和端粒酶活性.结果:在24、48和72 h时TGF-β1处理的实验组SNU-601细胞生存抑制率分别为(18.66±1.37)%、(21.19±1.55)%和(31.51±1.71)%,SNU-601/cis10细胞生存抑制率分别为(38.90±2.56)%、(50.00±2.61)%和(50.38±1.86)%,各时间段与对照组相比,生存抑制率均显著增高,P值均为0.000;实验组多药耐药胃癌细胞生存抑制率与胃癌细胞相比明显增高,P均<0.05.RT-PCR测定结果,TGF-β1可时间依赖性抑制C-myc基因的表达和端粒酶活性,与对照组相比均明显降低,P均<0.05.端粒酶活性检测结果,TGF-β1时间依赖性抑制端粒酶活性,与对照组相比均明显降低,P均<0.05,对多药耐药胃癌细胞的端粒酶活性抑制作用更明显,在48和72 h时端粒酶活性呈阴性,在各时间段与实验组胃癌细胞相比差异均有统计学意义,P均<0.05.结论:TGF-β1对SNU-601胃癌细胞及SNU-601/cis10多药耐药胃癌细胞具有抗增殖作用,并对多药耐药胃癌细胞的抑制作用更明显,其机制之一与抑制C-myc基因的表达及端粒酶活性有关.     

PI3K／Akt途径在朊蛋白介导胃癌耐药中的作用研究

目的：探讨P13K／Akt途径在朊蛋白（PrPc）介导胃癌耐药中的作用。方法：脂质体基因转染法建立高表达PrPc的胃癌细胞亚系。Western印迹检测转染细胞中Akt蛋白的表达。噻唑蓝（MTT）比色法测定单独或联用P13K抑制剂LY294002时转染细胞对化疗药物的敏感性。流式细胞仪检测单独或联用LY294002时转染细胞内阿霉素蓄积和潴留。结果：将PrPc正义载体pcDNA—PrP转入SGC7901,成功建立PrPc高表达胃癌细胞亚系并命名为PS;空载体转染细胞命名为BS。Western—Blot显示磷酸化Akt在PS中的表达较Bs及SGC7901增高,而三者的总Akt则无差别。未经LY294002处理时,在阿霉素或长春新碱的作用下,PS的存活率分别为91．4％±3．4％和89．4％±3．8％,较BS（79．2％±4．3％和75．9％±2．1％）明显增高（均）,PS细胞内阿霉素蓄积量和潴留量分别为4．4±0．3和4．2±0．4,明显低于BS（8．2±0．5和8．0±0．3）（均）;当联合LY294002处理后,PS在两种药物作用下的存活率均随着LY294002浓度的增加逐渐降低,并均在LY294002为30tLmol／L时接近BS（均）,PS细胞内阿霉素蓄积量和潴留量逐渐增高,并均在LY294002为30μmol／L时接近BS（均）。结论：PrPc介导的胃癌耐药与P13K／Akt途径活性密切相关,抑制P13K／Akt途径活性可逆转PrPc介导的胃癌耐药。     

人SOX7启动子荧光素酶报告质粒构建及HMGA2对其活性影响的研究

目的 研究发现,HMGA2促进肿瘤细胞发生EMT与其下游基因SOX7有关.为进一步验证转录因子HM-GA2与其下游基因SOX7之间的调控关系,本研究通过构建人SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒,采用荧光素酶报告实验观察HMGA2对SOX7基因启动子荧光素酶活性的影响,为研究HMGA2转录表达的调控机制提供必要的实验基础.方法 采用PCR技术扩增人SOX7基因启动子序列(-1 549～+79nt),将SOX7基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中构建质粒pGL3-SOX7-promoter;再分别将pGL3-SOX7-promoter、pGL3-basic-SOX7-promoter和对照质粒(pLV-UbC-IRES2-EGFP)、pGL3-SOX7-promoter和HMGA2表达质粒(pLV-UbC-HMGA2-IRES2-EGFP)3组质粒共转染293T细胞,培养48 h后,检测3组荧光素酶的表达情况,观察HMGA2对SOX7基因启动子的调控作用.结果 通过菌落PCR和核酸测序证实,人SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒pGL3-SOX7-promoter构建成功;将pGL3-SOX7-promoter和HMGA2表达质粒(pLV-UbC-HMGA2-IRES2-EGFP)共转染293T细胞48 h后,与对照组相比,SOX7基因启动子介导荧光素酶的活性降低约31％,受到明显抑制(P=0.003),提示HMGA2可能调控SOX7基因启动子的活性.结论 本研究成功构建了SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒,初步验证了SOX7是HMGA2下游的作用靶点.     

The modified firefly luciferase reporter gene (luc+) but not Renilla luciferase is induced by all-trans retinoic acid in MCF-7 breast cancer cells

Luciferase genes are widely used as reporters to analyze promoter and regulatory elements. We found that a luciferase reporter gene vector with a modified firefly luciferase gene (luc+), but not Renilla luciferase (Rluc), was induced by all-trans retinoic acid (tRA) in the MCF-7 breast cancer cell line. tRA (5 × 10^–6 M) increased luciferase activity of the pGL3 promoter vector (containing luc+) up to 3.8-fold in MCF-7 cells, but not in LNCaP prostate cancer cells or JEG-3 choriocarcinoma cells. Chimeric plasmids were constructed and showed that tRA-induction required the luc+ gene, but not any specific promoter or vector sequence. Time course and dose-response studies of tRA-induction indicated that longer treatment (>24 h) and higher tRA dose (>10^–6 M) were required for luc+ induction compared with those for a positive retinoic acid response element (maximum induction at 6 h and 10^–8 M tRA). Studies with the translation inhibitor, cycloheximide, indicated the half-life of the luc+ protein was increased from 9.7 ± 1.5 to 22.1 ± 3.1 h with tRA treatment. Other retinoids, TTNPB, a retinoic acid receptor /-specific ligand, and a retinoid X receptor ligand, did not significantly increase luc+ expression. Caution is needed in analysis of retinoid responsive gene regulation with the luciferase reporter system in MCF-7 cells, especially at high retinoid concentrations.     

MSP法检测胃癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化改变

目的：探讨抑癌基因RASSF1A启动子区CpG岛甲基化与胃癌及临床病理特征的关系。方法：采用甲基化特异性PCR（methylation—specific PCR,MSP）法检测60例胃癌组织及相应癌旁组织和30例对照组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态。结果：胃癌组织中RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化率为65．0％（39／60）,艋著高于癌旁组织6．7％（4／60）,及对照组0％（0／30）（P〈0．01）。胃癌组织中不同年龄、性别、分化程度及淋巴结转移与否的RASSF1A基因甲基化率的差异均无统计学意义。结论：胃癌中RASSF1A基因启动子区的高甲基化提示其与胃癌的发生密切相关,MSP法对RASSF1A基因启动子区甲基化的检测有望成为胃癌早期监测的重要方法。     

VEGFR1和MDR1在胃癌中的表达及意义

目的:探讨VEGFR1和MDR1在胃癌中的表达及意义.方法:采用免疫组化SP法检测VEGFR1和MDR1在胃癌中的表达及与分化程度的关系;比较VEGFR1和MDR1在胃癌中的表达相关性.结果:VEGFR1在高、中、低度分化胃癌的表达率依次为15/53(28%)、19/43(44%)、37/54(68%); 在低分化胃癌组织中的表达明显高于高分化和中分化胃癌组织(P＜0.05).MDR1在高、中、低度分化胃癌的表达率依次为18/53(34%)、21/43(48%)、41/54(76%); 在低分化胃癌组织中的表达明显高于高分化和中分化胃癌组织 (P＜0.05).结论:VEGFR1和MDR1在胃癌中的表达具有一致性,可能在胃癌的多药耐药中扮演重要角色.     

survivin基因启动子调控的HSV-tk真核表达载体的构建及在人喉癌细胞中的特异性表达

目的构建survivin基因启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶(humansimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk)真核表达载体,检测其在人喉癌细胞中的表达。方法PCR克隆survivin基因启动子与tk基因,双酶切后分别插入pCI-neo真核表达载体中,酶切鉴定后用脂质体法转染喉癌细胞(Hep-2)和正常细胞(7702),RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况。结果成功构建了survivin启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/survivin-tk;并通过RT-PCR检测出survivin启动子调控的表达载体在喉癌细胞中有表达,而在正常细胞中无明显表达。结论survivin启动子具有肿瘤特异性,有可能解决喉癌基因治疗中的特异性杀伤问题。     

4ARE强化的双荧光蛋白报告基因载体的构建及鉴定

目的:构建4ARE强化的红、绿双荧光蛋白报告基因载体。方法:人工合成3对ARE序列,经退火和磷酸化后插入pARE-TK-GFP载体,构建成p4ARE-TK-GFP载体。以质粒pDsRed2-N1为模板,PCR扩增红色荧光蛋白及其启动子序列与pMD18-T载体连接,构建成pMD-DsRed载体。用Ade I酶和BspT I酶对载体pMD-DsRed和p4ARE-TK-GFP进行双酶切,连接产物转化大肠埃希菌DH5α 感受态细胞后,挑取阳性克隆子进行质粒抽提酶切及测序鉴定。结果:经酶切及DNA测序证实,目的片段ARE及DsRed的序列完全正确,重组双荧光蛋白报告基因载体成功转入DH5α。结论:成功构建4ARE强化的双荧光蛋白报告基因载体并在DH5α内表达,为进一步研究ARE的调控作用奠定了基础。     

胃癌DAPK基因甲基化的初步研究

目的：探讨死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase,DAPK）基因甲基化与胃癌的关系。方法：采用甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）检测38例配对胃癌组织、癌旁正常组织和转移淋巴结中DAPK基因甲基化的情况。结果：81．6％（31／38）的胃癌组织中存在异常甲基化,而相应的癌旁正常组织和转移淋巴结中该基因的甲基化率分别为42．1％（16／38）和70．2％（27／38）。癌组织和转移淋巴结中DAPK基因甲基化的发生率显著高于癌旁正常组织。癌旁正常组织中,该基因甲基化与年龄相关,P=0．020。但与肿瘤大体类型、分化程度及浸润深度等临床病理特征无关。结论：DAPK基因异常甲基化是胃发生发展过程中的频发事件,通过检测胃黏膜组织及转移淋巴结中该基因的甲基化情况,可能会对胃癌的诊断及判断淋巴结的微转移提供一定的参考价值,并有望成为胃癌新的基因治疗靶点。