甲状腺癌组织差异表达cDNA消减文库的构建与鉴定

目的：应用抑制性消减杂交技术，构建人甲状腺癌与正常甲状腺差异表达的cDNA消减文库。方法：分别从甲状腺癌及正常甲状腺组织中提取总RNA，应用高效、灵敏的抑制性消减杂交技术，构建成功cDNA消减文库，再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果：构建成功具有高消减效率的人甲状腺癌组织cDNA消减文库，文库扩增得到了400个克隆，随机挑取50个制备质粒，酶切分析均得到50～400bp大小插入片段，这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段，结论：人甲状腺癌组织cDNA消减文库的建立为进一步克隆甲状腺癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

甲状腺癌组织差异表达cDNA消减文库的构建与鉴定

目的 :应用抑制性消减杂交技术 ,构建人甲状腺癌与正常甲状腺差异表达的cDNA消减文库。方法 :分别从甲状腺癌及正常甲状腺组织中提取总RNA ,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交技术 ,构建成功cDNA消减文库 ,再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果 :构建成功具有高消减效率的人甲状腺癌组织cDNA消减文库 ,文库扩增得到了 4 0 0个克隆 ,随机挑取 5 0个制备质粒 ,酶切分析均得到 5 0～ 4 0 0bp大小插入片段 ,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段 ,结论 :人甲状腺癌组织cDNA消减文库的建立为进一步克隆甲状腺癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

人食管癌相关基因cDNA片段的克隆与初步鉴定

目的 分离人原发性食管组织中瓣的相关基因,揭示食管癌的易感性与癌变原理,方法 用高效,灵敏的ｍＲＮＡ差异显示技术,以２例正常食管上皮,１例癌旁上皮,２例高癌家族的食管癌组织互为对照,通过其对其因表达的比较,找出差异条带,进行ＲＴ－ＰＣＲ鉴定和ＤＮＡ序列分析,结果 （１）在实验中,分离,鉴定了１８个差异片段,其中包括正常组织不表达的突变食管基因（ｍｕｔａｔｅｄｅｓｏｐｈａｇｅａｌｇｅｎｅ,ＭＥＧ）５     

肿瘤敏感相关基因克隆cDNA消减文库的构建

目的 :烷基磷脂类化合物 (十六烷基磷酸胆碱 ,HePC)诱导人上皮性肿瘤细胞系产生交叉耐药。方法 :用抑制消减杂交技术 ,构建KB和KBrcDNA消减文库。KB为testercDNA与过量的KBrcDNA消减杂交 ,非特异性cDNA片段被有效消减 ,特异表达的文库得到富集。结果 :扩增后得到 12 7个克隆 ,挑取质粒 ,酶切分析均得到 4 0 0～ 80 0bp插入片段。在获得可分析的 78个克隆中 ,2 7%没有同源基因片段或同源性很低 ,暂定为“新基因” ;14 %具有染色体明确定位 ,应该认为是化疗敏感肿瘤KB细胞所特有的cDNA片段 ;19%在人类EST文库MGC和CGAP中出现 ,可能是肿瘤细胞所特有基因 ;发现与耐药性相关的已知功能基因高达 4 0 %。结论 :探索伴随肿瘤细胞耐药发生基因丢失 ,以开拓抗性逆转措施的新途径。     

人肝癌细胞定向克隆表达cDNA文库的构建及鉴定

为克隆人肝癌相关基因，本实验从提取人肝癌细胞总ＲＮＡ入手，分离其ｍＲＮＡ。以ＮｏｔＩ／ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８为引物合成双链ｃＤＮＡ，除去小于４００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ人工接头，经ＮｏｔＩ酶酶切，     

胃腺癌差异表达基因的cDNA微阵列研究

目的:应用cDNA基因芯片研究筛选人胃腺癌相关差异表达基因, 探讨胃癌发生、发展的分子机制。方法: 运用含18 000个基因克隆的cDNA膜基因芯片,对6 对胃腺癌及正常胃组织标本分别进行杂交检测并对比分析。结果: 6 对人胃腺癌与相对应的胃正常组织相比较,筛选出在3~6 对标本中有2 倍以上改变的基因克隆共有103条(1 条在所有标本中均差异明显),其中胃癌组织表达上调基因56条, 胃癌组织表达下调基因47 条。结论: 人胃腺癌癌变是一个多基因参与的过程, 基因芯片技术是一种快速有效的筛选人胃腺癌差异表达基因的方法。     

食管鳞癌术后LR的挽救性放化疗进展

食管鳞癌患者术后LR率较高,其挽救性治疗主要采用放疗或放化疗,放疗靶区范围、剂量以及化疗方案目前尚缺乏统一标准。患者的年龄,体力状况评分,肿瘤复发部位、范围、病灶数目和大小等,以及放疗技术、放疗剂量、化疗方案和放化疗模式等因素均可影响疗效,甚至导致再次复发。本文将围绕以上内容进行综述,以期指导临床治疗。     

食管鳞癌DNA甲基化的研究进展

近年来研究结果表明,相关抑癌基因启动子区超甲基化导致的基因表达紊乱已成为食管癌发病机制研究的热点之一.众多研究表明DNA甲基化在食管癌的发生、侵袭和转移过程中发挥了积极的作用,外周血DNA甲基化谱可作为食管癌早期诊断、预后判断及随访的检测指标,有望将抑癌基因去甲基化作为食管癌的治疗靶点.     

食管鳞癌人乳头瘤病毒DNA的检测研究

目的：对新疆食管鳞状细胞癌中进行人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）ＤＮＡ检测。方法：采用多重引物聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术。结果：新疆５个地区４个民族１０４例食管鳞癌中ＨＰＶＤＮＡ阳性者占５０．９６％（５３／１０４），其中ＨＰＶ１６型为４９．０６％（２６／５３），ＨＰＶ１８型５．６％（３／５３），ＨＰＶ６／１１型７．５％（４／５３）；１６型和１８型同时阳性者２０．７５％（１１／５３），１８型和６／１１型１１．３２％（６／５３），１６型、１８型和６／１１型三者同时阳性５．７％（３／５３）；两个或三个类型的混合感染占３７．７％（２０／５３）。５个地区的食管鳞癌中均有不同程度的ＨＰＶＤＮＡ感染，４个民族中以哈萨克族食鳞癌ＨＰＶ感染率较高（８０．４８％）。结论：新疆地区食管鳞状细胞癌中ＨＰＶ有较高的感染率，以１６型为主，伴随与其它类型的混合感染，哈萨克族食管癌的发生发展与ＨＰＶ具有密切关系。     

胃腺癌差异表达基因的cDNA微阵列研究

目的：应用cDNA基因芯片研究筛选人胃腺癌相关差异表达基因，探讨胃癌发生、发展的分子机制。方法：运用含18000个基因克隆的cDNA膜基因芯片，对6对胃腺癌及正常胃组织标本分别进行杂交检测并对比分析。结果：6对人胃腺癌与相对应的胃正常组织相比较，筛选出在3～6对标本中有2倍以上改变的基因克隆共有103条(1条在所有标本中均差异明显)，其中胃癌组织表达上调基因56条，胃癌组织表达下调基因47条。结论:人胃腺癌癌变是一个多基因参与的过程，基因芯片技术是一种快速有效的筛选人胃腺癌差异表达基因的方法。     

DNA甲基化与食管癌的关系

肿瘤细胞普遍存在DNA甲基化模式的改变,DNA甲基化异常包括原癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化。近年来研究结果表明,在食管癌发生过程中同样存在相关抑癌基因启动子区甲基化导致的基因表达的紊乱。其中由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）和去甲基化酶的活性改变导致的抑癌基因CpG岛超甲基化的研究,已成为食管癌发病机制研究中的热点之一。综述DNA甲基化的特点及其抑制基因转录和表达的分子生物学机制;DNA异常甲基化与食管癌发生发展的关系;食管癌相关肿瘤抑制基因的甲基化谱构成了食管癌独特的表遗传学标志;目前常用的甲基化检测手段及各方法的优缺点;DNA甲基化和去甲基化研究的展望及所需要解决的的问题等。     

食管鳞癌组织中肺耐药蛋白表达和DNA含量的定量分析

目的：探讨食管鳞癌组织中肺耐药相关蛋白（lung resistance-related protein,LRP）的表达和DNA含量检测的临床意义。方法：应用流式细胞术（flow cytometry,FCM）定量分析52例原发食管鳞癌组织和相应癌旁组织中LRP蛋白表达及DNA含量的变化状况。结果：食管鳞癌组织LRP表达的相对荧光强度（RFI）的中位数（M）为1.39,而相应癌旁组织为0.75;差异有统计学意义,P〈0.05。癌组织DNA指数（DI）、SPF和PI显著高于相应癌旁组织,P〈0.05。LRP蛋白表达在不同的性别、病理分级、临床分期和有无淋巴结转移间的表达均差异无统计学意义,P〉0.05。DNA倍体和SPF、PI均与性别、病理分级和临床分期无明显关系,P〉0.05;但与有无淋巴结转移有关,P〈0.05。非整倍体肿瘤患者淋巴结转移率（63.9%,23/36）高于二倍体肿瘤患者淋巴结转移率（18.8%,3/16）,P〈0.05。有淋巴结转移患者SPF和PI显著高于无淋巴结转移患者,P〈0.05。非整倍体肿瘤LRP蛋白表达水平（Median=1.42）略高于二倍体肿瘤（Median=1.35）,但两者差异无统计学意义,P〉0.05。结论：LRP蛋白表达和DNA含量在食管鳞癌发生中起重要作用。DNA含量与淋巴结转移有关,可作为预测食管鳞癌预后的指标。     

p53基因在人食管诱发癌中的突变

目的 :了解抑癌基因p5 3在人食管癌及其癌旁组织中的突变和致癌作用。方法 :采用PCR SSCP和DNA序列分析等方法对 2 4例人食管鳞状细胞癌术后标本和 2 1例移植到重度完全性免疫缺陷 (severecombinedimmunodefi cient,SCID)小鼠并用或不用N -戊基 -N -甲基亚硝基胺 (N amyl N methylnitrosamine ,AMN)处理的人食管正常组织标本 ,进行了p5 3基因外显子 4～ 8的突变研究分析。结果 :在食管癌组织及癌旁组织均检测出p5 3基因突变 ,其中食管癌组织标本中有 18个突变 ,癌旁组织标本中有 10个 ( 10 /17,5 8 8% )突变 ,主要的突变为G A转换。在 14例用AMN处理的人食管正常组织标本中出现 6个 ( 4 2 9% )突变 ;其中密码子 2 83的突变为G A转换。在人食管癌及其癌旁组织中p5 3基因的突变概率差异无统计学意义。结论 :环境因素或内源性AMN可能是河南林县食管癌高发的主要原因之一     

食管鳞状细胞癌组织中Survivin和Cox-2及PCNA表达临床意义的研究

目的探讨Survivin、Cox-2和PCNA表达与食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）临床病理因素及相互之间的关系。方法应用免疫组织化学（SP）方法检测Survivin、Cox-2蛋白和增殖细胞核抗原在51例食管鳞癌和30例切缘正常食管黏膜中的表达。结果Survivin和Cox-2在食管鳞癌的表达均高于切缘正常食管黏膜,P〈0.01。Survivin蛋白在食管鳞癌组织中的表达阳性率与肿瘤分化程度相关,P〈0.05。Cox-2蛋白的表达阳性率与食管鳞癌的临床病理特征无关,P〉0.05。PCNA的表达阳性率与食管鳞癌的分化程度、淋巴结转移有关,差异有统计学意义,P〈0.05。51例食管鳞癌组织中Survivin与Cox-2、PCNA之间具有显著正相关性,P〈0.01;Survivin与PCNALI（反映细胞增殖活性的指标）具有正相关性,P〈0.05;Cox-2与PCNA之间无相关性,P〉0.05。结论Survivin与COX-2蛋白在食管鳞癌组织中均有较高的阳性表达,两者表达具有相关性,两者可能存在共同的激活机制,构成抑制食管鳞癌细胞凋亡的多种途径。Survivin表达与食管鳞癌的恶性进程有关。     

Somatic alteration and depleted nuclear expression of BAP1 in human esophageal squamous cell carcinoma

BRCA1‐associated protein 1 (BAP1) is a deubiquitinating enzyme that is involved in the regulation of cell growth. Recently, many somatic and germline mutations of BAP1 have been reported in a broad spectrum of tumors. In this study, we identified a novel somatic non‐synonymous BAP1 mutation, a phenylalanine‐to‐isoleucine substitution at codon 170 (F170I), in 1 of 49 patients with esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). Multiplex ligation‐dependent probe amplification (MLPA) of BAP1 gene in this ESCC tumor disclosed monoallelic deletion (LOH), suggesting BAP1 alterations on both alleles in this tumor. The deubiquitinase activity and the auto‐deubiquitinase activity of F170I‐mutant BAP1 were markedly suppressed compared with wild‐type BAP1. In addition, wild‐type BAP1 mostly localizes to the nucleus, whereas the F170I mutant preferentially localized in the cytoplasm. Microarray analysis revealed that expression of the F170I mutant drastically altered gene expression profiles compared with expressed wild‐type BAP1. Gene‐ontology analyses indicated that the F170I mutation altered the expression of genes involved in oncogenic pathways. We found that one candidate, TCEAL7, previously reported as a putative tumor suppressor gene, was significantly induced by wild‐type BAP1 as compared to F170I mutant BAP1. Furthermore, we found that the level of BAP1 expression in the nucleus was reduced in 44% of ESCC examined by immunohistochemistry (IHC). Because the nuclear localization of BAP1 is important for its tumor suppressor function, BAP1 may be functionally inactivated in a substantial portion of ESCC. Taken together, BAP1 is likely to function as a tumor suppressor in at least a part of ESCC.     

食管鳞癌组织端粒酶亚基的表达及端粒酶活性的关系

目的　探讨食管鳞癌组织中端粒酶活性、端粒酶逆转录酶 (h TERT)及端粒酶相关蛋白 - 1(TP- 1)的表达及其关系。方法　应用 TRAP-银染法对 45例食管鳞癌组织端粒酶活性的检测 ,同时应用原位杂交对癌组织切片进行 h TERT、TP- 1的 m RNA表达的检测。结果　癌组织端粒酶活性阳性率为 82 .2 %。癌组织中不同分化程度的端粒酶活性差异无显著性 (P>0 .0 5 )。有淋巴结转移者癌组织端粒酶活性明显高于无淋巴结转移者 ,差异有显著性(P<0 .0 5 )。癌组织中 h TERTm RNA表达的阳性率为 6 4.4%,TP- 1的阳性率为 6 2 .2 %。 h TERT的 m RNA表达与端粒酶活性密切相关 ,而 TP- 1的 m RNA表达与端粒酶活性无相关。结论　食管鳞癌组织中端粒酶活性及h TERT、TP- 1的 m RNA表达均较高。端粒酶活性与淋巴结转移有关。 h TERT与端粒酶活性有密切关系。     

长链非编码RNA XLOC_002319在食管鳞癌中表达及其甲基化状态

目的:通过检测食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中长链非编码RNA XLOC_002319(long non-colding RNA XLOC_002319,lncRNA XLOC_002319)基因的表达及其甲基化状态,探讨XLOC_002319基因在ESCC发生及发展中的作用.方法:分别应用RT-PCR以及甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)的方法检测DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycitydine,5-aza-dC)处理前后的食管癌细胞株(TE1、TE13、Yes-2、Eca109和T.TN)、ESCC组织以及癌旁正常组织、食管上皮内瘤变(esophageal intraepithelial neoplasia,EIN)组织中XLOC_002319基因的表达和甲基化状态.结果:未经5-aza-dC处理的5种食管癌细胞中XLOC_002319基因的表达均呈阴性或弱阳性,经5-azadC的5种食管癌细胞中XLOC_002319基因的表达均增高.5株食管癌细胞在5-aza-dC处理前表现为XLOC_002319高甲基化状态,处理后,Eca109和T.TN细胞系中XLOC_002319基因甲基化程度降低,其余3株细胞系中XLOC_002319基因均表现为非甲基化状态.XLOC_002319基因在ESCC组织中的表达显著低于食管上皮内瘤变组织和癌旁正常组织(P＜0.01),并与组织学分化程度和TNM分期密切相关(P＜0.05).ESCC组织中XLOC_002319基因启动子区甲基化率为63.75％ (51/80),显著高于食管上皮内瘤变组织和癌旁正常组织(P＜0.01),并与淋巴结转移、组织学分化程度和TNM分期密切相关(P＜0.05).发生XLOC_002319基因甲基化的ESCC组织中XLOC_002319基因表达显著低于未发生甲基化的ESCC组织(P＜0.01).结论:XLOC_002319基因在ESCC中的低表达可能与ESCC的发生密切相关,且其启动子区甲基化可能是导致其表达沉默的机制之一.     

人食管癌相关基因4在食管癌细胞系EC9706中表达缺失的机制

目的 探讨人食管癌相关基因4(ECRG4)在食管癌中表达缺失的机制.方法 采用聚 合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP)和DNA测序的方法检测80对配对食管鳞状细胞癌(ESCC)肿瘤组织和癌旁正常上皮中ECRG4的外显子突变;采用DNA亚硫酸氧盐修饰和序列特异性聚合酶链反应(ssPCR)检测EC9706细胞系ECRG4基因启动子CpG岛甲基化状态;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷或三氧化二砷(As2O3)处理后ECRG4 mRNA的重新表达.结果 80对ESCC配对标本中,ECRG4的4个外显子编码区均未发现突变.EC9706细胞系ECRG4基因核心启动子区16个CpG岛中,有11个呈高甲基化状态,ECRG4 mRNA不表达.EC9706细胞处理前ECRG4 mRNA不表达,去甲基化药物处理后,ECRG4 mRNA均重新表达.结论 甲基化表观遗传学机制是导致ECRG4基因在食管癌细胞系EC9706中表达缺失的一个机制.

Abstract：

Objective To investigate the mechanism of loss of human esophageal cancer-related gene 4 (ECRG4) expression in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC.) Methods PCR-SSCP and DNA sequencing analysis were used to detect the mutation of ECRG4 exons in esophageal cancer and matched adjacent normal tissues of 80 patients. DNA bisulfite-modifying ssPCR sequencing assay was used to examine the methylation status of ECRG4 promoter in human esophageal squamous cell carcinoma EC9706 cells. The re-expression of ECRG4 mRNA was examined by RT-PCR in EC9706 cells, after treatment with either demethylation drug 5-aza-2'-deoxycytidine or arsenic trioxide. Results No mutation in the four ECRG4 exons was found in all the ESCC and matched normal adjacent tissues. RT-PCR showed that 11 of 16 CpG islands of ECRG4 promoter were hypermethylated, while ECRG4 mRNA expression level was undetectable in the EC9706 cells. The ECRG4 mRNA was re-expressed after treatment with either demethylation drug 5-aza-2'-deoxycytidine or arsenic trioxide. Conclusion The epigenetic mechanism of methylation is a reason of loss of ECRG4 gene expression in the ESCC cell line EC9706.