ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的鉴定

目的构建表达血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因第一内含子中新启动子区的质粒,并研究其功能特征。方法以人基因组DNA为模板,PCR扩增ORMDL3基因第一内含子内新转录起始位点上下游776bp启动子区片段,酶切并连接此片段至pGL3-basic载体,构建含有ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的基因重组体,并转染人胚肾293细胞。荧光素酶检测报告基因启动子的活性,计算相对活性单位。生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果成功构建含有新启动子的重组质粒。与pGL3-basic空载体相比,新启动子活性明显增强,并定位于转录起始位点-363bp至-63bp之间,且该区域存在Sp1、GATA-1等转录因子的结合位点。结论 ORMDL3基因第一内含子中新转录起始位点上游具有启动子活性,在-363bp至-63bp区域存在转录调控元件,且Sp1、GATA-1等转录因子可能参与其转录调控。     

Identification of the new promoter in the fisrt intron of ORMDL3 gene

目的 构建表达血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因第一内含子中新启动子区的质粒,并研究其功能特征.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增ORMDL3基因第一内含子内新转录起始位点上下游776 bp启动子区片段,酶切并连接此片段至pGL3-basic载体,构建含有ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的基因重组体,并转染人胚肾293细胞.荧光素酶检测报告基因启动子的活性,计算相对活性单位.生物信息学方法分析转录因子结合位点.结果 成功构建含有新启动子的重组质粒.与pGL3-basic空载体相比,新启动子活性明显增强,并定位于转录起始位点-363 bp至-63 bp之间,且该区域存在Sp1、GATA-1等转录因子的结合位点.结论 ORMDL3基因第一内含子中新转录起始位点上游具有启动子活性,在-363 bp至-63 bp区域存在转录调控元件,且Sp1、GATA-1等转录因子可能参与其转录调控.     

CD2AP启动子的克隆和活性分析

目的 构建表达CD2AP基因转录起始位点上游启动子的表达质粒,转染人类胚胎肾(HEK)-293T细胞,评价其启动子活性.方法 以人全血细胞总DNA为模板,PCR扩增CD2AP转录起始位点上游2082 bp的启动子区片段.亚克隆此片段至无启动子活性的pGL-3基本载体荧光素酶报告基因上游的多克降位点,构建含CD2AP启动子的重组报告质粒.转染HEK-293T细胞,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 酶切,测序鉴定证实成功构建含有CD2AP基因转录起始位点上游2082 bp的启动区的表达质粒.CD2AP的启动子与正常的pGL-3基本质粒比较,其RLU增加了74.8倍.其上游启动子区序列中含多个转录因子结合序列如AP1、Sp1、CREB和GATA-1等.结论 CD2AP转录起始位点上游序列在HEK-293T细胞中具有较强的启动活性.     

基于双荧光素酶报告基因系统的人源SREBP1基因启动子的活性研究

目的 构建固醇调节元件结合蛋白 1（SREBP1）启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究针对 SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础。方法 利用生物信息学软件,对SREBP1基因5′端上游5 000 bp序 列进行启动子预测与分析。应用 Gibson Assembly 方法构建启动子双荧光素酶载体,并将构建成功的 pGL3- SREBP1-pro重组质粒和内参质粒pRL-SV40共转染肝癌HepG2细胞并给予天然抑制剂大黄素,检测SREBP1转录活 性的抑制效果。结果 SREBP1基因5′端上游2 000 bp区域内有启动子特征序列,存在转录因子结合位点;重组质粒 经酶切及测序鉴定证实为阳性克隆,瞬时转染肝癌HepG2细胞后经双荧光素酶报告基因系统检测,所克隆的片段序 列具有启动子活性,该活性可被大黄素所抑制。结论 成功构建了pGL3-SREBP1-pro双荧光素酶报告基因表达载 体,并证实其活性,可为进一步用于针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定     

apoAⅠ启动子-93 bp～-63 bp片段及-75 bp位点突变对基因转录调控作用的研究

目的：研究载脂蛋白A Ⅰ（apoA Ⅰ）启动子区域-93 bp～-63 bp对基因转录活性的影响,探讨-75 bp位点G→A置换在基因转录中的作用.方法：在人类基因组数据库中截取并下载apoAⅠ基因启动子序列,对照基因图谱人工合成apoAⅠ启动子区域-93 bp～-63 bp片段,-75 bp位点分别为突变型（A）或野生型（G）,进行生物素标记.培养HepG2细胞,提取核蛋白混合物.将核蛋白与标记好的两条DNA链结合,进行电泳迁移率（EMSA）实验,观察两者结合情况.结果：apoAⅠ启动子-93 bp～-63 bp区域可与某种特异性核蛋白转录因子结合.-75 bp位点为G等位基因的探针与含A的探针相比,核蛋白的结合明显增多.同时,竞争抑制实验表明,含G的探针与核蛋白的亲和力高于含A的探针.结论：apoAⅠ基因启动子-93 bp～-63 bp区域通过与核蛋白转录因子的结合参与基因调控,-75 bp位点G→A置换降低与转录因子的亲和力,降低apoAⅠ转录活性从而影响基因表达.     

小鼠干扰素调节因子3启动子质粒的构建及其启动子活性分析

目的构建包含小鼠干扰素调节因子3(mIRF-3)基因启动子的质粒,并评价其启动子活性。方法以小鼠全血细胞总DNA为模板,PCR扩增mIRF-3目的片段,亚克隆此片段至pGL3-basic荧光素酶报告基因的多克隆位点,构建含mIRF-3启动子的重组报告质粒pmIRF-3。将pmIRF-3、pGL3-basic和pGL3-control质粒分别转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU)。生物信息学分析转录因子结合位点。结果成功构建了重组报告质粒pmIRF-3。与pGL3-basic组相比,pmIRF-3、pGL3-control组RLU明显增加(0.443±0.113vs.18.907±3.335、25.704±5.850)(P<0.01)。mIRF-3启动子区域内存在AML-1a、E2F、MZF1、CdxA、OCT-x等多个转录因子结合位点。结论 mIRF-3转录起始位点附近1479bp序列在NIH3T3细胞中具有较强的启动子活性。     

Construction of plasmid containing promoter of mouse interferon regulatory factor 3 and analysis of its promoter activity

目的 构建包含小鼠干扰素调节因子3(mIRF-3)基因启动子的质粒,并评价其启动子活性.方法 以小鼠全血细胞总DNA为模板,PCR扩增mIRF-3目的片段,亚克隆此片段至pGL3-basic荧光素酶报告基因的多克隆位点,构建含mIRF-3启动子的重组报告质粒pmIRF-3.将pmIRF-3、pGL3-basic和pGL3-control质粒分别转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,行荧光素酶 活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 成功构建了重组报告质粒pmIRF-3.与pGL3-basic组相比,pmIRF-3、pGL3-control组RLU明显增加(0.443±0.113vs.18.907±3.335、25.704±5.850) (P＜0.01).mIRF-3启动子区域内存在AML-1a、E2F、MZF1、CdxA、OCT-x等多个转录因子结合位点.结论 mIRF-3转录起始位点附近1479 bp序列在NIH3T3细胞中具有较强的启动子活性.     

载脂蛋白M基因启动子克隆及功能初步研究

目的克隆apoM基因的上游启动子序列,构建启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因,并观察其不同截短片段的启动子活性,为进一步研究apoM基因的表达调控机制奠定基础。方法在对apoM基因生物信息分析的基础上,采用5’RACE确定了apoM基因的转录起始点,构建了6种不同长度apoM基因启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-Basic(A-F),将它们瞬时转染HepG2细胞,并检测其荧光素酶活性。结果 pGL3-Basic-C的荧光素酶活性最高。结论 -401～-621bp可能是apoM的核心启动子区。     

小鼠Gas6启动子的克隆与功能鉴定

目的:探讨软骨分化的负性转录因子Gas6基因启动子调控的分子机制。方法:采用5′RLM-RACE技术克隆Gas6的转录起始位点,利用生物信息学的方法对Gas6潜在启动子区域在小鼠、人与大鼠之间进行同源性比较,对Gas6上游序列进行系列缺失突变,构建Luciferase基因报告载体,转染细胞后检测Luciferase的表达水平。结果:Gas6的转录起始位点为碱基C,在小鼠、人与大鼠之间存在两个高度保守序列A-box与B-box,缺失A-box,B-box的后1/2区域以及NF-Y结合位点后,潜在启动子的转录活性明显下降。结论:A-box,B-box及NF-Y结合位点与Gas6的转录活性有关。     

人多巴胺D2受体基因内含子区51103 T/C多态性对基因转录活性的影响

目的：探讨人多巴胺D2受体(DRD2)基因第3内含子区51103 bp位点单核苷酸多态性(rs2075652)对DRD2基因转录活性的影响,进一步揭示DRD2基因第3内含子区的单核苷酸多态性影响创伤后应激障碍发病风险的分子机制。方法以人全血基因组DNA为模板,扩增DRD2基因第3内含子区序列(399 bp),51103 bp处分别为T或C,与报告基因载体pmirGlo相连接,构建重组荧光素酶表达载体,经限制性内切酶酶切及测序得以鉴定,然后分别与pRL-CMV共转染人胚肾癌细胞株HEK293,检测细胞中荧光素酶的相对表达量。结果双酶切及测序结果证实成功构建重组质粒pmirGlo-T/pmirGlo-C,荧光素酶检测结果显示,当第3内含子区51103 bp位点为C时荧光素酶活性显著高于为T时(P<0．01)。结论成功构建了pmirGlo-T/pmirGlo-C报告基因重组质粒,DRD2基因第3内含子区rs2075652位点由T突变为C后,可能增强基因转录活性,该结果为进一步研究DRD2基因内含子区的功能奠定了基础。     

人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过PCR方法从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5′上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果经PCR方法扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。结论成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础。     

核仁素转录激活子功能研究

目的：研究核仁素的转录激活子作用,探讨CD34^＋分子的基因转录调节机制。方法：分别构建核仁素的表达质粒,以及野生型和含有缺失突变的CD34^＋基因调控区质粒,启动子区下游含有荧光素酶报告基因。这些报告质粒的调控区分别是：①0．8kb野生型CD34^＋基因上游5’端序列;②缺失了127个核苷酸的CD34^＋基因上游5’端序列。应用瞬时转染试验,研究人CD34^＋基因上游5’端的转录特征,分析核仁素对CD34^＋基因的转录调节功能。结果：①含野生型CD34^＋基因上游5’端序列的报告质粒的相对荧光素酶活性约为空质粒pGL3-Basic的3倍;CD34^＋基因上游调控区的活性可被核仁素激活,其相对荧光素酶活性是空质粒的8倍。②CD34^＋基因上游5’端有127nt．缺失的报告质粒的相对荧光素酶活性与空质粒pGL3-Basic的活性相同,且与核仁素表达质粒共转染细胞时,其相对荧光素酶活性没有变化。结论：核仁素对CD34^＋基因起转录激活作用。CD34^＋基因上游5’端自-470nt．至-344nt．的区域对CD34^＋基因的表达具有重要意义。     

Potent Intradermal Gene Expression of Naked Plasmid DNA in Pig Skin Following Pyro-drive Jet Injection

Intradermal administration of naked DNA with a conventional needle syringe is a simple and inexpensive method to expose an encoded antigen to the dermal immune system. We aimed to enhance intradermal gene expression with a pyro-drive jet injector using pig skin, which is similar in structure and biomechanical properties to human skin. When Cy3-labeled plasmid (pCy3) was applied to pig skin with the jet injector, pCy3 was distributed preferentially in the intradermal tissue. Precise localization analysis revealed that pCy3 was also detected in the intracellular nucleus, and the frequency was substantially higher with the jet injector than with a needle syringe. When a luciferase expression plasmid (pLuc) was injected transdermally, the luciferase activity was 380-fold higher with the jet injector than with a needle syringe. Furthermore, immunohistochemistry analysis showed that the epidermis was positive for luciferase protein expression. These data indicate that the jet injector facilitates stable intradermal administration, resulting in more efficient gene expression compared to that with conventional syringe methods. Thus, intradermal administration of an antigen-expression plasmid with the pyro-drive jet injector may provide a clinically viable method for future gene therapy.     

雌激素/雌激素受体α信号通路抑制血管平滑肌细胞SM22α的转录作用

目的确定雌激素/雌激素受体α(ERα)信号通路对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)分化标志基因SM22α的转录调节作用。方法利用组织块贴壁法分离获得大鼠VSMCs,采用PCR方法扩增获得大鼠SM22α,并插入到pGL3-Basic质粒中构建SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒。分别在VSMCs和COS-7细胞中利用Lucif-erase检测雌二醇(E2)、ERα及Myocardin对SM22α启动子转录活性的影响情况。结果 SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功,E2、ERα可以抑制Myocardin对SM22α的转录活性。结论 E2/ERα信号通路可通过抑制Myocardin对SM22α的转录活性,从而促进VSMCs由分化型向增殖型转变。     

A facile and effective screening method for p21WAF1 promoter activators from microbial metabolites.

We have developed a novel p21WAF1 promoter activator screening system based on rapid and facile luciferase activity assay of a model cell system (H1299/tsp53-luc cells), a stable luciferase expression cell line established by transfecting H1299/tsp53 cells with a reporter gene construct pWWP-Luc-BSD. This plasmid was constructed by subcloning the 2.4 kb p21WAF1 promoter and a 2.6 kb of luciferase cDNA fragment activated by the p21WAF1 promoter into a pMAM2-BSD expression vector containing the blasticidin S deaminase gene (BSD). A BSD-resistant clone H1299/tsp53-luc#4, showing the highest response to p53 activation (by temperature shift from 37 degrees C to 32 degrees C) by luciferase production, was used for screening microbial culture broths. Among approximately 1200 screened samples, trichostatin A related compounds and a new compound, lucilactaene, were isolated. This provides an effective and facile screening system for p21WAF1 promoter activators which should be of considerable value in the rapid identification of new anticancer agents.     

肝癌细胞MAT2A基因小干扰RNA靶位筛选体系的建立

目的:构建M AT 2A基因的小干扰RNA(siRNA)快速筛选体系,筛选出有效的小干扰RNA。方法:首先构建能产生M AT 2A基因小干扰RNA的质粒表达载体,细胞内转录合成4条小干扰RNA;然后构建M AT 2A基因与荧光素酶报告基因(luciferase)的融合质粒表达载体p lucF-M AT 2A;采用脂质体转染法将p lucF-M AT 2A与产生siRNA的质粒共转染293T细胞,定量测量荧光素酶活性,构建M AT 2A基因的小干扰RNA筛选体系,初步筛选出抑制荧光素酶表达的有效siRNA;然后将有效的siRNA转染Bel-7402肝癌细胞,半定量RT-PCR检测M AT 2A mRNA表达,并检测转染后肝癌细胞M AT的活性,进一步证实siRNA对M AT 2A表达的抑制效果。结果:所合成的4条小干扰RNA中有2条抑制荧光素酶表达,抑制效率分别为81%和89%,并特异性抑制肝癌细胞M AT 2A mRNA表达,降低了肝癌细胞中M AT活性。结论:通过荧光素酶报告体系来检测siRNA有效性的方法为RNA i研究提供了一个快速有效地筛选小干扰RNA的途径。