氯化钴对RNA干扰食管鳞癌细胞HIF-1α基因表达及功能的影响

目的研究氯化钴模拟缺氧对RNA干扰的缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因表达及功能的影响，观察在人食管鳞癌细胞系Eca-109中RNA干扰抑制HIF-1α的效果。方法选择4组细胞分别为食管癌Eca-109细胞和3株稳定转染HIF-1αSiRNA的Eca-109细胞（本实验室编号分别为H2／14号、H3／15号、H2／20号细胞），分别用200、400、600、800μmol／L氯化钴模拟缺氧，缺氧培养时间分别为12、24．48、72h，采用Western印迹和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIF—1α蛋白及mRNA表达，同时Western印迹检测血红素加氧酶（HO-1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、葡萄糖转运体-1（Glut-1）、P53等相关基因的表达。结果4组细胞HIF-1α蛋白表达均随氯化钴浓度加大而增加，常氧与400μmol／L氯化钴处理24h后筛选出H3／15号细胞HIF-1α蛋白表达最少，与其它3组相比差异有统计学意义（P〈0．05），mRNA检测差异无统计学意义；干扰细胞常氧下HO-1、MMP-2、Glut-1、P53表达不同程度减少，缺氧后HO-1、P53表达增加，MMP-2、Glut-1表达无明显变化。结论RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达，从而不同程度减少HO-1、MMP-2、Glut-1、P53等相关基因表达；经氯化钴模拟缺氧筛选出干扰效果较好的一株细胞，为进一步研究HIF-1α的功能奠定了基础。     

常氧下高低浓度葡萄糖培养对不同密度肝癌HepG2细胞HIF-1α、HIF-2α表达的影响

目的观察常氧下高低浓度葡萄糖对不同浓度肝癌HepG2细胞缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、HIF-2α表达的影响。方法将HepG2细胞分成高中低三个细胞密度组,常氧下分别在高糖和低糖DMEM中培养16h,采用免疫细胞化学法检测各组HepG2细胞中的HIF-1α和HIF-2α。结果常氧下高糖培养,高、中、低密度组HepG2细胞中HIF-1α的光密度值分别为0．270±0．014、0．318±0．015、0．052±0．012,常氧下低糖培养分别为0．300±0．012、0．242±0．015、0．205±0．018。三组间比较,P均〈0．05。常氧下高糖培养,高、中、低密度组HepG2细胞中HIF-2α的光密度值分别为0．076±0．013、0．175±0．011、0．310±0．014,常氧下低糖培养分别为0．120±0．017、0．1874-0．014、0．347±0．015。三组间比较,P均〈0．05。结论常氧下低糖培养能诱导HepG2细胞中的HIF-1α、HIF-2α高表达;HIF-1α在适中的细胞密度下表达最强,HIF-2α的表达随着细胞密度的增加而降低。     

谷胱甘肽S转移酶-π与人肝细胞耐砷性关系的研究

目的探讨谷胱甘肽S转移酶-π（GST-π）在人胚肝细胞（L-02细胞）耐砷性中的作用。方法培养L-02细胞和耐砷L-02细胞,用实时PCR和免疫组织化学法检测细胞GST-π mRNA和蛋白表达情况;两种细胞均采用亚砷酸钠（NaAsO2）2．5、5．0、10mmol／L及NaAs02与GST-π抑制剂依他尼酸（EA）联合培养24h,噻唑蓝（MTT）法和石墨炉原子吸收光谱法检测细胞生存率和细胞内砷浓度。结果耐砷L-02细胞GST-π mRNA及蛋白表达阳性率均显著高于L-02细胞（P〈0．001）;单用NaAsO2培养时,耐砷L-02细胞生存率明显高于L-02细胞、砷浓度明显低于L-02细胞（P〈0．001）;NaAsO2与EA联用时两种细胞内砷浓度增加、细胞存活率降低（P〈0．001）。结论L-02细胞的耐砷性可能与GST-π基因高表达有关,此从基因水平上为砷中毒的防治提供了实验依据。     

缺氧诱导因子-1α在胰腺癌中的作用

目的:探讨缺氧环境下胰腺癌细胞胰腺癌肿瘤细胞株SW1990中缺氧诱导因子HIF- 1α、血管生长因子VEGF、葡萄糖转运体GLUT1、和耐药基因MDR1的变化,并阐明其中可能存在的分子调控机制．方法:将胰腺癌肿瘤细胞株SW1990分为常氧组和化学诱导缺氧组(CoCl2诱导),分别采用RT-PCR方法和Western blot方法观察两组HIF- 1α、VEGE、GLUT1及MDR1基因和蛋白的表达;再分别将两组分为对照组、空白质粒转染组和HIF-1α/PCDNA3．0质粒转染组,观察上述因子的基因和蛋白水平表达的变化．结果:化学诱导的缺氧能明显诱导细胞HIF- 1α蛋白的表达(P=0．0089),但对其mRNA的表达没有明显影响(P=0．057);缺氧时胰腺癌肿瘤细胞株SW1990中的VEGF(P=0．046, 0．039)、GLUT1(P=0．0024,0．036)、MDR1(P =0．021,0．038)基因和蛋白的表达水平都明显增高．转染质粒的缺氧组与常氧组相比,HIF- 1α、VEGF、GLUT1、MDR1的基因与蛋白水平都相应的有所增高．结论:缺氧时,胰腺癌细胞通过上调HIF-1α的表达引起其下游的靶基因VEGF、GLUT1和MDR1的表达,从而耐受缺氧并进一步恶性进展．     

低氧对人喉鳞癌Hep-2细胞凋亡的影响及其机制探讨

目的 观察低氧对人喉鳞癌Hep-2细胞凋亡的影响,并探讨其机制.方法 将体外培养的人喉鳞癌细胞分为常氧组、低氧组.流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR及Western blot法分别检测各组细胞低氧诱导因子α（HIF-1α）、赖氨酰氧化酶（LOX）mRNA及蛋白.结果 常氧组细胞凋亡率13.86％±0.12％、低氧组5.13％±0.67％,P≤0.05.与常氧组比较,低氧组细胞中HIF-1 α、LOX蛋白及其mRNA表达增加（P均≤0.05）,且二者表达呈正相关（r均为0.862,P均≤0.05）.结论 低氧可抑制Hep-2细胞凋亡,该作用可能与其上调细胞中HIF-1α、LOX表达有关.     

食管鳞癌细胞系EC-109中缺氧诱导因子-1α的表达意义

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在食管鳞癌细胞系EC-109中的表达及其意义.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot分别检测HIF-1αmRNA和蛋白在常氧及缺氧状态下在食管鳞癌EC-109细胞中的表达.结果:HIF-1αmRNA在缺氧食管鳞癌EC-109细胞中过表达(P<0.05),在缺氧24h时HIF-1αmRNA表达最高,其后随时间延长表达下降;HIF-1α蛋白水平在缺氧食管鳞癌EC-109细胞中无明显上调(P>0.05).结论:低氧可诱导食管鳞癌EC-109细胞中HIF-1αmRNA的过度表达,缺氧状态下HIF-1α蛋白水平较常氧时无明显增加.     

甲基莲心碱对人卵巢癌顺铂耐药逆转的体外研究

目的研究甲基莲心碱（Nef）在人卵巢癌耐药细胞SKOV3／顺铂（DDP）对DDP敏感性中的作用,初步探讨其化疗增敏的作用机制。方法采用MTT比色法筛选Nef对细胞株的无毒剂量,并测定Nef干预后SKOV3／DDP对DDP耐药性的变化;免疫细胞化学法检测Nef对SKOV3／DDP细胞GST-π竹蛋白表达的影响;RT—PCR法分析Nef作用SKOV3／DDP细胞株不同时间GST-π mRNA水平表达的差异。结果不同浓度DDP与Nef联合应用使DDP对SKOV3／DDP细胞IC50明显下降,且逆转倍数随药物作用时间延长而增大,24h、48h、72h分别为1．15、1．91、2．28倍（P〈0．01）;镜下SKOV3／DDP细胞较SKOV3细胞高表达GST-π,经Nef作用72h后其GST-IT表达明显下降（P〈0．01）;无毒剂量Nef作用1、3、5d后SKOV3／DDP细胞内GST-π mRNA转录水平随作用时间延长而降低（P〈0．01）。结论Nef能有效逆转SKOV3／DDP细胞的耐药性,其逆转机制可能与下调GST-π基因高表达有关。     

吡格列酮对缺氧复氧大鼠心肌细胞凋亡及低氧诱导因子1α的影响

目的观察吡格列酮对缺氧复氧大鼠心肌细胞凋亡的保护作用,并探讨吡格列酮对低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达的影响。方法原代培养的SD乳鼠心肌细胞随机分为4组：溶媒组、缺氧复氧＋溶媒组、缺氧复氧＋吡格列酮0．1μM组、缺氧复氧＋吡格列酮1μM组,建立缺氧复氧模型,利用Annexin—v与PI双染法及流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,RT—PCR及Westernblot方法检测HIF-1αmRNA及蛋白表达的变化。结果缺氧复氧后,溶媒组心肌细胞发生明显凋亡,吡格列酮以剂量依赖方式减少心肌细胞凋亡（P〈0．05）;缺氧复氧组HIF-1α表达上调,吡格列酮各组促进其进一步上调（P〈0．05）,与剂量无关。结论吡格列酮对缺氧复氧大鼠心肌细胞凋亡具有保护作用,其机制可能与上调HIF-1α表达有关。     

慢病毒载体介导RNA干扰HIF-1α对肺癌细胞放射敏感性的影响

用克隆形成实验评价肺癌SPCA1细胞和SPCA1乏氧诱导因子(HIF)-1α(-)[SPCA1/HIF-1α(-)]细胞在常氧和乏氧条件下对射线的敏感性,用流式细胞术检测慢病毒介导RNA干扰(RNAi)HIF-1α对SPCA1细胞周期和凋亡的影响。结果:SPCA1/HIF-1α(-)细胞乏氧后,对射线的敏感性明显增强,SPCA1/HIF-1α(-)细胞在乏氧照射后G2/M期细胞明显增多,但凋亡细胞较SPCA1细胞略降低。认为慢病毒介导RNAiHIF-1α可增强乏氧的肺癌SPCA1细胞的放射敏感性。     

丁硫氨酸硫酸亚胺逆转人结肠癌细胞多药耐药的机制

目的探讨丁硫氨酸硫酸亚胺(BSO)逆转人结肠癌LoVo／Adr细胞多药耐药性的可行性,并初步探讨其逆转机制。方法MTT法检测BSO对多药耐药LoVo／Adr细胞抗癌药物敏感性的影响; RT-PCR法检测细胞中多药耐药1(mdr1)基因及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-πmRNA水平;免疫组化染色检测GST-π蛋白水平;1氯-2,4-二硝基苯法测定GST活性。结果BSO作用后亲本LoVo细胞中阿霉素、丝裂霉素的IC50无显著变化,而在LoVo／Adr细胞中,阿霉素的IC50由(3．08±0．84)mg／L降至(1.31±0．53)mg／L(t=3．09,P<0．05),丝裂霉素的IC50由(1．24±0．45)mg／L降至(0．54±0．32)mg/L(t=165．50,P<0.01);BSO对mdr1基因mRNA水平无影响,BSO作用前后GST-πmRNA表达量分别为1．75±0.24和0．84±0．19(t=5．11,P<0．05),BSO作用后LoVo／Adr细胞GST-π蛋白表达显著低于处理前;BSO处理前后LoVo／Adr细胞GST活性分别为(144．26±50．13)和(129.58±41．36)U／mg(t=0,57,P>0．05)。结论BSO可有效增强人结肠癌耐药细胞LoVo／Adr对阿霉素、丝裂霉素的敏感性,具有逆转作用,其机制与mdr1基因无关,但与GST-π基因下调有关,可能是通过降低细胞内GST-π含量,增强对化疗药物的敏感性。     

缺氧对过氧化物酶体增殖物激活受体α表达的影响

目的 研究不同程度缺氧条件下，肺癌A549细胞内过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达状况，及反义封闭HIF-1α后，对PPARα受体的影响，以了解PPARα和HIF-1α的相关性。方法 首先将A549细胞分为4组：正常对照组（A组）、缺氧24小时组（B组）、缺氧48小时组（C组）、缺氧72小时组（D组）。观察不同缺氧时间对PPARα及 HIF-1α蛋白和mRNA表达水平的影响。为观察HIF-1α对PPARα表达状况的影响，再设计4组：对照组2（E组），HIF-1α反义寡核苷酸组（F组），HIF-1α正义寡核苷酸组（G组），HIF-1α错义寡核苷酸组（H组）。结果 正常对照组，PPARα和HIF-1α蛋白及mRNA均有少量表达；随着缺氧时间的延长，两的表达水平逐渐升高。在缺氧24小时，两mRNA和蛋白开始较高，48小时明显增高，至72小时达到高峰。反义封闭HIF-1α后，PPARα蛋白及mRNA的表达水平明显下降。结论 PPARα及HIF—1α的表达水平随肿瘤缺氧信号的加强而增加，且PPARα受HIF-1α的调控。     

缺氧诱导因子-1α和己糖激酶-Ⅱ在食管鳞状细胞癌中的表达及对糖酵解的影响

目的 探讨人食管鳞状细胞癌中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和己糖激酶-Ⅱ(HK-Ⅱ)的表达变化及对糖酵解的影响.方法 缺氧条件(1％氧浓度)下培养TE13及Eca109细胞,设置不同缺氧时间(分别为6、12、24、48 h),并以常氧培养(20％氧浓度)为对照.Western印迹检测HIF-1α及HK-Ⅱ的蛋白表达变化;经RNA干扰技术特异性静默HIF-1α,利用实时定量PCR及Western印迹检测HIF-1α和HK-Ⅱ的表达变化;分光光度法检测常氧和缺氧条件下细胞培养液中细胞的乳酸浓度变化.结果 ①缺氧条件下,TE13及Eca109细胞中HIF-1α表达均随缺氧时间延长而逐渐升高(P＜0.05),在缺氧12 h表达达到高峰,后表达又随时间延长而下降.TE13及Eca109细胞缺氧12 h后HK-Ⅱ表达均较常氧培养明显增强(P＜0.05).②实时定量PCR法检测显示,常氧条件下被干扰的TE13/shRNA和Eca109/shRNA细胞中HIF-1α RNA表达量较未干扰的TE13、Eca109细胞明显减弱(P＜0.05).HK-ⅡRNA表达结果与HIF-1 RNA一致.③常氧及缺氧培养时,HK-Ⅱ蛋白在TE13/shRNA和Eca109/shRNA细胞的表达均较未干扰的TE13、Eca109细胞明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.05).④缺氧时TE13和Eca109细胞乳酸分泌量为14.707±3.594和15.062±3.901,较常氧时增多(6.070±1.839和6.891±1.592,P＜0.05).TE13/shRNA、Eca109/shRNA乳酸分泌量较未静默TE13、Eca109细胞显著减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 食管鳞癌中HIF-1α及HK-Ⅱ在缺氧条件下表达明显增强,HK-Ⅱ表达及乳酸浓度与HIF-1α表达密切相关,HIF-1α可能通过HK-Ⅱ影响细胞的糖酵解水平.     

缺氧对食管鳞状细胞癌中缺氧诱导因子-1α和己糖激酶-Ⅱ表达的影响

目的 观察缺氧对食管鳞状细胞癌中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和己糖激酶-Ⅱ(HK-Ⅱ)表达的影响及对糖酵解的作用.方法 培养人食管鳞状细胞癌TEl3、Ecal09细胞株,采取分组方式培养,观察组在1％氧浓度下培养,对照组在20％氧浓度下培养.利用实时定量PCR方法检测两组细胞中HIF-1 α和HK-ⅡRNA表达,同时利用分光光度法检测常氧和缺氧条件下细胞培养液中细胞的乳酸浓度变化.结果 实时定量PCR法检测显示,常氧条件下被干扰的TEl3/shRNA和Ecal09/shRNA细胞中HIF-1α RNA表达量较未干扰的TEl3、Ecal09细胞明显减弱(P＜0.01),HK-ⅡRNA表达结果与HIF-1α RNA一致.另外,TEl3和Ecal09细胞在缺氧条件下分泌乳酸明显较对照组增多.结论 食管鳞癌中HIF-1α及HK-Ⅱ在缺氧条件下表达明显增强,HK-Ⅱ表达及乳酸浓度与HIF-1α表达密切相关,HIF-1α可能通过HK-Ⅱ影响细胞的糖酵解水平.     

肝癌组织、缺氧SMMC-7721细胞中HPA的表达变化及机制探讨

目的观察肝癌组织及缺氧培养的肝癌SMMC-7721细胞中乙酰肝素酶（HPA）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达变化,并探讨其机制。方法免疫组化法检测50例肝癌组织、28例肝癌癌旁组织、14例正常肝组织中的HPA、HIF-1α蛋白。分别采用RT-PCR和Western blot法检测常氧和缺氧培养的人肝癌SMMC-7721细胞中HPA mRNA及其蛋白。结果 HPA、HIF-1α蛋白在肝癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁和正常肝组织（P〈0.05）;肝癌组织中HPA、HIF-1α蛋白的表达呈正相关（r=0.295,P〈0.05）。缺氧培养20 h后,SMMC-7721细胞HPA mRNA表达量（6.234±0.457）显著高于常氧培养细胞的表达量（2.910±0.137）,两者相比,P〈0.05;其HPA蛋白表达量（65 kD为1.437±0.067,50 kD为1.706±0.066）也显著高于常氧培养细胞的表达量（65 kD为1.192±0.060,50 kD为1.580±0.265）,两者相比,P〈0.05。结论肝癌组织中HPA蛋白阳性表达率升高,缺氧肝癌SMMC-7721细胞中HPAmRNA及蛋白表达量均升高,可能与缺氧导致的HIF-1α表达上调有关。     

HIF-2α基因沉默对人肝癌细胞株HepG2增殖能力的影响

目的探讨缺氧诱导因子-2α(hypoxia-inducible factors-2α,HIF-2α)表达水平对人肝癌细胞株HepG2增殖能力的影响。方法用氯化钴(CoCl_2)诱导细胞模拟缺氧微环境,并根据CoCl_2浓度不同分为50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L组,选择CoCl_2浓度为200μmol/L模拟肿瘤内缺氧微环境。采用siRNA干扰沉默HepG2细胞中HIF-2α的表达,分别应用RT-PCR、Western blotting方法检测HIF-2αmRNA和蛋白的表达,MTT方法检测HepG2细胞增殖,绘制细胞生长曲线,流式细胞技术观察细胞周期的改变。结果建立细胞缺氧模型,作为低氧组;采用浓度为50 nmol/L的HIF-2αsiRNA转染缺氧环境下的HepG2细胞,作为低氧+HIF-2αsiRNA组,结果显示:低氧组、低氧+Control siRNA组的HIF-2αmRNA和蛋白表达显著高于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组(P0.05);细胞生长曲线结果显示:低氧组、低氧+Control siRNA组的光密度值显著高于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组(P0.05);细胞周期结果显示:低氧组、低氧+Control siRNA组HepG2细胞在DNA合成前期(G0/G1期)细胞比率显著低于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组,合成期(S)及合成后期(G2/M)细胞比率显著高于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组(P0.05)。结论缺氧微环境通过促进人肝癌细胞株HepG2细胞中HIF-2α的表达进一步促进HepG2细胞增殖,而针对HIF-2α的靶向siRNA能有效抑制肝癌HepG2细胞中HIF-2α的表达,从而抑制HepG2细胞的增殖。     

缺氧诱导因子-1α血管内皮生长因子在骨关节炎软骨细胞中的表达

目的探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及血管内皮生长因子（VEGF）在骨关节炎（OA）软骨细胞中的表达。方法新西兰大白兔随机分为正常对照组和模型组，分别对关节软骨病理切片后采用Safranin O染色，进行Mankin评分；免疫组织化学染色，并利用图像分析测定HIF-1α、VEGF表达的阳性指数。实时荧光定量PCR检测HIF-1α mRNA、VEGF mRNA在各组的表达。结果正常对照组的Mankin评分与模型组差异显著（P〈0．01），模型组HIF-1α、VEGF染色阳性指数与正常对照组比较，差异显著（P〈0．01）。模型组HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表达较正常对照组明显升高，差异显著（P〈0．05）。结论OA中HIF-1α和VEGF表达密切相关，HIF-1α表达增强可能是促进VEGF表达增强的重要途径之一。     

氯沙坦对肺成纤维细胞转分化和胶原合成的抑制作用

目的观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对人胚肺成纤维细胞（HLF）的转分化作用和对其结缔组织生长因子（CTGF）表达、胶原合成的影响，并检测AngⅡ受体拮抗剂氯沙坦对AngⅡ作用的干预。方法常规培养HLF细胞并随机分为对照组、AngⅡ组、AngⅡ＋氯沙坦组和氯沙坦组，用免疫荧光法和Western免疫印迹法检测各组HLF转分化肌成纤维细胞中标志蛋白α-平滑肌动蛋白（α-5MA）的表达，逆转录-多聚酶链反应和免疫组织化学法检测各组CTGFmRNA及蛋白表达的改变；分别用AngⅡ、AngⅡ＋氯沙坦孵育CTGF反义、正义、错义寡核苷酸转染HLF细胞，观察各组细胞I型胶原蛋白mRNA和α—SMA的mRNA和蛋白水平变化，比色法测定各组细胞培养液中羟脯氨酸含量。结果AngⅡ组CTGFmRNA的吸光度值（0．82±0．07）较对照组（0．29±0．05）、AngⅡ＋氯沙坦组（0.51±0.04）、氯沙坦组（0.26±0．04）明显增高；AngⅡ组CTGF蛋白的吸光度值（0.24±0．05）明显高于其他组；AngⅡ组胶原蛋白mRNA的吸光度值为1．03±0．12，羟脯氨酸含量为（0．62±0．01）ng／ml，明显高于其他3组；AngⅡ孵育CTGF反义寡核苷酸转染细胞组α-SMA的吸光度值（1．14±0．15）和胶原蛋白mRNA的吸光度值（0．30±0．04）明显低于正义组（4．25±0．21和0．55±0．08）和错义组（4．34±0．31和0．58±0．06）；AngⅡ＋氯沙坦孵育CTGF反义寡核苷酸转染细胞组α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的吸光度值（0.85±0．09和0．20±0．02）明显低于AngⅡ单独孵育时（4．39±0．29和1．03±0．12）。结论AngⅡ可通过上调HLF细胞CTGF表达水平诱导其转分化为肌成纤维细胞并促进胶原合成，阻断CTGF表达可使AngⅡ对HLF细胞的转分化及胶原诱导合成作用减低，氯沙坦可抑制AngⅡ对HLF细胞的诱导作用。     

HIF-1对乏氧人肺腺癌 A549细胞侵袭、迁徙能力的影响及其机制

目的：探索低氧诱导因子-1(HIF-1)对乏氧人肺腺癌 A549细胞侵袭及迁徙能力的影响及可能机制。方法采用氯化钴建立人肺腺癌 A549细胞体外化学乏氧模型。给予 HIF-1α特异性抑制剂YC-1抑制 A549细胞 HIF-1α的表达;通过 Western blot、免疫细胞化学、real time-PCR 检测 HIF-1α、S100A4蛋白及 mRNA 的表达;Transwell 小室模型检测 A549细胞 侵 袭 及 迁 徙 能 力。结果乏氧组A549细胞 HIF-1α、S100A4表达较常氧组增加,侵袭及迁徙能力较常氧组增强。YC-1干扰 HIF-1α表达后,YC-1组 A549细胞侵袭及迁徙能力减弱,S100A4蛋白及 mRNA 表达均降低。结论 HIF-1可能通过上调 S100A4的表达促进乏氧人肺腺癌 A549细胞侵袭及迁徙的能力。     

RNA干扰HIF-1α对血管生成拟态相关基因表达的影响

目的: 探讨常氧及缺氧培养条件下RNA干扰沉默人食管鳞癌细胞Ec a-109缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对血管生成拟态相关基因表达的影响.方法: 选择未转染处理的食管鳞癌Eca-109细胞和3株稳定转染HIF-1α SiRNA的Eca-109细胞, 分别予以常氧和缺氧培养, 缺氧培养12、24、36、48、60、72、96 h, 采用Western blot法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HIF-1α蛋白及mRNA表达, 同时Western blot法检测上皮细胞激酶(EphA2)、血管上皮钙黏附素(VE-cadherin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、层粘连蛋白5γ2链(LN-5γ2)等血管生成拟态相关基因的表达.结果: 缺氧条件下培养Eca-109细胞HIF-1α蛋白表达较常氧时增高, 以24-48 h为明显, 72-96h开始减弱, 而HIF-1α mRNA检测差异无统计学意义( F = 0.70, P = 0.67);RNA干扰后细胞在常氧下HIF-1α、EphA2、LN-5γ2蛋白几乎无表达, 缺氧后亦无增强现象, VE-cadherin、MMP-2蛋白表达较未干扰细胞稍有减弱, 缺氧后表达稍增强, 但差异无显著性(均P>0.05).结论: RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达, HIF-1α基因沉默后可以不同程度减少EphA2、LN-5γ2等血管生成拟态相关基因的表达.     

Wortmannin阻断PI3K/AKT途径对食管癌缺氧诱导因子-1α及糖酵解的影响

目的 探讨人食管癌细胞TE1、TE13中应用wortmannin阻断PI3K/AKT通路对缺氧诱导因子(HIF)-1α的抑制效果及对糖酵解相关基因表达的影响,分析PI3K/AKT-HIF-1α途径对食管癌细胞糖酵解通路之间的关系.方法 wortmannin(2μmol/L)预处理食管癌细胞TE1、TE13后常氧和缺氧培养,分为①常氧组(N);②缺氧组(H);③常氧处理组(N+W);④缺氧处理组(H+W).采用Western印迹检测细胞中HIF-1α蛋白及己糖激酶(HK)-Ⅱ、葡萄糖载体蛋白(GLUT)-1、乳酸脱氢酶(LDH )-A等糖酵解相关基因蛋白的表达;实时定量PCR检测HIF-1α及HK-Ⅱ、GLUT-1、LDH-A等糖酵解相关基因mRNA的表达;分光光度法测定胞液中LDH、HK-Ⅱ活性和培养上清液中乳酸浓度.结果 常氧状态下,在TE1细胞中存在HIF-1α蛋白的表达,wortmannin(2 μmol/L)能抑制HIF-1α蛋白表达,12 h后抑制效应最明显,故选取12 h为后续实验的缺氧时间.TE1、TE13细胞经wortmannin预处理后HIF-1α、HK-Ⅱ、GLUT-1、LDHA蛋白表达较未加药细胞明显减弱(P＜0.05);HIF-1α、HK-ⅡmRNA表达较未加药细胞明显减弱(P＜0.05).常氧和缺氧条件下加用wortmannin的TE1,TE13组食管癌细胞胞液LDH、HK-Ⅱ活性均较未加药细胞组明显减弱(P＜0.05),未加药细胞缺氧后酶活性增强(P＜0.05).常氧和缺氧条件下加用wortmannin组较未加药组细胞上清液乳酸浓度明显减低(P＜0.05),加wortmannin组细胞缺氧后表达增强(P＜0.05).结论 常氧及缺氧条件下,wortmannin能通过抑制食管癌细胞HIF-1α和糖酵解相关基因的表达导致乳酸水平降低,表明PI3K/AKT- HIF-1α途径与食管癌细胞糖酵解通路密切相关.