ALA-PDT诱导C6胶质瘤细胞自噬和胞内Ca^2＋浓度变化的研究

目的探讨5-氨基乙酰丙酸介导的光动力治疗（ALA—PDT）诱导大鼠C6胶质瘤细胞发生的自噬与细胞内游离钙的关系，及自噬特异抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对自噬和胞内游离钙浓度的影响。方法C6细胞经ALA—PDT后不同时间用单丹磺酰戊二胺（MDC）染色和电镜观察其胞内自噬现象，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，并测定胞内游离钙离子浓度的变化。结果ALA—PDT诱导C6胶质瘤细胞发生了自噬被观察到，且ALA—PDT后C6胶质瘤细胞凋亡率明显高于对照组（P〈0．05）。与此同时胞内钙离子浓度较对照组明显升高，以ALA—PDT后20min和6h最为明显（P〈0．05）；3-MA可显著抑制ALA—PDT所致的胞内Ca2^浓度升高并能降低凋亡细胞比例（P〈0．05）。结论在体外条件下ALA—PDT可诱导C6胶质瘤细胞发生自噬＋，其发生可能与ALA-PDT导致细胞内游离钙升高有关；3-MA可能通过抑制胞内游离钙的升高而抑制ALA-PDT诱导的细胞自噬。     

丙戊酸诱导胶质瘤细胞自噬及其机制研究

目的对丙戊酸诱导胶质瘤细胞发生自噬性死亡的过程进行观察,并初步探讨其可能的机制。方法丙戊酸处理人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295,台盼蓝染色检测细胞活性并计算细胞存活率;流式细胞仪测定细胞周期,透射电子显微镜和荧光测定仪观察细胞超微结构及自噬水平,West-ern blotting检测经丙戊酸处理后细胞内LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt和p-p70S6K等蛋白质的表达水平。结果经不同浓度丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295细胞活性明显受到抑制,其胶质瘤细胞半数抑制浓度分别为(2.45±0.32)、(4.78±0.62)和(6.62±0.95)mmol/L,其中丙戊酸对人脑胶质瘤细胞系U87具有较明显的杀伤作用(P<0.05)。透射电子显微镜观察可见人脑胶质瘤细胞系U87细胞胞质内有大量自噬体和自噬溶酶体,其自噬水平随丙戊酸浓度的升高而逐渐增强。经丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平明显升高,而p-Akt和p-p70S6K表达水平明显降低。结论丙戊酸可诱导胶质瘤细胞发生自噬,其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与阻断Akt信号转导通路有关。     

mTOR通路抑制剂依维莫司对不同胶质瘤细胞自噬作用的影响

目的 探讨mTOR抑制剂依维莫司对人脑胶质瘤细胞自噬作用的影响. 方法 体外培养胶质瘤细胞株87-MG、U251、SHG-44,给予不同浓度的依维莫司(0.1、0.5、1、10、20、100nmol/L)作用4-6d后用MTT法检测细胞的增殖并分析各细胞株的半数抑制浓度(IC50)值.Hoechst33342/PI荧光双染检测IC50的依维莫司作用48 h后细胞凋亡;单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色检测细胞自噬囊泡的形成;流式细胞术检测细胞周期的变化.Western blotting测定IC50的依维莫司作用24h后细胞磷酸化mTOR、p70S6K、4E-BP-1蛋白及非磷酸化mTOR、p70S6K蛋白的表达. 结果 MTT结果显示U87-MG、SHG-44、U251细胞的生长均受到明显抑制,IC50分别为0.1、0.5、10nmol/L;Hoechst 33342/PI荧光双染结果显示细胞没有发生明显的凋亡,可能为细胞白噬;MDC染色显示IC50的依维莫司作用后,细胞中荧光颗粒增加,荧光强度增强;流式细胞术检测显示3种细胞均有特异性的G0/G1期细胞阻滞;Western blotting检测显示随着依维莫司剂量的增加,胶质瘤细胞中磷酸化mTOR、p70S6K、4E-BP-1的表达水平均明显减少,非磷酸化4E-BP-1的表达水平减少,而非磷酸化p70S6K无明显变化. 结论 mTOR抑制剂依维莫司可以促进胶质瘤细胞的自噬,mTOR通路可能为潜在的新的胶质瘤的治疗靶点.     

雷公藤红素对C6胶质瘤细胞凋亡及细胞周期阻滞的影响

目的 探讨雷公藤红素对体外C6胶质瘤细胞凋亡及细胞周期阻滞的影响及机制.方法 雷公藤红素处理体外培养的C6胶质瘤细胞,MTT法检测细胞增殖,Hochest33342染色荧光显微镜观察以及锇铀铅染色透射电镜观察胶质瘤细胞形态变化,流式细胞术分析细胞凋亡率及细胞周期改变.蛋白印迹分析检测凋亡相关蛋白及细胞周期调控蛋白的表达变化.结果 雷公藤红素对C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖性;2.56 μmol/L雷公藤红素处理C6胶质瘤细胞24h后,荧光显微镜、透射电镜下均可见凋亡形态学改变.流式细胞术检查显示,凋亡细胞比例由1.32％升高到19.34％;并且,处于G0/G1期的细胞比例由76.42％降低到54.52％,G2/M期细胞比例由9.29％升高到30.50％.蛋白印迹分析显示,雷公藤红素降低了Bcl -2及XIAP蛋白表达,促进了Bax及Caspase -3的表达以及PARP的剪切;雷公藤红素在诱导细胞周期调控蛋白p21、p27及cyclin B1蛋白表达增加的同时抑制了cdk2蛋白的表达.结论 雷公藤红素能够通过调节凋亡相关蛋白及细胞周期相关因子的表达影响C6胶质瘤细胞的凋亡及细胞周期阻滞.     

碘125粒子内放疗后胶质瘤U251细胞自噬的发生

目的探讨碘125（125I）内放疗后胶质瘤U251细胞发生自噬的情况。方法用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法检测不同照射时间及剂量下125I粒子对U251细胞增殖活性的影响。通过单丹（磺）酰戊二胺（MDC）染色,自噬溶酶体活性的检测以及Western blotting蛋白印迹检测微管相关蛋白轻链3（LC3）来证实125I粒子对U251细胞自噬发生的影响。结果125I粒子照射U251细胞后细胞活性明显下降并呈现时间和剂量相关性。MDC染色和溶酶体活性检测以及LC3-Ⅱ蛋白印迹均证实内放疗照射后U251细胞自噬明显增加。结论125I粒子内放疗后U251细胞自噬明显增加。     

ATRA诱导胶质瘤C6细胞凋亡过程中Bcl-2和Caspase-3表达的研究

目的研究全反式维甲酸（ATRA）诱导胶质瘤C6细胞凋亡过程中Caspase-3和Bcl-2表达情况,探讨ATRA诱导胶质瘤C6细胞凋亡的机制。方法用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法绘制ATRA不同浓度不同时间（6、12、24、48、72h）对胶质瘤C6细胞作用后细胞生长曲线,逆转录酶-多聚酶链反应（RT—PCR）检测凋亡相关基因Bcl-2和Caspase-3 mRNA水平的表达变化影响,Western blot分析Caspased和Bcl-2在胶质瘤C6细胞中的表达情况。结果胶质瘤C6细胞经ATRA诱导后,细胞的增殖明显受到抑制,通过RT-PCR结果证实Bcl-2 mRNA在ATRA作用下明显呈低表达而Caspase-3 mRNA的表达随时间延长逐渐增高,Western blot检测结果显示ATRA作用后,下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达并激活了凋亡蛋白Caspase-3的表达。结论ATRA对胶质瘤C6细胞的增殖具有抑制作用。     

脑出血后凝血酶诱导自噬细胞的种类研究

目的探讨脑出血后凝血酶诱导的自噬细胞类型。方法建立凝血酶脑损伤模型,大鼠脑内基底节注射凝血酶,收集脑损伤标本,免疫荧光双染检测beclin1~+与神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP~+)以及神经元特异性烯醇化酶(NSE~+)的重合率;电镜下直接观察含有自噬泡的细胞。分别培养星形细胞和神经细胞,经凝血酶处理后,用Western blot法测量微管相关蛋白轻链3 (LC3)Ⅰ型向Ⅱ型转化,单丹磺酰戊二胺(MDC)染色观察细胞内自噬空泡的变化。结果大鼠基底节注射凝血酶后,免疫荧光双染显示beclin1+细胞主要为星形细胞;电镜显示,自噬空泡均位于星形细胞内,未能在神经细胞中发现。离体实验表明,凝血酶可以明显上调星形细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,增加MDC染色标记的自噬空泡数量,神经细胞未见类似改变。结论脑出血后凝血酶诱导的细胞自噬主要发生于星形细胞,而不是神经细胞。     

1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导嗜铬细胞瘤细胞自噬应激并导致α-突触核蛋白的自噬性清除障碍

目的 探讨1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)所诱导的自噬应激在嗜铬细胞瘤(PC12)细胞损伤中的作用以及MPP+导致α-突触核蛋白自噬性清除障碍及其异常聚集的可能机制.方法 在MPP+处理细胞24 h后,采用四甲基偶氮盐法检测细胞活力,Western blot检测α-突触核蛋白及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)在蛋白水平表达的变化,并用MDC染色和免疫荧光标记观察自噬水平的变化及α-突触核蛋白、LC3-Ⅱ和溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)在细胞内的共定位情况.结果 MPP+处理后细胞的活力明显下降;与未处理组相比(PC12组:0.20±0.08;A30P组:0.76±0.09),PC12+MPP+组(0.66±0.07,t=5.7271,P=0.0023)和A30P+MPP+组(1.71 4±0.40,t=8.6100,P=0.0005)α-突触核蛋白表达增加;LC3-Ⅱ蛋白的表达水平及自噬泡的平均数目均增高.另外,MPP+处理后,α-突触核蛋白和LC3-Ⅱ的荧光信号及其共定位增加,尽管LAMP-1标记的溶酶体荧光信号增加,但与LC3-Ⅱ标记的自噬体共定位程度却减小.结论 MPP+导致自噬体与溶酶体的融合出现障碍,引起α-突触核蛋白的自噬性清除障碍与自噬应激的出现,最终导致细胞的损伤甚至死亡.     

沙利度胺联合替莫唑胺杀伤U251胶质瘤细胞机制的体外研究

目的 对沙利度胺联合替莫唑胺杀伤U251胶质瘤细胞的机制进行体外研究,为制订沙利度胺与替莫唑胺联合化疗方案提供理论依据.方法 经体外培养的人胶质瘤细胞系U251分别接受替莫唑胺(100 μmol/L)、沙利度胺(100 μg/L)、替莫唑胺与沙利度胺联合治疗,噻唑监(MTT)法检测不同抗肿瘤药物处理组肿瘤细胞增殖活性;流式细胞术分析细胞增殖周期;检测经吖啶橙标记的酸性囊性细胞器数目;原位末端标记(TUNEL)法观察肿瘤细胞凋亡情况;Western blotting法榆测肿瘤自噬及凋亡相关蛋白表达变化.结果 与替莫唑胺和沙利度胺单药治疗相比,替莫唑胺与沙利度胺联合治疗对U251细胞生长的抑制更为明显(均P=0.000).且可诱导肿瘤细胞周期阻滞于G0～G1期,以及发生凋亡和自噬.两药联合治疗后,U251细胞微管相关蛋白1轻链3和Caspase-3表达水平高于替莫唑胺组和沙利度胺组(均P=0.000).结论 沙利度胺联合替莫唑胺治疗U251细胞可以上调自噬及凋亡相关基因表达水平.同时诱导凋亡及自噬性死亡,从而达到对U251胶质瘤细胞的杀伤作用.     

赖氨匹林对C6胶质瘤细胞的增殖抑制和促凋亡作用

目的 研究赖氨匹林(aspisol)对体外培养的C6胶质瘤细胞的增殖抑制以及促凋亡作用. 方法 采用四氮唑(MTT)比色法测定aspisol对C6细胞的增殖抑制作用;荧光显微镜、透射电镜进行细胞凋亡形态观察:RT-PCR、Western-blot进行凋亡相关基因Box、Bcl-xl mRNA和蛋白表达检测.结果 Aspisol对C6细胞的增殖具有抑制作用;aspisol(0.1 μg/mL)作用24 h使细胞发生典型的凋亡形态改变:Bax mRNA表达水平随aspisol作用时间的延长而升高,Bcl-xl mRNA表达水平随aspisol作用时间的延长而下降,6 h、12 h、24 h 3个时间点表达水平差异有统计学意义(P<0.05);Bax蛋白表达水平随aspisol作用时间的延长而升高,Bcl-xl蛋白表达水平随aspisol作用时间的延长而下降,6h与12h、24h 3个时间点表达水平差异有统计学意义(P<0.05).结论 Aspisol对C6细胞具有增殖抑制以及促凋亡作用,推测aspisol通过Bax/Bcl-xl途径诱导C6细胞凋亡.     

环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对体外培养的C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法以不同浓度塞来昔布分别作用于C6胶质瘤细胞不同时间段,采用甲基噻唑蓝比色法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,并用光镜及透射电镜观察细胞形态学和超微结构的变化。结果经不同浓度塞来昔布作用后,C6胶质瘤细胞活性受到抑制,且呈剂量时间依赖性,实验组与对照组之间以及实验组各亚组之间均有显著性差异（P〈0.05）。细胞周期检测发现实验组S期细胞减少,G2期细胞显著增加,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;同时,塞来昔布还可诱导C6胶质瘤细胞凋亡,凋亡率在实验组与对照组之间有显著性差异（P〈0.05）。结论选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布可抑制C6胶质瘤细胞增殖,诱导C6胶质瘤细胞凋亡。     

FLIP蛋白抑制顺铂诱导大鼠C6胶质瘤细胞凋亡

目的探讨自杀相关因子（Fas）相关死亡结构域样白介素1（IL-1）β转化酶抑制蛋白（FLIP）对于顺铂（CDDP）诱导大鼠脑胶质瘤细胞（C6细胞株）凋亡的抑制作用,为进一步研究胶质瘤的耐药性奠定分子生物学基础。方法利用由Ad—Max腺病毒包装系统成功构建的携载大鼠FLIP基因的腺病毒表达载体Ad—FLIP感染大鼠C6胶质瘤细胞,24h后经逆转录酶一多聚酶链反应（RT—PCR）及Westernblot检测感染组及对照组细胞中FLIP基因的mRNA及蛋白表达水平;分别给予Ad—FLIP感染组及对照组细胞不同浓度的CDDP（0,1,2,4,8mg／ml）,药物处理48h后,经流式细胞仪（FCM）分析细胞凋亡状况;四唑蓝显色法（MTF）测定并比较两组细胞活力。结果Ad—FLIP感染组细胞与对照组细胞相比,FLIPmRNA和蛋白表达水平明显增高;流式细胞仪检测结果显示Ad—FLIP感染组细胞凋亡率明显低于对照组。MTT法结果提示经CDDP处理后,Ad—FLIP感染组与对照组细胞活力均有下降,但FLIP蛋白具有明显的抑制作用。结论FLIP蛋白在大鼠c6胶质瘤细胞中具有抵抗化疗药物的作用。     

舒林酸抑制胶质瘤细胞株C6增殖的实验研究

目的观察非甾体类抗炎药舒林酸对胶质瘤C6细胞增殖的影响，并探讨其作用机制。方法采用四氮唑蓝（MTT）比色法观察舒林酸对C6细胞增殖的影响，采用流式细胞仪检测舒林酸对C6细胞凋亡和细胞周期分布的影响。结果舒林酸可抑制C6细胞增殖，可诱导细胞凋亡和G0/G1期阻滞，且呈现明显的时间和剂量依赖性（P〈0．05）。结论舒林酸可抑制C6细胞增殖，其机制涉及影响细胞周期和诱导细胞凋亡方面。     

5-氨基乙酰丙酸介导的光动力对人脑胶质瘤细胞的治疗作用

目的探讨5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)介导的光动力学对人脑胶质瘤U251细胞的治疗作用方法使用荧光显微镜及共聚焦显微镜检测5-ALA所产生的光敏剂原卟啉(PpIX)在U251细胞中的定位。将5-ALA加入U251细胞中,随之以635nm的激光辐射,使用MTT法测定细胞生存率结果5-ALA与U251细胞共培养可以产生光敏剂原卟啉。原卟啉弥散地分布在U251细胞的胞浆中,胞核区未见分布。5-ALA介导的光动力对人脑胶质瘤U251细胞的杀伤作用随着5-ALA与U251细胞孵育时间的延长及5-ALA浓度的增加而增加,但在孵育6h、5-ALA浓度为2mmol/L时达饱和。而单用5-ALA或单纯激光辐射,对U251细胞无明显的杀伤作用。结论5-ALA介导的光动力治疗是很有前途的人脑胶质瘤治疗方法,5-ALA与U251细胞孵育的最佳时间为6h,最佳5-ALA药物浓度为2mmol/L     

Src抑制的蛋白激酶C底物在细胞因子诱导的C6胶质瘤细胞中表达的改变

目的研究肿瘤坏死因子（TNF-α）对培养的C6胶质瘤细胞中Src抑制的蛋白激酶C底物（Src-suppressed C Kinase Substrate,SSeCKS）表达的影响。方法根据TNF-α刺激时间与浓度的差异,将培养的C6胶质瘤细胞随机分为TNF-α时间刺激组与浓度刺激组,运用实时荧光定量PCR（Realtime PCR）、免疫印迹和免疫细胞化学法分析SSeCKS的表达变化和亚细胞定位。结果细胞因子TNF-α可引起C6胶质瘤细胞中蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）底物的广泛磷酸化,并以时间及浓度依赖的方式上调PKC底物SSeCKS的表达。免疫细胞化学分析显示,正常情况下,SSeCKS散在分布于细胞质,浓集于细胞伸长的足突中。TNF-α刺激后,SSeCKS向核周迁移。这些改变可被PKC的抑制剂Ro-31-8220部分抑制。结论TNF-α可诱导C6胶质瘤细胞中PKC的活性,上调SSeCKS表达,这些改变与PKC的活性相关,提示SSeCKS可能参与胶质细胞中炎症信号的转导。     

Induction of radioprotective peroxiredoxin-I by ionizing irradiation

Results of this study indicate a radioprotective effect of peroxiredoxin-I. Peroxiredoxin-I is an antioxidant that scavenges hydroperoxides, whereas reactive oxygen species are the main mediators of ionizing radiation toxicity. We hypothesized that peroxiredoxin-I might be induced by cellular exposure to radiation and act to protect them against its cytotoxic effects. Western blot and Northern blot analyses were used to assess peroxiredoxin-I protein and mRNA expression. Rat C6 glioma cells were engineered to overexpress sense or antisense human peroxiredoxin-I using retroviral vectors. Clonogenic cell survival was used to assess radiosensitivities of the engineered cells. Ionizing radiation induced peroxiredoxin-I protein and mRNA expression in human HT29 colon cancer and rat C6 glioma cells in a dose- and time-dependent manner over a 24 hr period. To determine the effect of peroxiredoxin-I on radiation responses, C6 glioma cells were engineered to overexpress sense or antisense human peroxiredoxin-I. In clonogenic assays, cells overexpressing peroxiredoxin-I were more radioresistant. Cells transduced with antisense peroxiredoxin-I were marginally more sensitive to radiation toxicity. Irradiation can induce peroxiredoxin-I expression, and the increased peroxiredoxin-I may protect cells from further radiation damage. These results suggest that protection by peroxiredoxin-I may play an important role in the survival of glioma and colon cancer cells in patients undergoing radiation therapy.     

Initial bradykinin triggers calcium-induced calcium release in C6 glioma cells and its significance

Objective

To investigate the underlying mechanism for the selective modulation of the permeability of blood-tumor barrier (BTB) by small dose of bradykinin (BK).

Methods

C6 glioma cells were treated with BK, and changes of intracellular nitric oxide (NO) and intracellular calcium level were measured with fluorescent spectrophotometer.

Results

The initial application of BK easily triggered extracellular calcium influx, which resulted in intracellular calcium store release in C6 glioma cells. The above mechanism was also named ryanodine mediated calcium induced calcium release (CICR). We also detected a long-lasting intracellular NO elevation in C6 glioma cells upon BK treatment. Further study showed that ryanodine mediated CICR contributed greatly to the secondary NO elevation induced by BK treatment.

Conclusion

These results suggested that BK triggered CICR in C6 glioma cells and the associated NO generation might be the underlying mechanism for the selective modulation of BTB permeability by BK.     

Basic fibroblast growth factor (bFGF) and rat C6 glioma cells: regulation of expression, absence of release, and response to exogenous bFGF

Basic fibroblast growth factor (bFGF) is a potent mitogen for several types of cells, including glial cells, which also seem to express bFGF. We have used rat C6 glioma cells as a model system to study the expression and release of bFGF by glioma cells, as well as the effects of exogenous bFGF on these cells. We have shown that C6 cells express 18 kD bFGF and several higher molecular weight immunoreactive forms. The expression of bFGF could be induced by a factor present in fetal calf serum. Subsequent to its initial appearance, bFGF is regulated in a cell density-dependent manner. Neither bFGF-like immunoreactive material, nor bFGF-like neurotrophic activity were found to be released by C6 cells. Exogenously applied bFGF changed C6 cell morphology similar to cyclic AMP induced alterations but had no significant influence on C6 cell proliferation and biochemical differentiation. From these results we conclude that bFGF in C6 cells might act as an endogenous (not autocrine) mitogen. Possible roles for bFGF in glial cells are discussed.