半乳糖结合位点封闭式免疫毒素的制备及其特性

近年来发现蓖麻毒素中B链除具有细胞结合作用外,还有促进A链杀伤效应的功能。作者用完整蓖麻毒素制备B链半乳糖基结合位点封闭的胃癌McAb免疫毒素,发现这种免疫毒素对胃癌细胞具有高度选择性杀伤作用;由于这种免疫毒素的作用较A链免毒疫素增强,故认为免疫毒素中B链的存在有助于增强A链的细胞杀伤作用。     

单克隆抗体-蓖麻毒蛋白A链导向杀伤大肠癌细胞的研究

本研究从湘西野生蓖麻籽中提取了两种植物毒蛋白ricin Ⅰ、ricin Ⅱ,其分子量分别为65、67KD,LD_(50)分别为0.20、0.24ug/小鼠。用本室制备的抗大肠癌单克隆抗体Hb_3作为导向载体,与蓖麻毒蛋白A肽链交联,制备杂交分子Hb_3—RTA。SDS—PAGE分析表明,每个Hb_3上平均结合4.9个RTA。初步细胞毒试验显示,交联物Hb_3—RTA对大肠癌细胞HRT-18具有较强杀伤作用,而对正常人淋巴细胞杀伤作用较小。     

流式细胞术快速测定逆转录病毒滴度的研究

目的　建立一种快速测定逆转录病毒滴度的方法。方法　用通过乒乓转导获得的逆转录病毒 (G1FP ,LGSN ,CD87)分别感染NIH 3T3受体细胞 ,以流式细胞术 (FCM )定量分析受体细胞中绿色荧光蛋白 (EGFP)或CD87的表达 ,并与常规的耐药集落形成法进行比较。结果　PT6 7/G1FP细胞高度表达EGFP ,荧光强度较对照细胞提高 10 5 1倍 ;G1FP - 8,Am12 /G1FP ,PT6 7/G1FP ,Am12 /LGSN和Am12 /CD87细胞上清中病毒滴度分别为 2 .9× 10 6,1.1× 10 5,2 .0× 10 6,1.5× 10 5和 4.3× 10 5感染性颗粒 /ml,比集落形成法测得的滴度低 3～ 6倍。结论　FCM分析抗原表达是测定逆转录病毒滴度的有效方法 ,特别适宜于缺乏选择性基因的载体。     

快速简便提取蓖麻毒素

蓖麻毒素是免疫毒素的重要组成之一.本文研究蓖麻毒素的提取,从蓖麻籽匀浆中直接制备粗毒,根据蓖麻毒素能与Sepharose—6B上的半乳糖残基结合,然后分别用Tris—HCl洗去杂蛋白和Tris—HCl半乳糖溶液梯度洗脱,得到完整的毒性很强的蓖麻毒素,在体内外杀伤靶细胞时用乳糖或半乳糖封闭B链的半乳糖结合部位大大简化了工艺.     

融合蛋白EGF-TCS的纯化及体外靶向杀伤肿瘤细胞的研究

目的 在大肠杆菌中表达并纯化EGF-TCS融合蛋白,观察该融合蛋白对肿瘤细胞的靶向选择性杀伤作用.方法 将重组表达质粒PQE30/EGF-TCS转化至大肠杆菌M15中,表达该融合蛋白(EGF-TCS).产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化;用流式细胞仪检测肿瘤细胞株和正常肝LO2细胞株的EGFR表达量;进行细胞杀伤实验,验证EGF-TCS的选择性杀伤能力;用流式细胞仪检测细胞凋亡的方法进一步考察EGF-TCS的靶向选择性杀伤能力,并用电镜观察细胞形态.结果 重组表达质粒PQE30/EGF-TCS在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达,表达上清柱纯化纯度达95%以上;肝癌BEL-7402细胞表面EGFR表达量最高(72.33%),正常肝LO2细胞表面EGFR表达量最低(5.51%),重组的融合蛋白对肿瘤细胞具有较大的杀伤能力(BEL-7402、MCF-7和BGC-823的IC50分别为11.40、22.47、12.53 μg/ml),对正常细胞的杀伤能力微弱(IC50为53.19 μg/ml).结论 应用基因工程技术,成功构建了融合蛋白EGF-TCS,该融合蛋白可明显促进肿瘤细胞的凋亡.     

益气解毒片对鼻咽癌细胞端粒酶和端粒酶RNA抑制作用的实验研究

为研究益气解毒片对鼻咽癌细胞端粒酶和端粒酶RNA的影响,先用MTT法检测其杀伤鼻咽癌细胞(HNE1)的半抑制浓度(IC50),再用10×IC50、1×IC50、0.5×IC50作用HNE1 12 h、24 h、48 h、72 h、96 h,然后检测HNE1端粒酶(Telomerase)活性和端粒酶RNA的表达.结果:10×IC50作用HNE1 24 h,端粒酶活性下降为阴性,同时端粒酶RNA的表达受到抑制;1×IC50作用后,端粒酶活性稍有下调,但端粒酶RNA表达无明显改变;0.1×IC50作用后,端粒酶活性没有明显变化,但低于白空对照组.这提示较高浓度益气解毒片在体外能抑制端粒酶的活性和端粒酶RNA表达,可能通过对鼻咽癌细胞及其端粒酶的活性抑制而发挥抑瘤效应.     

中药益气解毒颗粒下调端粒酶活性抑制鼻咽癌细胞的生长

目的研究益气解毒颗粒对鼻咽癌细胞端粒酶(Telomerase)活性的影响。方法先用MTT法检测益气解毒颗粒杀伤鼻咽癌细胞系(HNE1)的半抑制浓度(IC50),再用10×IC50,1×IC50,0.5×IC50作用HNE1 12,24,48,72和96 h,然后检测HNE1端粒酶活性;将HNE1接种至BABL/C裸鼠,制备鼻咽癌细胞系裸鼠移植瘤,灌喂中药益气解毒颗粒药液,观察其在体内对鼻咽癌细胞端粒酶活性的影响。结果益气解毒颗粒体外杀伤鼻咽癌细胞的IC50为6.625 mg/mL,10×IC50作用HNE1端粒酶活性下降为阴性(<0.20);1×IC50作用后,端粒酶活性(0.47±0.11)稍有下调,0.1×IC50作用后,端粒酶活性(0.78±0.17),低于空白对照组(1.20±0.23)。灌喂益气解毒颗粒组移植瘤生长受到明显的抑制,抑瘤率为(83.20±7.56)%,端粒酶活性为(0.37±0.10),明显低于对照组(0.89±0.27)。结论益气解毒颗粒在体外和体内均能抑制端粒酶的活性,可能是通过对鼻咽癌细胞端粒酶的活性抑制而发挥抑瘤效应。     

人源化免疫毒素的研究进展

免疫毒素是通过化学连接或基因融合的方法将细胞选择性配体与毒素分子相连组成的嵌合体蛋白,它能够靶向肿瘤细胞高表达的肿瘤相关抗原、膜受体和糖蛋白。尽管以细菌毒素或植物毒素为基础的免疫毒素显示出良好的应用前景,但细菌毒素和植物毒素的免疫原性和非特异的细胞毒性等因素,阻碍了它们在临床上的应用。针对这些问题,以人源蛋白如促凋亡蛋白与RNA酶为毒素部分的新一代免疫毒素被研发出来,本文对此类人源化免疫毒素的体内外实验研究进展进行综述。     

人胎盘来源的金属蛋白酶抑制因子—3的分离纯化及性质研究

目的首次从人胎盘中分离纯化了天然型TIMP-3,并建立了TIMP-3酶联免疫测定方法.方法人胎盘来源的TIMP-3的纯化,首先利用4MoI/L尿素Tris缓冲液(pH8.0),在除去多数水溶性蛋白的胎盘匀浆液中提取难溶性蛋白,然后经过CM52阳离子交换树脂和SephacrylS-200凝胶过滤二步柱层析.结果SDS聚丙酰胺凝胶电泳显示最后分离结果,分别为27KD和24KD的两务蛋白带.Westemblotting结果表明,分子量为27KD蛋白为N末端糖化的TIMP-3、分子量为24KD的蛋白为非糖化的TIMP-3、两者的比例约为13.对比尿素抽提液TIMP-3的纯化产率为24%,纯化倍数约为3200倍.结论纯化的天然型TIMP-3对MMP-1有明显的抑制活性.非糖化的TIMP-3IC50为1.1×10-10M,糖化的TIMP-3IC50为1.2×10-10M,显然比重组TIMP-3对MMP-1的抑制活性要高许多(rTIMP-3的IC50为1.2×10-8M).研究表明,TIMP-3对某些肿瘤转移有明显的抑制效应.此项研究对进一步阐明MMPs和TIMPs在机体内平衡关系的改变对肿瘤浸润转移的影响作用有着重要的意义.     

异种黑色素瘤相关抗原诱发抗肿瘤免疫伴发自身免疫性损伤

目的探讨腺病毒载体(Ad)介导异种黑色素瘤相关抗原酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)诱发抗肿瘤免疫与自身免疫性损伤的关系。方法用Ad编码的人或小鼠TRP2(AdhTRP2或AdmTRP2)皮内免疫C57BL/6小鼠,将小鼠分为正常对照组(d1703)、AdhTRP2和AdmTRP2免疫组。体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤试验和细胞内干扰素γ(IFNγ)染色(ICS)分析CTL杀伤活性和IFN-γ的产生(每组3只小鼠);皮下接种B16.F10黑色素瘤细胞(每组10只小鼠),观察荷瘤小鼠成活情况。结果AdhTRP2诱发小鼠CTL杀伤活性与免疫时间相关,免疫后1周活性达到最大,随后逐渐降低;AdhTRP2诱导的CTL杀伤活性具有剂量效应关系。AdhTRP2免疫小鼠1周其6hCTL杀伤率为94%±5%,脾脏产生IFNγ的CD8+T细胞占总CD8+T细胞的0.87%±0.12%,而相应地AdmTRP2分别为22%±8%和0.15%±0.05%。接种1×106B16.F10细胞,AdhTRP2免疫的小鼠观察3个月100%无瘤生长,但在病毒注射部位有白癜风形成;而接种1×105B16.F10细胞的AdmTRP2免疫小鼠3个月只有20%的成活率,并不伴局部白癜风形成。结论用Ad介导异种TRP2能有效地打破对自身TRP2的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,同时伴发自身免疫性损伤。     

抗肝癌单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40的构建及其导向作用的实验研究

目的构建单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40并探讨其导向细胞毒作用.方法采用亚克隆技术,首先将HAb25(scFv)与绿脓杆菌外毒素基因突变子PE40,在ply5载体上构建HAb25(scFv)-PE40单链免疫毒素基因;再将其亚克隆入pBV220原核表达载体中, 转化DH5α宿主菌,温度诱导表达;SDS-PAGE观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化方法;间接免疫荧光染色鉴定HAb25(scFv)-PE40与肝癌细胞结合的特异性;体外导向细胞毒实验明确其是否具有选择性靶细胞杀伤活性.结果限制性酶切图谱和序列分析证实在ply5载体上成功地构建了HAb25(scFv)-PE40单链免疫毒素基因;该单链免疫毒素基因在pBV220载体中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的43.3%;纯化后的HAb25(scFv)-PE40间接免疫荧光染色显示具有与亲本抗体HAb25相同的抗原结合特性;导向细胞毒实验结果显示HAb25(scFv)-PE40具有明确的选择性靶细胞杀伤活性. 结论已成功构建和高效表达了单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40,该免疫毒素有选择性地杀伤靶肝细胞的生物活性 (P＜0.001),为其进一步的基础和临床应用研究奠定了基础.     

重组集成干扰素α体外抗病毒的药效学研究

目的：观察一种新型重组集成干扰素α(NIFN con α)对流感病毒甲型和乙型、单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型、柯萨奇病毒B1和B3的抑制作用。方法：应用细胞病变抑制法，以已上市的重组集成干扰素α(干复津)及干扰素α作为阳性对照，观察不同浓度的NIFN con α对不同病毒感染绿猴肾细胞(Vero)和狗肾细胞(MDCK)的抑制作用。结果：NIFN con α对MDCK细胞和Vero细胞的TD50分别为(>250±0)μg/ml和(>192±0)μg/ml。对单纯疱疹Ⅰ型和Ⅱ型病毒的IC50分别是(2.8×10-4±8.5×10-5) 和(1.8×10-4±8.5×10-5)μg/ml；对柯萨奇病毒B1和B3的IC50分别是(8.8×10-8±1.4×10-8)和(1.5×10-7±4.2×10-8)μg/ml，抑制流感病毒甲型和乙型的IC50分别是(2.5×10-2±1.2×10-2)和(＞10±0)μg/ml。结论：NIFN con α与干复津一样对单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒和流感病毒均具有明显的抑制作用，与干扰素α相比，对流感病毒的抑制作用较弱，但对单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒的抑制作用优于干扰素α。     

肿瘤继承性免疫治疗的进展——LICC的抗癌作用

迄今为止,通过研究并在体外证明对肿瘤细胞有细胞毒性或用来转输进行继承性免疫的细胞大约有5类:1.细胞毒性T细胞(CTL)。需抗原或有丝分裂原预先致敏,其杀伤作用具有特异性,系直接和靶细胞接触,引起靶细胞膜损伤,但杀伤效应受MHC的限制。2.NK细胞。不需任何处理即能直接杀伤肿瘤细胞,但仅对少数NK细胞敏感的肿瘤细胞有效,且选择性差,也能杀伤正常细胞,杀伤作用无特异性,如用白细胞介素或干扰素处理,可加强其杀伤活性,扩大靶细     

抗CD3、CD7单抗-PAPs免疫毒素的构建及其联合杀伤效应

[目的]应用抗人T淋巴细胞单抗(抗CD3和抗CD7),分别与商陆抗病毒蛋白(PAPs)偶联构成两种免疫毒素,并探讨这两种免疫毒素在体外联合对T淋巴细胞和T淋巴母细胞(CEM细胞)的杀伤效应。[方法]选用抗CD3和抗CD7杂交瘤细胞制备单克隆抗体腹水,经纯化后以SPDP为交联剂,将两种单抗分别与商陆抗病毒蛋白偶联构建成抗CD3和抗CD7单抗免疫毒素;分别以及联合后对T淋巴细胞和CEM细胞进行体外细胞毒试验。[结果]构建的两种单抗-PAPs免疫毒素活性良好,其特异性杀伤T淋巴细胞和T淋巴母细胞CEM细胞的效应比单一抗CD3-PAPs和抗CD7- PAPs更强,对照组仅有轻微的杀伤效应。[结论]成功地构建了抗 CD3和抗 CD7单抗-PAPs免疫毒素,及其不同抗原决定簇的单抗免疫结合物,并证明联合应用抗CD3-PAPs和抗CD7-PAPs免疫毒素有相加的杀伤效果。     

半乳糖结合位点封闭免疫毒素的研制及其杀伤活性

作者报道B链半乳糖结合位点封闭的蓖麻毒素-胃癌单克隆抗体MGb_2结合物的制备及其细胞毒特征。首先将引入碘乙酰基团的毒素与引入巯基的抗体反应,得到的结合物通过琼脂糖亲和层析柱除去仍保留半乳糖结合能力的部分。细胞毒性试验结果表明,结合物对肿瘤靶细胞具有较强的选择性杀伤作用,在1.0×10~(-11)mol/L水平,对人胃癌细胞KATOⅢ的杀伤率为46％,优于MGb_2-蓖麻毒素A链结台物(12％),而对非靶细胞作用很弱,在1.0×10~(-9)mol/L水平对正常人胚肺细胞SL_7杀伤率仅为42％,无需半乳糖拮抗。     

含天花粉蛋白的抗人大肠癌免疫毒素制备及其细胞毒性研究

用异型双功能连接剂ＳＰＤＰ，将核糖体抑制蛋白一天花粉蛋白（ＴＣＳ）共价连接在单克隆抗体ＮＤ－１上，制成免疫毒素，此单抗与人大肠癌细胞表面抗原一大分子表面抗原（ＬＥＡ）有高度亲合能力。连接物ＮＤ－１－ＴＣＳ用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０分子筛层析纯化。间接免疫荧光试验结果表明，ＮＤ－１－ＴＣＳ保留了较高的抗体活性。体外细胞毒性试验表明，ＮＤ－１－ＴＣＳ对人大肠癌细胞ＣＸ－１的ＩＣ＿（５０）。为０．３６μｇ／ｍｌ．细胞毒性ＮＤ－１和ＴＣＳ混合物高１０倍。ＮＤ－１－ＴＣＳ对人大肠癌细胞的细胞毒性比非抗原携带细胞ＳＰ＿（２／０）高６０倍。此免疫毒素在人大肠癌的治疗方面有应用前景。     

芸香苷诱导K562细胞凋亡机制

目的研究芸香苷诱导白血病K 562细胞凋亡过程中caspase-3基因及细胞色素C的表达。方法体外培养白血病K 562细胞,M TT法观察细胞毒作用,测定IC50,Hoechst 33342/P I双荧光染色后,荧光显微镜下观察细胞核形态,流式细胞仪检测细胞周期,TR IZOL试剂提取K 562细胞RNA,核酸定量仪检测纯度,RT-PCR扩增,紫外透射检测扩增产物,扩增产物测序,观察caspase-3的表达,4×1-0 5m o l/L药物处理细胞后,分离细胞线粒体和胞浆,经SDS-PAGE电泳分离蛋白,W estern b lotting检测线粒体、细胞浆细胞色素C表达。结果芸香苷浓度为2×1-0 5、4×10-5、8×10-5m o l/L时,细胞生长受到显著抑制,并呈剂量依赖性;不同浓度芸香苷处理K 562细胞44h后,应用M TT比色法计算IC50为4×1-0 5m o l/L;4×10-5m o l/L芸香苷处理细胞24 h后,Hoechest 33342/P I双荧光染色可观察到明显核固缩、凝集等细胞凋亡表现;流式细胞仪检测芸香苷处理后G2期细胞显著增多(64.7%),DNA合成受抑,凋亡率增加;PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪下明显观察到500 bp条带,产物经过序列测定证实芸香苷处理细胞诱导caspase-3基因的表达;W estern B lotting检测线粒体细胞色素C表达水平下调,细胞浆出现明显细胞色素C蛋白条带。结论芸香苷诱导K 562细胞caspase-3基因表达,细胞色素C通过线粒体膜进入胞浆,导致细胞线粒体功能异常,细胞发生凋亡,线粒体途径诱导白血病细胞凋亡是其作用机制之一。     

免疫毒素BDI-1-PEA膀胱灌注预防膀胱癌术后复发的临床研究

目的　应用新型免疫毒素BDI- 1-PEA膀胱灌注 ,探讨其对预防人膀胱癌术后复发的作用。方法　 12例膀胱移行细胞癌术后患者应用 10 0倍半细胞致死剂量浓度 (1× 10 - 7mol L)抗人膀胱癌免疫毒素BDI- 1-PEA5 0ml行膀胱内灌注 ,药物在膀胱内保留 1h后排出 ,每周灌注 2次 ,10次为一疗程。同期随机 8例膀胱移行细胞癌术后患者应用丝裂霉素 2 0mg膀胱灌注作为对照 ,每周灌注 1次 ,8次后改为每月 1次 ,10次为 1疗程。每 3个月复查膀胱镜或B超检查。结果　免疫毒素组用药后随访 7～ 16个月 ,平均 12个月 ;12例病人均无复发 ,多次膀胱镜检查未见异常。丝裂霉素组随访 9～ 15个月 ,平均 11个月 ;2例复发。结论　免疫毒素BDI- 1-PEA对预防膀胱癌术后复发有较好疗效。     

M290-SAP在同种胰岛移植中的应用

传统的抗CD103单克隆抗体M290不能在体内有效的杀伤CD103阳性细胞,为了解决这个难题,我们用异（基）双功能试剂SPDP通过双硫键将单链核糖体失活蛋白saporin结合到抗CD103单克隆抗体从而构建免疫毒素M290-SAPPORIN。M290-SAPPORIN的免疫反应性和特异性与未修饰的M290单克隆抗体一致。在本研究中,我们证明M290-SAPPORIN能有效的杀伤小鼠体内CD103表达细胞。我们进一步证明,无论是化学药物诱导的糖尿病小鼠还是自发性糖尿病NOD小鼠,单次应用M290-SAPPORIN均能有效促进组织相容性抗原完全不同的胰岛移植物存活。胰岛移植物的延长存活与应用M290-SAPPORIN后胸腺的萎缩和受体CD8 淋巴细胞低反应性相关。总之,不论潜在的机制如何,这些资料证明：在胰岛移植中,应用M290-SAPPORIN是一种可行的治疗性干预手段。     

MicroRNA 122促进吉西他滨对体外非小细胞肺癌细胞系A549的杀伤作用

目的 探讨microRNA 122（miRNA122）对细胞毒性化疗药吉西他滨对体外杀伤非小细胞肺癌细胞株的影响.方法 利用脂质体转染miRNA122的表达载体;CCK-8测定系列浓度梯度吉西他滨检测对非小细胞肺癌细胞株A549的抑制率,计算IC50值;平板克隆实验检测吉西他滨对A549细胞杀伤的影响;流式细胞仪-Annexin/PI双染实验检测吉西他滨诱导A549细胞凋亡率.结果 吉西他滨对A549细胞具有明显地体外杀伤作用,其IC50值为（78.65±5.25）nmol/L,转染miRNA122能够上调吉西他滨的活性,其IC50值为（10.26±1.18）nmol/L;流式细胞术结果显示：A549细胞凋亡率诱导转染空载体组为26.24％±1.94％,诱导转染miRNA122组为63.30％±3.96％.miRNA122能够显著上调吉西他滨诱导A549细胞凋亡率.RT-PCR和蛋白印迹实验表明,转染miRNA122能够显著上调A549细胞内miRNA122的表达水平,降低miRNA122靶基因和调控基因的表达水平.结论 miRNA122能够上调吉西他滨对非小细胞肺癌细胞系A549的体外杀伤作用.