以TIMP-2为靶基因的反义寡核苷酸对肝纤维化大鼠肝功能生化和肝纤维化指标的影响

目的探讨以基质金属蛋白酶组织抑制因子-2（TIMP-2）为靶基因的反义寡核苷酸对肝纤维化大鼠肝功能生化和肝纤维化指标的影响。方法免疫诱导型大鼠肝纤维化模型制备过程中,尾静脉注射针对TIMP-2的反义寡核苷酸。模型制备结束后,检测AⅡ、ALP、TBil、DBil等肝功能生化指标和血清HA、Ⅳ-C、PCHI水平等肝纤维化指标,并测定肝组织羟脯氨酸含量,分析治疗组与其他实验组间的差异。结果治疗组肝功能生化各指标均优于模型组和秋水仙碱组;治疗组肝纤维化生化指标与模型组和秋水仙碱组相比,其数值较低,但差异不显著;治疗组肝组织羟脯氨酸含量显著低于模型组和秋水仙碱组。结论抑制TIMP-2在肝组织中的表达可抑制细胞外基质（ECM）在肝组织内的沉积,降低肝纤维化大鼠肝脏功能的损害。     

硫代反义寡核苷酸对肝纤维化大鼠TIMP-1基因及蛋白表达的抑制作用

目的观察硫代反义寡核苷酸(asON)对实验性免疫性肝纤维化大鼠肝组织中TIMP-1基因和蛋白表达的抑制作用.方法根据TIMP-1二级结构基因组的调控序列、结构蛋白、编码区序列等分析,设计4组不同的asON.利用尾静脉注射将其导入肝纤维化大鼠模型体内;通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的免疫组化、原位杂交法、胶原纤维特殊染色及电镜等观察asON对大鼠肝纤维化的影响.结果针对TIMP-1设计的asON经硫代修饰后在活体内能确切表达并能在mRNA水平上封闭实验性肝纤维化大鼠肝组织中TIMP 1的基因和蛋白表达,其结果可促进肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解(P＜0.01).肝纤维化病理学分级和电镜观察结果显示asON对肝纤维化的逆转具有一定效果.结论针对TIMP-1设计的硫代asON在动物体内具有良好的抗肝纤维化效应,从而为研制新一代抗肝纤维化基因治疗药物奠定了基础.     

反义金属蛋白酶组织抑制因子-1表达质粒对实验性肝纤维化的影响

目的　观察反义金属蛋白酶组织抑制因子 1(TIMP 1)表达质粒对实验性肝纤维化的影响。方法　运用重组DNA技术构建反义TIMP 1真核细胞表达质粒 ,经与糖化多聚赖氨酸偶联后 ,尾静脉注射将其导入猪血清诱导的免疫性大鼠肝纤维化模型体内 ;通过Northern印迹法、RT PCR、Western印迹法检测外源导入基因的表达 ,并通过肝组织间质胶原酶活性和羟脯氨酸测定 ,以及肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学与VanGieson染色观察反义TIMP 1质粒对大鼠肝纤维化的影响。结果　外源导入基因可在肝组织中获得确切表达 ,其表达可增加间质胶原酶的活性 (P <0 .0 1) ,减少羟脯氨酸含量 (P <0 .0 1) ,促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解 (P <0 .0 1) ,并促进肝脏病理形态一定程度的改善 (P <0 .0 1)。结论　反义TIMP 1表达质粒对肝纤维化有较好的改善作用。     

反义金属蛋白酶组织抑制因子—1表达质粒对实验性大鼠肝纤维 …

观察反义金属蛋白酶组织抑制因子－１（ＴＩＭＰ－１）表达质粒对实验性大鼠肝纤维化的影响。方法运用逆转录巢式和重组ＤＮＡ技术,构建大鼠反义ＴＩＭＰ－１真核细胞表达质粒,经脂质体包埋后,利用腹腔注射将其导入免疫性大鼠肝纤维化模型体内;通过ＲＴ－ＰＣＲ,Ⅰ、Ⅲ型胶原的免疫组化及Ｍａｓｓｏｎ胶原染色观察反义ＴＩＭＰ－１表达质粒对大鼠肝纤维化的影响。结果反义原的免疫组化以及     

抑制金属蛋白酶组织抑制因子-2在肝组织中的表达对大鼠肝纤维化发展的影响

我们前期应用反义寡核苷酸技术，以金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）-1基因为靶基因，研究发现抑制TIMP-1的表达可阻止大鼠肝纤维化的发展。肝纤维化时，肝内增生的胶原蛋白主要为Ⅰ、Ⅲ型胶原，Ⅳ型胶原的增生沉积并不占主要地位，但Ⅳ型胶原过度沉积可使肝血窦毛细血管化，肝血流和结构改变，从而加剧肝脏病变。TIMP-2是肝组织内Ⅳ型胶原酶，即基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的主要抑制因子，     

辛伐他汀对肝纤维化大鼠Ⅳ-C、MMP-2及TIMP-2表达的影响

目的探讨辛伐他汀治疗肝纤维化的可行性及机制。方法将24只肝纤维化大鼠随机分为药物组、模型组各12只,另取12只正常大鼠作为对照组。模型组不干预,药物组予辛伐他汀5mg／（kg·d）灌胃13周;对照组予等量生理盐水灌胃。13周后取大鼠肝组织,苏木精-伊红染色观察肝组织病理学改变,免疫组织化学方法检测肝组织中Ⅳ型胶原（Ⅳ—C）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）及基质金属蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）表达。结果与对照组比较,模型组肝组织炎症明显、Ⅳ-C表达与沉积增加,TIMP-2蛋白表达显著增加（P均〈0．05）,MMP-2蛋白表达变化不明显。药物组肝脏炎症较轻,相对模型组Ⅳ—C显著减少,MMP-2蛋白表达增多,TIMP-2蛋白表达减少。结论辛伐他汀可以在一定程度上减轻肝纤维化程度,其机制可能是抑制TIMP-2表达、增加MMP-2表达、促进Ⅳ-C降解。     

复方黄芪颗粒对肝纤维化大鼠肝脏基质金属蛋白酶-2、金属蛋白酶组织抑制因子-2蛋白表达的影响

目的：探讨复方黄芪颗粒对肝纤维化大鼠肝脏基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、金属蛋白酶组织抑制因子-2（TIMP-2）蛋白表达的影响。方法：应用Chevallier半定量计分系统，病理组织学观察等方法，结合细胞外基质（ECM）特殊染色动态变化观察，分析高、低剂量FFHQKL治疗猪血清诱导肝纤维化大鼠的各时间段肝组织学及ECM量的变化，评估复方黄芪颗粒的抗肝纤维化疗效；应用免疫组织化学染色观察造模结束时以及药物治疗各时间段肝组织内MMP-2、TIMP-2表达量的变化。结果：与模型组比较，高、低剂量复方黄芪颗粒治疗第2个月、3个月结束时，大鼠肝组织Chevallier纤维化评分均明显减少（P〈0．01）。复方黄芪颗粒高、低剂量治疗组大鼠在治疗第2个月、3个月结束时，TIMP-2蛋白表达明显减弱，MMP-2蛋白表达明显增强，与模型组比较差异有显著性意义（P〈0.05）。结论：复方黄芪颗粒可以在蛋白水平增强MMP-2酶蛋白的表达，同时抑制TIMP-2酶蛋白的表达，促进ECM的降解，从而达到逆转肝纤维化的目的。     

抑制TIMP-1的硫代反义寡核苷酸在肝纤维化大鼠体内生物学分布及药代动力学研究

目的　研究抑制TIMP 1的硫代反义寡核苷酸 (S asON )在肝纤维化大鼠体内的生物学分布及药代动力学 ,为其在临床上应用提供理论依据。方法　合成互补于TIMP 1基因的反义寡核苷酸并加以硫代磷酸化修饰 ;用γ 3 2p ATP标记 2 0聚S asON ,给实验大鼠尾静脉一次性注射 ,每 2 4h收集尿液和粪便 ;分别在 12个时间点上放血杀死实验大鼠 ,取各器官组织匀浆 ,用液体闪烁计数测定cpm值。结果　S asON广泛分布于全身各器官 ,以肝、肾聚积浓度最高 ,其药物能在体内维持 72h以上。血浆药物清除曲线符合二室模型。单位时间内机体清除药物的能力即血浆清除率为0 .0 7ml/h ,尿液为主要排除途径 ,2 4h排出 2 8.4% ,72h排出 44 .8% ,粪便排出量较少。结论　抑制TIMP 1的S asON在实验大鼠体内以肝、肾为主的广泛组织生物学分布和较长的清除半衰期 ,使其成药及临床用药变为可能 ,从而为研制新一代抗肝纤维化基因治疗药物奠定了实验基础。肝脏作为反义治疗的靶器官有着重要的现实意义。     

加味桃核承气汤对四氯化碳所致肝纤维化模型大鼠TIMP-1蛋白表达的影响

目的：观察加味桃核承气汤对四氯化碳（CCl4）肝纤维化的治疗作用，从分子生物学水平探讨其对金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）的影响。方法：用CCl4诱导大鼠肝纤维化，将实验动物随机分为正常对照组、模型对照组、加味桃核承气汤高、中、低剂量治疗组和秋水仙碱对照组；采用灌胃给药，疗程8周；用苦味酸-天狼红胶原染色方法观察肝纤维化积分（SSS）的变化；用免疫组化技术半定量检测肝组织TIMP-1的蛋白表达水平。结果：模型对照组SSS显著高于正常对照组，经加味桃核承气汤治疗后SSS显著减轻；模型对照组大鼠肝组织TIMP-1的蛋白表达水平增加。各治疗组的TIMP-1的蛋白表达水平均显著下降。结论：①加味桃核承气汤对CCl4诱导的肝纤维化有治疗作用。②加味桃核承气汤抗实验性肝纤维化作用机制与抑制肝星状细胞（HSC）的活化，调控TIMP-1的蛋白表达水平有关。     

实验性肝纤维化基质金属蛋白酶-2基因表达与酶活性的变化

目的探讨肝组织基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2) 与肝纤维化发展的关系。方法大鼠随机分成正常对照组、模型组。模型组以二甲基亚硝胺(DMN)腹腔内注射,正常对照组以等渗盐水代替腹腔内注射。分别于第1、4、10、17、28、42、56天分批处死大鼠。留取的肝脏组织做HE与Masson染色,按0-4期标准判定肝纤维化程度,测定羟脯氨酸含量,用半定量逆转录聚合酶链反应检测MMP-2和TIMP-2 mRNA,用酶谱法检测MMP-2的酶活性。结果模型组大鼠肝组织MMP-2 mRNA的表达在动物实验后第10天开始显著高于正常对照组,并保持高水平表达直至动物实验结束;MMP-2活性在动物实验后1d即明显高于正常对照组,并随着实验的进行酶活性增高越明显,在停止DMN损伤后,仍呈高水平表达直至实验结束。TIMP-2 mRNA 17d后表达水平开始下降,到28 d左右时降到最低点,此后表达水平迅速上升,到42 d左右时上升到最高峰,明显高于正常对照水平,保持到动物实验结束。TIMP-2/MMP-2从第10天开始较正常对照明显降低,并随着肝纤维化的发展保持这种显著低于正常对照的水平直至动物实验结束。结论在肝纤维化形成过程中,MMP-2的表达增高,而TIMP-2的表达相对于MMP-2过于低下,从而使MMP-2的酶活性得不到抑制而增高,促进了肝纤维化的不断形成与发展。     

化学合成经修饰抗TIMP-2小干扰RNA对CCl4诱导肝纤维化动物模型的影响

目的:研究化学合成经修饰抗金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)小干扰RNA(siRNA)对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的影响及其作用机制.方法:SD大鼠42只随机平均分成7组:正常组、阴性对照组、假手术组、模型组,治疗组(分3组,分别用0.05、0.1、0.2mg/kgsiRNA尾静脉注射).以400mL/LCCl4(3μL/g)sc诱导大鼠肝纤维化.8wk后所有动物取肝组织标本,测门静脉血压(PVP)并经腹主动脉取血.常规HE染色和VanGieson(VG)胶原染色,检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CIV)和羟脯氨酸(Hyp).应用荧光实时定量PCR法检测TIMP-2、Ⅰ型胶原纤维(COLⅠ)、Ⅲ型胶原纤维(COLⅢ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA的表达.应用Westernblot或明胶酶谱法检测TIMP-2、α-SMA和MMP-2蛋白的表达.结果:各治疗组在应用抗TIMP-2siRNA治疗后组织学病变减轻,PVP较模型组降低(2.2±0.1,1.9±0.1,1.6±0.1kPavs2.7±0.1kPa,P<0.05),血清ALT和AST减少(2089.3±154.5,1869.8±138.0,1422.5±139.7nkat/Lvs2717.2±193.8nkat/L,P<0.05;3634.1±242.7,2739.4±141.3,2286.6±145.5nkat/Lvs4067.5±251.5nkat/L,P<0.05),反映肝纤维化指标的HA,LN,PCⅢ,CIV和Hyp均显著低于模型组(176.0±10.2,160.6±9.3,109.9±9.4μg/Lvs206.3±17.0μg/L,P<0.05;93.1±8.2,71.4±7.5,55.9±7.3μg/Lvs116.6±10.8μg/L,P<0.05;71.2±6.1,64.1±5.1,53.6±4.3μg/Lvs91.2±8.9μg/L,P<0.05;64.3±5.4,50.7±5.8,41.6±4.4μg/Lvs80.3±6.8μg/L,P<0.05;328.7±17.6,279.7±16.3,230.4±16.1μg/gvs380.7±20.6μg/g,P<0.05).各治疗组TIMP-2,COLⅠ,COLⅢ和α-SMAmRNA的表达较模型组明显减少(7.53±0.83,5.04±0.75,1.30±0.49vs23.23±2.14,P<0.05;33.38±2.85,22.80±2.48,11.45±1.27vs43.18±3.32,P<0.05;19.23±1.95,13.21±1.35,10.11±1.09vs25.90±2.23,P<0.05;23.76±2.06,15.33±1.25,10.53±1.02vs34.85±3.16,P<0.05),且TIMP-2,MMP-2和α-SMA蛋白的表达也相应减少(23.27±3.06,14.13±1.86,9.16±1.33vs44.83±5.45,P<0.05;23.80±2.14,15.58±1.52,9.52±0.93vs39.90±3.23,P<0.05;24.58±2.59,19.29±2.31,13.40±1.98vs57.19±7.07,P<0.05).结论:化学合成经修饰抗TIMP-2siRNA能显著降低TIMP-2的表达,促进细胞外基质的降解,抑制肝星状细胞的活化.     

秋水仙碱对肝纤维化大鼠肝脏基质金属蛋白酶-1及其抑制因子-1表达的影响

目的 观察秋水仙碱对纤维化肝脏基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响,从胶原降解的角度探讨秋水仙碱对肝纤维化有无逆转作用及可能存在的机制.方法 制备免疫性大鼠肝纤维化模型,并给予秋水仙碱治疗;通过RT-PCR检测MMP-1、TIMP-1的表达,并作Ⅰ、Ⅲ型胶原的免疫组化以及Masson胶原染色.结果 发现秋水仙碱对肝纤维化大鼠MMP-1的表达无明显影响(P>0.05),但可以抑制TIMP-1的表达(P<0.05),促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解(P<0.05);然而在病理形态学的观察中,未发现秋水仙碱治疗组与肝纤维化模型组之间存在的显著性差异(P>0.05).结论 秋水仙碱可以抑制纤维化肝脏TIMP-1的表达,从而增强间质胶原酶的活性,促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解,产生抗肝纤维化的作用,但其作用有限.     

化学合成经修饰抗TIMP-2小干扰RNA抑制胆总管结扎大鼠肝纤维化形成

目的研究化学合成经修饰抗金属蛋白酶组织抑制剂-2（tissue式分解inhibitor of metalloproleinase-2，TIMP-2）小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对胆总管结扎大鼠肝纤维化形成的影响。方法30只雄性SD大鼠随机均分成5组：正常组、假手术组、模型组、阴性对照组、治疗组，行胆总管双重结扎和经肠系膜上静脉（superior mesenter vein，SMV）皮下置管手术，2周后给予治疗组0．05mg·kg^-1 siRNA经皮SMV注射，每3天1次。6周后取所有动物肝组织标本，经门静脉测压（portal vein pressure，PVP）和腹主动脉取血。常规HE染色和Van Gieson（VG）胶原染色，检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量。应用荧光实时定量PCR法检测TIMP-2、I型胶原纤维（collagen type I，COL I）和Ⅲ型胶原纤维（collagentype Ⅲ，COLⅢ）mRNA的表达。应用Western印迹检测TIMP-2蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle antibody，α-SMA）和结蛋白（Desmin）的表达。结果经抗TIMP-2 siRNA干预后，大鼠肝脏组织学病变减轻，PVP降低，血清ALT和AST水平下降，肝组织Hyp含量减少，且TIMP-2、COL I和COL Ⅲ mRNA的表达显著低于模型组，TIMP-2蛋白的表达也显著降低。同时肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）标记物α-SMA和Desmin蛋白的表达均显著低于模型组，尤以α-SMA蛋白表达减少更为明显。结论化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA能够抑制胆总管结扎大鼠肝纤维化形成，有可能成为肝纤维化治疗的新策略。     

基质金属蛋白酶—1,反义金属蛋白酶组织抑制因子—1表达质粒？…

目的 观察基质金属蛋白酶－１（ＭＭＰ－１）,反义金属蛋白酶组织抑制因子－１（ＴＩＭＰ－１）表达质粒对大鼠肝纤维经的影响。方法 运用重组ＤＮＡ技术,构建大鼠ＭＭＰ－１,反义ＴＩＭＰ－１,真核细胞表达质粒,经脂质包埋后,利用腹腔注射将其导入免疫性大鼠纤维化模型体内,观察其对大鼠肝纤维化的影响。结果 ＭＭＰ－１,反义ＴＩＭＰ－１表达质粒均可促进肝脏中Ⅰ,Ⅲ型胶原的降解（Ｐ〈０．０５－Ｐ〈０．０１）,且作