LyGDI真核表达载体构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的构建Rho蛋白鸟苷解离抑制因子（LyGDI）真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法PCR扩增LyGDI基因片段,构建pEGFP-C1-LyGDI真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株,RT-PCR、免疫印迹检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达LyGDI蛋白。结论LyGDI真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究LyGDI过度表达对肿瘤侵袭性和转移的影响奠定了实验基础。     

重组表达载体plRES Rb94的构建及其对肺腺癌A549细胞株中SphK表达的影响

目的构建真核表达质粒pIRES Rb94,观察Rb94基因对鞘氨醇激酶（SphK）表达的影响。方法根据Rb94基因序列设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点（IRES）相连的Rb94基因的真核表达质粒pIRES Rb94,经脂质体转染A549细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。采用Real time RT PCR和Western boltting法检测Rb94基因并观察其对人肺腺癌A549细胞株SphK表达的影响。结果成功构建重组表达质粒pIRES Rb94,转染A549细胞后获得稳定转染细胞株pIRES Rb94 A549,该细胞株中Rb94基因高效表达;SphK1表达下调而SphK2表达上调。结论真核表达质粒pIRES Rb94构建成功并可有效转染A549细胞,Rb94基因抑制SphK1的表达,增强SphK2的表达。     

PTTG1基因上调表达对A549细胞增殖和凋亡的影响

目的研究人垂体瘤转化基因1(human pituitary tumor transforming gene 1,PTTG1)上调表达对肺腺癌细胞株(A549)增殖和凋亡的影响.方法构建含PTTG1基因的真核表达载体,脂质体法转染A549细胞并用G418筛选出高表达的阳性克隆株,实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitation PCR)和免疫细胞化学(immunocytochemical assay,ICA)分别检测PTTG1 mRNA及蛋白表达的改变,3H胸腺嘧啶核甙(3H-TdR)掺入法检测细胞增殖活性,AnnexinⅤ异硫氢酸荧光素(FITC)试剂盒检测凋亡情况.结果成功构建含PTTG1基因的真核表达载体,获得上调表达PTTG1的A549细胞,转染含PTTG1基因重组质粒的A549细胞增殖活性较未转染组细胞及转染空白质粒组细胞均显著增强(P＜0.05);3组细胞间的凋亡率无显著差异.结论PTTG1基因能显著促进A549细胞的增殖,而对细胞凋亡没有影响.     

细胞膜上稳定表达融合蛋白CRT/vGPCR A549细胞株的建立

目的 将人钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因与病毒G蛋白偶联受体(virus G-protein couple receptor,vGPCR)基因进行基因重组,用此重组基因建立细胞膜上稳定高表达CRT/vGPCR融合蛋白的人肺癌A549细胞株.方法 从pSG5-vGPCR质粒中获得全长vGPCR基因片段并与CRT全长编码序列的3′端连接形成融合基因,然后将融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中.用此质粒转染人A549肺癌细胞,通过G418筛选建立稳定转染的A549细胞株,用RT-PCR检测重组融合基因的表达,用细胞免疫荧光分析鉴定融合蛋白的表达及其在细胞膜上的定位.结果 成功获得重组融合质粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR,经DNA序列测定证实融合基因两阅读框(ORF)对接无误.将上述质粒转染A549细胞后,建立了稳定转染CRT/vGPCR的A549细胞株,融合基因在A549细胞中表达并定位到细胞膜上.结论 通过与CRT基因融合重组,具有膜定位能力的vGPCR能将CRT蛋白高效包被到肿瘤细胞膜上.     

凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达

目的 利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因.并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定;回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+).最后,将A IF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达.结果 成功扩增617 bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合.RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P＜0.05).结论 成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达.     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建pcDNA3.1(-)/NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1/NNMT重组质粒中克隆得到NNMTcDNA全长序列,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT-PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功,经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

抗端粒酶M1RNA核酶真核表达载体构建及肝癌细胞转染的研究

目的构建抗人端粒酶RNA(hTR)的M1RNA核酶的真核表达载体,并筛选稳定转染核酶的肝癌细胞株。方法设计并应用PCR技术合成hTR模板的M1RNA核酶,应用pEGFPC1载体构建M1RNA核酶的真核表达质粒,应用脂质体LipofectAMINEAM2000转染肝癌细胞系HepG2,应用G418筛选稳定表达核酶的细胞株。结果测序证实hTR的M1RNA核酶基因被正确克隆入真核表达载体pEGFPC1,应用脂质体成功转染肝癌细胞系HepG2。结论成功构建了hTR的M1RNA核酶,并筛选出了稳定表达核酶的肝癌细胞株。     

正义、反义Id1真核表达载体的构建及其对胃癌细胞的转染

目的构建正义、反义Id1真核表达载体,并转染胃癌SGC7901细胞株,筛选稳定表达的细胞株。方法设计Id1基因两端的引物,RT-PCR扩增Id1全长序列。将目的基因插入pcDNA3.1＋/Hygro构建正义Id1真核表达载体,插入pcDNA3.1-/Hygro构建反义Id1真核表达载体。脂质体转染法转染胃癌SGC7901细胞系,潮霉素筛选稳定表达的细胞株。结果RT-PCR法获得长约530 bp的Id1全长序列,经酶切及测序鉴定正确后转染胃癌SGC7901细胞株。经过潮霉素筛选8周,获得抗性的细胞株。经Western-blot鉴定,转染正义Id1真核表达载体的细胞株Id1蛋白表达水平高于对照组,而转染反义Id1真核表达载体的细胞株Id1蛋白表达水平低于对照组。结论成功构建正义、反义Id1真核表达载体并转染胃癌SGC7901细胞株,为进一步研究打下基础。     

BAD慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的探讨促凋亡基因BAD(Bcl-2-associated death protein)重组慢病毒表达载体构建及其对肺癌A549细胞株增殖的影响。方法应用PCR法从含有目的基因的质粒pAV-MCMV-BAD-GFP中扩增BAD基因片段,克隆至慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen 1),应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染A549细胞,经流式细胞仪筛选稳定表达细胞株,Western blot鉴定重组慢病毒感染的A549细胞BAD的表达。采用CCK-8试剂盒定点检测细胞的光密度(OD)值,分析BAD蛋白过表达对A549细胞增殖能力的影响。结果酶切鉴定和基因测序证实长度为507bp的BAD基因成功克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1;重组慢病毒通过感染A549细胞株和流式细胞仪筛选出单克隆细胞株BAD-A549,Western blot检测结果显示,细胞培养BADA549细胞可稳定过表达BAD蛋白。体外增殖结果显示,细胞培养120~144h,BAD组的OD值均较对照组低(P<0.05)。结论成功构建了BAD重组慢病毒载体,获得稳定表达BAD的A549细胞株。BAD过表达能有效抑制A549细胞的增殖速度。     

SEMA3B基因真核表达载体的构建及对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

目的构建抑癌基因SEMA3B真核表达载体pc DNA3.1-SEMA3B,并检测其对肺癌A549细胞恶性生物学行为的影响。方法应用PCR扩增SEMA3B全长c DNA片段,构建真核表达载体pc DNA3.1-SEMA3B。克隆PCR、双酶切法、基因测序验证过表达载体构建成功。将pc DNA3.1-SEMA3B真核表达载体和空载体pc DNA3.1分别转染入A549细胞中,应用qRT-PCR、Western blot检测SEMA3B mRNA、蛋白表达水平的变化;MTS法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期;克隆形成实验检测细胞集落形成能力。结果 SEMA3B基因扩增片段与预测片段一致,克隆成功,且测序鉴定证实真核表达载体构建成功。转染pc DNA3.1-SEMA3B真核表达载体可上调SEMA3B mRNA、蛋白表达水平,且可抑制A549细胞的增殖,诱导凋细胞亡,细胞被阻滞在G1期,抑制细胞集落形成能力。结论成功构建了SEMA3B基因真核表达载体,抑癌基因SEMA3B在肺癌恶性生物学进程中可能发挥重要作用。     

RBM5 基因表达载体构建、稳定转染A549 细胞系的建立及功能的初步研究

目的：通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系, 初步研究RBM5基因过表达对A549 细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表 达的影响。方法：应用分段克隆法构建pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pcDNA3.1(+)/ RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别 检测经pcDNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pcDNA3.1(+)/RBM5-A549]及pcDNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞 [pcDNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pcDNA3.1(+)/RBM5-A549和pcDNA3.1(+)-A549细胞中剪 接相关因子DHX15的表达情况。结果：成功构建出pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过 表达阳性细胞株;pcDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均 P<0.01);cDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论：成功构建重组质粒 pcDNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细 胞周期,并使DHX15表达上调。     

CD151基因RNAi慢病毒载体构建与稳转细胞株建立

目的构建人的CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立A549-CD151i稳定细胞株。方法根据人的CD151基因序列,设计三对RNAi序列,筛选出有效序列,利用此有效序列,合成相对应的Oligo DNA,退火后形成黏性末端的DNA双链,与双酶切后的pshRNA—Lentivector载体连接得到LV—CD151i慢病毒载体,转化TOP10感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。用LV—CD151i和包装质粒共转染慢病毒包装用293T细胞,生产慢病毒并检测获得的病毒滴度。利用所获得的慢病毒感染A549细胞,筛选稳定转染细胞株。结果测序证实,成功构建CD151RNAi的慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为5×10^8ifu,并利用此病毒悬液,成功感染A549细胞,筛选到稳定表达细胞株。结论成功构建人CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立稳定的A549-CD151i细胞株。     

Effect of antisense transfecting of monocarboxylate transporter gene on biological characteristics of lung adenocarcinoma A549 cells

Objective: To study the influence of transfecting antisense expression vector of the first subtype of the monocarboxylate transporter (MCT1) gene into lung cancer cells on pHi regulation, lactate transportation and cell growth. Methods: MCT1 antisense gene recombinant vector was introduced into human lung cancer cell line A549 by electroporation. The transfected A549 cells resistant to G418 were selected. Positive clones were examined by using PCR. The changes of intracellular pH and lactate were examined with spec-trophotometric method. Cell growth was studied with cell growth curve. Results: Intracellular pH and lactate were remarkably decreased in the cells transfected pLXSN-MCT1 in comparison with A549 cells without transfection (P<0. 001). The growth of A549 cells transfected pLXSN-MCTl was also inhibited remarkably. Conclusion: MCT1 gene may play an important role in pHi regulation, lactate transportation and cell growth in tumor cells.     

辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL的构建及其对肿瘤细胞的体外诱导凋亡作用

目的：构建携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（hTRAIL）基因的辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL,并研究其在人肺腺癌细胞株A549中的表达及促凋亡作用。 方法：采用常规分子生物学方法构建表达质粒pEgr-hTRAIL,体外通过脂质体转染A549细胞,经G418筛选稳定转染细胞A549-shTRAIL,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测目的基因的表达,采用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡。 结果：经限制性内切酶酶切鉴定pEgr-hTRAIL表达质粒构建正确;稳定转染细胞A549-shTRAIL的hTRAIL mRNA表达量明显增加;稳定转染细胞A549-shTRAIL的凋亡细胞百分数明显增加,是A549细胞的1.8倍（P<0.05）。 结论：成功构建pEgr-hTRAIL表达质粒,体外稳定转染细胞A549-shTRAIL具有明显诱导凋亡作用。     

LyGD1基因转染对肺腺癌A549细胞生长及放化疗敏感性的影响

目的研究转染LyGDI基因对肺腺癌A549细胞生长及放、化疗敏感性的影响。方法用脂质体介导的方法,将构建于pEGFP载体上的LyGDI及空载体pEGFP-C1转入A549细胞,用G418筛选出稳定表达株,RT-PCR法了解LyGDI基因在转染细胞中的表达情况;用平板克隆形成实验研究细胞生长情况;体外划痕试验观察对细胞侵袭及转移能力的影响;甲基偶氮唑蓝法、克隆形成实验分别研究细胞对放、化疗的敏感性。结果转染细胞中有相应融合基因表达;与转染前比较,基因转染后,阳性细胞尤其是表达LyGDI的A549细胞克隆形成能力显著降低（P〈0.01）,对常用化疗药物顺铂和放射线敏感度显著提高（P〈0.05或〈0.01）。结论建立了稳定转染细胞株;LyGDI转入抑制了A549细胞的生长能力,且增加了细胞对放、化疗的敏感性。     

慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建

目的 利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系.方法 以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增HIF1α.酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应.PCR和基因测序鉴定重组质粒.重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞.包装好的病毒经过滤、浓缩后,利用稀释计数法测定病毒滴度.制备好的慢病毒感染A549细胞,采用药物筛选稳定转染细胞系.荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果.结果 PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功,重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功.成功包装获得高滴度LV-HIF1α.LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选,荧光显微镜下细胞带有红色荧光,Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组.结论 慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功.     

核糖体蛋白L39-L在肺癌1549细胞耐药机制中的作用

目的探讨核糖体蛋白L39-L在肺癌A549细胞对阿霉素类药物耐药机制中的作用。方法以体外培养的阿霉素耐药和敏感人肺癌A549细胞株，啊z01法提取总RNA，LightCyclerRNA扩增法进行荧光定量RT-PCR，检测阿霉素耐药A549细胞株、敏感细胞株之间的RPL39--L基因表达差异。经对人肺癌A549敏感细胞株体外培养、稳定转染RPL39-L基因后，3H—TdR掺人法进行生存率检测分析核糖体蛋白L39-L转染A549细胞、载体转染A549细胞和空细胞株对阿霉素的耐药性差异。结果荧光定量RT-PCR结果显示，耐药性人肺癌A549细胞株比敏感的A549细胞核糖体蛋白L39-L转录水平高7．3倍。1H1TdR掺入测定生存率显示，与质粒载体转染细胞或空细胞相比，转染核糖体蛋白L39-L的细胞表现出增强的阿霉素耐药性。结论核糖体蛋白L39-L基因可育旨在肺癌A549细胞的耐药机制形成机制中有作用。     

利用CRISPR/Cas9 系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。方法:设计针对敲除CBX2的short guide RNA（sgRNA）,并克隆到载体PX459中。将测序正确的重组质粒转染到A549细胞中,利用嘌呤霉素筛选转染阳性细胞并分离得到5个单克隆细胞系,通过Western blot方法检测构建的细胞系中CBX2蛋白表达情况。结果:成功构建了靶向CBX2的CRISPR/Cas9重组质粒,筛选出的5个单克隆细胞系中CBX2蛋白表达水平均显著下降。结论:成功利用CRISPR/Cas9 系统构建了稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。