细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29基因的表达、纯化及免疫原性初步分析

目的对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)诊断抗原P-29(diagnostic antigen P-29)重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫原性。方法从重组质粒EgP-29/pGEM-T中获取诊断抗原P-29基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白,经Western-blot、ELISA分析重组蛋白的免疫原性。结果成功构建原核重组表达载体EgP-29/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出浓度较高的重组蛋白。ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体IgG,Western-blotting鉴定该抗体能识别重组抗原及天然抗原原头蚴。结论重组蛋白具有良好的免疫原性。     

细粒棘球蚴抗原EPC1基因的克隆、表达及其免疫诊断的研究

目的克隆、表达细粒棘球蚴EPC1(EgEPC1)基因,鉴定重组抗原的反应原性,并用棘球蚴病患者血清评价其诊断价值。方法从绵羊肝脏棘球蚴囊中分离原头节,提取其总RNA,采用RT-PCR扩增EgEPC1基因,将其克隆至pGEM-T载体,再将其与原核表达载体PET28a(+)连接构建重组质粒PET28a-EgEPC1,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)对纯化的重组抗原进行鉴定分析。以该重组蛋白作为包被抗原建立ELISA方法,检测细粒棘球蚴病患者血清(60份)特异性IgG抗体,同时以多房棘球蚴病(37份)、囊尾蚴病(16份)、华支睾吸虫病(7份)、日本血吸虫病(4份)患者和健康人血清(33份)作为对照,评价重组抗原EgEPC1的免疫诊断效果。结果双酶切鉴定和测序结果均显示重组质粒PET28a-EgEPC1构建成功。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组质粒PET28a-EgEPC1在E.coli BL21(DE3)...     

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-08002的克隆、表达及免疫反应性分析

目的筛选细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)原头节抗原分子,并进行克隆、表达及免疫反应性分析。方法在对细粒棘球绦虫六钩蚴和原头节阶段表达的转录组测序数据进行差异分析的基础上,筛选出原头节阶段特异性表达的抗原分子。PCR扩增后克隆至p ET28a载体,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,抗His标签镍亲和层析柱纯化重组蛋白rEg-08002,快速免染聚丙烯酰胺电泳分析表达产物;蛋白质印迹(Western blotting)分析rEg-08002的免疫反应性。ELISA分析重组蛋白rEg-08002与细粒棘球蚴病患者血清和健康人血清的免疫反应性。结果筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,大小为612 bp,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002。快速免染聚丙烯酰胺电泳和Western blotting分析结果显示重组蛋白rEg-08002在E.coli JM109中获得高效表达,在相对分子质量(Mr)约为23 000处可见重组蛋白rEg-08002条带,主要以包涵体形式存在,r Eg-08002可被感染棘球蚴的小鼠血清识别。ELISA分析结果表明,12份细粒棘球蚴病患者血清和12份健康人血清的平均吸光度(A450)值分别为1.245±0.265和0.469±0.006,差异具有统计学意义(P0.05)。结论筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,获得的重组蛋白rEg-08002具有较好的免疫反应性。     

细粒棘球绦虫抗原B重组蛋白的免疫反应性

目的 利用基因工程方法表达细粒棘球绦虫抗原B重组蛋白（rAgB）,并分析其免疫反应性。 方法 将rAgB基因片段插入原核表达载体pET41a（+）中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）菌株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,获得重组蛋白rAgB-GST。用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析柱（GST-sepharose 4B）纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的表达情况。用蛋白质印迹（Western blotting）分析其免疫反应性,并用免疫胶体金包虫诊断试剂盒作为对照。 结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均显示重组质粒pET41a-rAgB构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白rAgB-GST的相对分子质量（Mr）为40 800,纯化蛋白含量为78.4%。Western blotting分析结果显示,重组蛋白rAgB-GST检测细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者血清的阳性率分别为79.2%（95/120）和51.1%（23/45）,但与卫氏并殖吸虫病患者、华支睾吸虫病患者血清以及健康人血清反应均为阴性。rAgB-GST的敏感性和特异性分别为79.2％（95/120）和81.0%（98/121）,均略高于免疫胶体金棘球蚴病诊断试剂盒的敏感性(72.8%,75/103）和特异性（76.9%,30/39）。 结论 重组rAgB-GST蛋白可被细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者血清识别,有较好的免疫反应性。     

多房棘球绦虫角化蛋白的基因克隆、表达及免疫反应性分析北大核心CSCD

目的克隆表达多房棘球绦虫角化蛋白(EmCNFN)基因,并分析其免疫反应性。方法以细粒棘球绦虫CNFN氨基酸序列为探针,通过电子克隆方法获得EmCNFN基因cDNA全长。设计EmCNFN特异性引物,PCR扩增EmCNFN基因,并进行菌落PCR和测序验证。构建pET32a-EmCNFN原核表达载体,筛选IPTG最适诱导浓度和最适诱导时间进行诱导表达,制备EmCNFN重组蛋白。通过Ni柱层析获取高纯度的EmCNFN重组蛋白。分别用His标签抗体、泡球蚴病患者血清、健康人血清和泡球蚴感染SD大鼠血清、健康SD大鼠血清作一抗,Western blot分析EmCNFN重组蛋白免疫反应性。采用生物信息学软件分析EmCNFN蛋白潜在B、T细胞表位。结果成功获得EmCNFN基因cDNA全长,PCR试验和测序验证其序列正确。优化的IPTG最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最佳诱导时间为8 h。原核表达后通过Ni柱层析,获得了高浓度高纯度的40 ku EmCNFN重组蛋白。Western blot显示,EmCNFN重组蛋白可与His标签抗体、泡球蚴病患者血清和泡球蚴感染SD大鼠血清发生特异性反应。生物信息学软件分析发现,EmCNFN蛋白含有4个潜在B细胞表位,8个潜在T细胞表位。结论成功获得EmCNFN基因cDNA序列,克隆表达、纯化了EmCNFN重组蛋白,该蛋白含有B、T细胞表位,具有免疫反应性,为进一步研究其功能奠定了基础。     

细粒棘球绦虫烯醇酶基因克隆 表达及免疫诊断研究

目的克隆表达细粒棘球绦虫烯醇酶(EgEno)基因,并对其免疫诊断价值进行初步评价。方法从细粒棘球绦虫cDNA中扩增目的基因,克隆入表达载体pET28a,转化E.coliBL21(DE3),经异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,进行SDS PAGE和免疫印迹法鉴定;采用细粒棘球蚴病及其他几种寄生虫病患者的血清和健康人血清,通过ELISA法评价重组EgEno抗原的免疫诊断效果。结果重组质粒pET28a EgEno构建成功。SDS PAGE和免疫印迹法结果显示,重组蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得高效表达,重组蛋白EgEno相对分子量约为50 kDa,可被细粒棘球蚴病患者血清识别。EgEno对细粒棘球蚴病患者血清的免疫诊断敏感性为81.25%。结论克隆出细粒棘球绦虫EgEno基因并在E.coliBL21(DE3)中表达,重组EgEno对细粒棘球蚴病有较好的免疫诊断价值。     

细粒棘球蚴2HSP70重组质粒的构建、原核表达、纯化和初步鉴定

目的构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus，EG）2热休克蛋白70（heat shock protein，2HSPT0）表达重组质粒，原核表达及纯化重组蛋白，并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法从EG2HSP70／pGEM-T／JM109质粒中分离EG2HSP70目的基因，将此片段重组入表达载体pGEX-6P-1后转化入大肠杆菌BL21，鉴定后以IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE检测其表达水平，用亲和层析纯化并分离重组蛋白，利用Western blot来鉴定重组蛋白的免疫学特性。结果酶切鉴定及测序分析表明，成功构建细粒棘球蚴pGEX-6P-1／EG2HSP70重组质粒；IPTG诱导表达后，融合蛋白占菌体总蛋白的39％，占裂解物上清总蛋白的70．4%，表明重组的EG2HSP70基因能在BL21中高效表达，表达的蛋白大部分以可溶性状态存在。亲和层析法纯化重组蛋白EG2HSP70，通过Western blot证实该重组蛋白能被细粒棘球蚴囊壁免疫兔血清识别。结论成功构建细粒棘球蚴中国大陆株pGEX-6P-1／EG2HSP70重组质粒，重组的EG2HSP70能够高效表达，表达的EG2HSP70具有免疫学活性。     

细粒棘球绦虫转酮醇酶克隆 表达及免疫性分析

目的 通过原核表达获得细粒棘球绦虫转酮醇酶（TK）表达产物,分析其作为棘球蚴病诊断抗原分子的价值。方法 PCR扩增TK基因,克隆至原核载体pMD19?EgTK,随后亚克隆至表达载体pET?28a,构建目的基因TK原核表达质粒pET?28a（+）?EgTK,转入大肠埃希菌BL21,分离纯化蛋白,经SDS?PAGE、Western blotting鉴定后,收集细粒棘球蚴病（CE组）、多房棘球蚴病（AE组）患者及健康人（健康组）血清,以酶联免疫吸附试验（ELISA）检测重组蛋白作为诊断抗原的价值。结果 成功构建pET?28a（+）?EgTK质粒,经SDS?PAGE和Western blotting分析,EgTK蛋白在70 kDa处出现条带,与理论值一致。ELISA显示,CE组、AE组和健康组血清反应吸光度A450值间差异有统计学意义（F = 44.47,P < 0.01）,CE组（1.46±0.41）、AE组A450值（1.28±0.29）高于健康组（0.66±0.23）（P ＜ 0.05）,但CE组和AE组间A450值差异无统计学意义（P＞ 0.05）。结论 重组TK分子可较好地区分棘球蚴病患者和非棘球蚴病患者,但无法区分细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者。     

细粒棘球蚴铁蛋白基因的克隆重组高效表达及免疫学初步研究

目的构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosusEg）铁蛋白（ferritin）基因的原核表达重组质粒并表达、纯化该重组蛋白，初步研究其免疫反应。方法将细粒棘球蚴铁蛋白基因亚克隆于表达载体pGEX-6p-1，转化重组体到大肠杆菌B121中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达；用SD争PAGE和Western—blot对表达产物进行初步鉴定，用切胶纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠，通过Western-blot对该蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果重组铁蛋白与GST以融合表达的形式在细菌中高效表达，表达产物为不可溶性的包涵体，蛋白分子量约为42kD。融合蛋白Egferritin／GST能被细粒棘球蚴免疫的家兔血清和特异性小鼠抗血清所识别，同时特异性小鼠抗血清可识别天然抗原囊液、原头蚴可溶性蛋白中约19kD的蛋白条带。结论成功地表达细粒棘球蚴重组铁蛋白，并且该蛋白有一定的免疫原性及抗原性。     

细粒棘球绦虫亲环蛋白基因的克隆 重组表达和生物信息学分析

目的 克隆表达细粒棘球绦虫亲环蛋白 （EgCyP） 基因, 并对其进行生物信息学分析。方法 从细粒棘球绦虫cD? NA中扩增目的基因, 克隆入表达载体pET28a, 转化大肠埃希菌 （E.coli） BL21 （DE3）, 经异丙基?β?D硫代半乳糖苷诱导表达后, 进行SDS?PAGE和免疫印迹试验鉴定, 并对其进行生物信息学分析。 结果 重组质粒pET28a?EgCyP构建成功。SDS? PAGE和免疫印迹试验结果显示, 重组蛋白在E.coli BL21 （DE3） 中获得高效表达, 重组蛋白EgCyP分子量约为22 kDa, 可被细粒棘球绦虫感染犬血清识别。生物信息学分析显示该蛋白具有7个潜在的抗原表位。 结论 成功克隆出细粒棘球绦虫EgCyP基因并在E.coli BL21 （DE3） 中表达, 为进一步研究其免疫原性奠定了基础。     

细粒棘球绦虫核糖体蛋白S9基因克隆鉴定及其在不同发育阶段表达分析

目的克隆鉴定细粒棘球绦虫原头蚴核糖体蛋白S9基因,分析其在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达情况。方法从已构建的cDNA文库挑选基因,克隆EgRPS9基因并对编码产物的理化性质、功能位点、蛋白质的结构和功能域进行预测和分析,通过RealTime-PCR检测RPS9基因在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达情况。结果通过各种生物数据库对EgRPS9基因进行预测并测序,显示该基因具有完整开放阅读框,大小为564bp,编码188个氨基酸,预测分子质量单位为22.0ku,等电点为10.32。SMART保守功能区域分析发现该基因第107~149个氨基酸为40S亚基S9结构域S4超家族。通过多序列比对发现该基因具有较高的保守性,进化树结果表明该基因与曼式血吸虫、日本血吸虫及华氏睾吸虫亲缘关系较近。Real time-PCR检测原头蚴和囊泡RPS9基因相对表达量分别为1.16和1.02,差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功克隆出细粒棘球绦虫40S亚基RPS9新基因,该基因在细粒棘球绦虫不同发育阶段均有表达。     

细粒棘球绦虫丙酮酸脱氢酶的重组表达及生物信息学分析

目的 目的 克隆表达细粒棘球绦虫丙酮酸脱氢酶 （EgPDH） 基因, 并对其进行生物信息学预测与分析。 方法 方法 提取细粒棘球绦虫Total?RNA并反转录成cDNA, 以此为模板扩增目的基因。将目的基因连接至pET28b构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21 （DE3） 进行重组表达。采用SignalP4.1、 TMHMM sever v.2.0和TargetP1.1对EgPDH编码蛋白序列分别进行信号肽、 跨膜区及亚细胞定位的预测。采用SMART分析EgPDH编码蛋白结构域, 用BLASTP和GeneDoc进行EgPDH同源序列比对及保守位点分析, 并采用MEGA6软件邻接法构建系统进化树。 结果 结果 成功克隆并构建重组质粒pET28b? EgPDH, 目的基因大小约1 080 bp, 重组蛋白以可溶性形式表达。EgPDH为信号肽的分泌蛋白, 并含转酮酶结构域, 其高度保守酶活性位点分别为Glu57 、 Leu72 、 Ile86 、 Phe114 。系统进化树分析显示EgPDH与多房棘球绦虫PDH亲缘关系最近。 结 结论 论 成功克隆表达了细粒棘球绦虫EgPDH基因并进行了生物信息学预测分析, 为进一步研究该蛋白功能奠定了基础。     

细粒棘球绦虫TSP11基因在不同发育期的差异表达及生物信息学分析

目的研究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)TSP基因家族TSP11基因的分子特性及其在虫体不同发育期的差异表达,为细粒棘球绦虫疫苗的研发奠定基础。方法从NCBI GenBank数据库中获得TSP11基因序列并设计特异性引物,以Eg原头节RNA为模板进行RT-PCR。将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,通过生物信息学软件分析预测TSP11基因编码蛋白的结构与功能;通过SYBR GreenⅠqRT-PCR检测TSP11基因在虫体原头蚴以及成虫mRNA相对转录情况。结果生物信息学分析TSP11基因全长765个核苷酸,编码蛋白含254个氨基酸,理论等电点为8.91,为稳定蛋白分子。编码TSP11基因的氨基酸序列共含有3个跨膜区域,推测含有7个优势B抗原表位,与已登录的细粒棘球绦虫TSP11序列(XP024352489.1)同源性为99.61%。qRT-PCR显示TSP11基因在原头蚴及成虫阶段均有表达,且表达水平差异无统计学义(P>0.05)。结论成功克隆了细粒棘球绦虫TSP11基因,该基因在Eg原头蚴及成虫期均有表达,其编码蛋白为稳点蛋白,含有B细胞抗原表位,为进一步揭示其分子生物学功能奠定了基础。     

细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的表达及抗原性分析

目的在原核系统表达并初步鉴定细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(EgTPx)基因重组蛋白的抗原性。方法对已构建的重组质粒pMD-18T-EgTPx进行限制性酶切,获取目的基因片段后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-EgTPx,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,对表达产物纯化后用Western-blot方法和ELISA鉴定重组EgTPx蛋白的抗原性。结果构建的重组表达质粒pET30a-EgTPx阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致,测序鉴定无基因突变,开放阅读框正确;含有pET30a-EgTPx重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为27 kDa,而且主要以包涵体形式存在;Western-blot和ELISA结果表明EgTPx重组抗原可以被棘球蚴感染羊阳性血清特异性识别。结论成功构建了pET30a-EgTPx表达质粒,EgTPx重组蛋白得到了高效表达,表达产物具有良好的抗原性。     

细粒棘球蚴转化生长因子βI型受体胞内域原核表达载体的构建及蛋白纯化

目的构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus,Eg）转化生长因子βI型受体胞内域（transforming growth factor—β type I receptor intracellular domain,TβRI—I）原核表达载体,诱导表达并纯化EgTβRI—I蛋白。方法采集感染Eg的羊源原头蚴,Trizol法提取原头蚴总RNA,RT—PCR扩增EgTβRI—I基因片段,克隆至原核表达载体pET28a（＋）,经限制性内切酶双酶切和序列鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌感受态细胞BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,经镍柱亲和层析纯化蛋白,SDS—PAGE检测目的蛋白的表达。结果pET28a—EgβIRI—I原核表达载体构建成功,经IPTG诱导可表达EgTβRI—I蛋白（分子质量单位为48ku）,纯化后获得大量纯度较高的可溶性蛋白。结论成功构建pET28a—EgTβRI—I原核表达载体,并获得纯化的可溶性目的蛋白,为研究EgTβRI—I在Eg体内的生物学作用及其作用方式奠定了基础。     

Short report: Echinococcus granulosus from Xinjiang,PR China: cDNAS encoding the EG95 vaccine antigen are expressed in different life cycle stages and are conserved in the oncosphere

The EG95-based vaccine protects sheep from infection with the dog tapeworm Echinococcus granulosus. The EG95 encoding gene is a member of a multigene family, several members of which are expressed in the oncosphere, believed to be the target of immunity induced by the vaccine. E. granulosus exhibits extensive intraspecific (strain) variation, and variability of the eg95 gene in different isolates of E. granulosus may directly impact the effectiveness of the EG95-based vaccine. We analyzed the eg95 gene from E. granulosus collected in Xinjiang, in northwest China, where hydatid disease is hyperendemic. The gene is expressed in oncospheres, protoscoleces, and immature and mature adult worms, and the eg95 gene family was shown to comprise two basic sequence types. Very limited sequence variation was evident in the EG95 protein from oncospheres. This high degree of sequence conservation predicts that the vaccine will continue to be effective in China and elsewhere.