胰腺癌新基因S100P与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建胰腺癌新基因SLOOP与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得SlOOP的全外显子片段.使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿棱质粒共转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和宿主胰腺癌细胞.荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定胰腺癌细胞中SLOOP的表达水平.结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的S LOOP基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞.荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.共转染后293T细胞上清可高效感染293T细胞,感染后宿主细胞中S LOOP高表达.结论:成功构建了S LOOP与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究SLOOP基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

含绿色荧光蛋白的慢病毒载体的构建及表达

目的　构建以泛醌启动子 (PUB)驱动绿色荧光蛋白 (GFP)表达的慢病毒载体三质粒表达系统 ,并建立其包装细胞系获得GFP的表达。方法　载体的构建采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法。三质粒系统中 ,转移质粒含PUB启动子及标志基因GFP ,包装质粒为ΔNRF ,内含CMV启动子和来自胰岛素基因的Poly(A)位点 ,包膜蛋白质粒编码水疱性口炎病毒G糖蛋白 (VSV -G)。载体构建成功后 ,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞——— 2 93T ,12h后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况。转染后 72h收集病毒上清 ,采用 6孔板培养感染细胞 ,荧光显微镜计数GFP阳性细胞法测定病毒滴度。结果　成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的质粒pXZ5。转染 2 93T细胞后 12h在荧光显微镜下均观察到较强的绿色荧光 ,证实了GFP的表达 ,成功构建了慢病毒载体的三质粒系统 ,建立了慢病毒载体的包装细胞系。 72h后 ,GFP的荧光强度较 12h增强 ,每一视野下 ,GFP表达阳性的细胞比例达 5 0 %左右。病毒浓度的测定在未进行超速离心浓缩的情况下达 2× 10 8U L。结论　成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的的慢病毒载体三质粒表达系统 ,转染2 93T细胞后获得了GFP的表达 ,完成了慢病毒载体包装细胞系的建立     

人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的构建人脑源性神经营养因子(hBDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(NSCs)。方法运用基因重组技术,将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD(pWPXL-GFP-IRES-GFP)中,构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP,MluⅠ、EcoRⅠ双酶切反应及测序分析加以鉴定。将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs,并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测。结果构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经MluⅠ和EcoRⅠ双酶切反应鉴定正确;测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致。三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装后慢病毒测定滴度为0.1×109~1×109TU/mL。pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光,可在体外扩增,NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性;细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞。结论成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs,转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性。     

人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建人脑源性神经营养因子(hBDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(NSCs).方法 运用基因重组技术,将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD(pWPXL-GFP-IRES-GFP)中,构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP,Mlu Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切反应及测序分析加以鉴定.将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度.将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs,并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测.结果 构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经Mlu Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切反应鉴定正确;测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致.三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度为0.1×109～1×109TU/mL.pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光,可在体外扩增,NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性;细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞.结论 成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs,转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性.     

人细胞色素P4502A13与GFP融合基因共表达慢病毒载体的构建与表达

目的:构建人细胞色素P450 2A13(CYP2A13)基因与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)共表达的慢病毒载体,并转染肺腺癌A549细胞使之持续高表达CYP2A13基因.方法:采用基因重组技术,将CYP2A13基因与GFP连接,构建慢病毒载体.转染293T细胞,包装后产生病毒...     

慢病毒介导的绿色荧光蛋白报告基因对人前列腺癌PC-3细胞的标记

目的探讨慢病毒介导的绿色荧光蛋白(GFP)标记人前列腺癌PC-3细胞是否影响其细胞生物学特性,以及GFP基因能否持久稳定表达,为下一步实验奠定基础。方法常规肿瘤细胞培养、传代,在细胞状态最佳时以不同病毒感染复数(MOI)实行GFP慢病毒对PC-3的感染,7天后在荧光显微镜下观察GFP在PC-3的表达情况。选取感染GFP阳性表达率最高的孔继续培养传代至第三代后,分别用镜下形态观、MTT测生长曲线、划痕实验来对比两种细胞的形态、活性、生长速度和生长状态,以评价GFP基因在PC-3细胞表达的稳定性。结果置荧光显微镜下,转染72h后,部分PC-3细胞可见绿色荧光,转染一周,绿色荧光表达最强。其中以MOI=20感染率最高,GFP阳性表达率为(92.3±1.2)%,GFP/PC-3在体外持续培养2、4、8周GFP阳性率没有明显变化。镜下形态观、MTT测生长曲线、划痕实验等结果显示,与转染前相比,慢病毒感染PC-3后,对细胞活力、增殖、凋亡和周期均没有影响(P>0.05)。结论 GFP慢病毒能够高效标记PC-3,并且不影响其生物学特性,GFP基因在PC-3能够持久稳定表达,可以用于下一步的细胞示踪研究。     

骨髓间充质干细胞经慢病毒转染绿色荧光蛋白后的体内观察

目的:观察经慢病毒转染绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)移植注入兔椎间盘后的荧光时效性.方法:体外培养并纯化BMSCs,并用含有GFP标记的重组慢病毒载体(Lentivirus-GFP)转染后移植入兔椎间盘,在移植后2、4、6、8、10、12周用激光共聚焦显微镜观察BMSCs荧光强度及细胞增殖情况,考察慢病毒转染GFP体内荧光维持时间.结果:经慢病毒转染GFP后的BMSCs,荧光显微镜下48 h开始显现绿色荧光,72 h荧光亮度达到最高.植入体内后8周内均能用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光,8周后荧光强度开始逐渐减弱,第2、4、6、8、10、12周6个时间点GFP-BMSCs的阳性率分别是(21.75±1.32)%、(33.07±3.53)%、(33.20±3.60)%、(29.90±4.23)%、(19.64±2.93)%和(10.91±3.43)%.结论:BMSCs在椎间盘微环境中能够稳定增殖,用慢病毒转染GFP的方法能在至少8周内可靠示踪其在椎间盘内的存活状态,8周后荧光强度开始逐渐减弱.     

绿色荧光蛋白基因在白血病细胞K562中的转导效率

目的：探讨慢病毒载体在白血病细胞中的基因转导效率,为白血病基因治疗提供关键依据。方法：应用1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)改造而成的第3代自身失活(SIN）慢病毒载体（lentiviral vector）系统,与鼠白血病病毒（MLV）SIN载体进行比较,通过荧光显微镜观察细胞内标记基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况,应用流式细胞术检测基因导入细胞百分比,评价两种载体系统在人白血病细胞系K562中的基因转导效率。结果：通过荧光显微镜可定性观察GFP在K562细胞中的表达情况,在同样的基因转导条件下,HIV载体转导的白血病细胞中被转导的标记基因GFP的表达强度及GFP阳性细胞数明显高于MLV载体转导的细胞。流式细胞仪定量检测HIV载体的转导效率接近100%,而MLV低于40%,两组间转导效率比较差异有显著性（P＜0.05）。结论：基于慢病毒载体基因转导的高效性,该载体系统可作为白血病细胞基因转导的极好工具。     

重组慢病毒载体pLKO-1-EGFP-puro的构建

目的：构建具有绿色荧光蛋白（GFP）标记及嘌呤霉素（puro）抗性的重组慢病毒载体。方法：改建慢病毒载体质粒pLKO-1-puro的多克隆位点（MCS）,以质粒pEGFP-C3为模板扩增出CMV-EGFP并与pLKO-1-puro连接,形成重组的慢病毒载体质粒pLKO-1-EGFP-puro,后者与包装质粒Δ8.2和包膜蛋白质粒VSV-G在293T细胞中进行包装,产生重组慢病毒颗粒,感染非洲绿猴肾细胞Vero细胞,观察GFP的表达。结果：成功改建了慢病毒载体质粒pLKO-1-puro并插入了CMV-EGFP,形成了新型慢病毒载体质粒pLKO-1-EGFP-puro。3质粒共转染293T细胞产生的重组慢病毒颗粒感染Vero细胞后高表达绿色荧光。结论：成功构建了高效的带GFP报告基因及嘌呤霉素抗性的慢病毒载体。     

绿色荧光蛋白-小鼠纤维介素蛋白融合基因表达载体的构建和表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠纤维介素蛋白(mfgl2)的融合蛋白表达载体，在仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，为mfgl2的RNA干扰体外研究提供简便的判断手段。方法：用PCR从mfgl2cDNA文库中扩增出mfgl2cDNA片段，插入到GFP表达载体pEGFP—N2中GFP基因序列的上游，构建成GFP—mfgl2融合基因表达载体pEGFP—mfgl2，将该载体转染到CHO细胞后24—48h，通过荧光显微镜观察并摄片。结果：扩增出长约1．3kb的基因片段，经双酶切鉴定和测序鉴定无误；重组载体转染CHO细胞后，在荧光显微镜下可观察到GFP的表达。结论：成功构建了pEGFP．mfgl2融合基因表达载体；重组载体可在CHO细胞中表达出GFP—mfgl2融合蛋白，为下一步进行mfgl2RNA干扰研究提供了简便的判断手段。     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34+细胞

目的 研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34⁺细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法 用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34⁺细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果 荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34⁺细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论 重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34⁺细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

Construction and Production of FluorescentPapillom avirus-like Particles

Ｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ（ＰＶｓ）ｌｉｆｅｃｙｃｌｅｈａｓｂｅｅｎｈａｍｐｅｒｅｄｂｙｔｈｅｕｎａｖａｉｌ－ａｂｉｌｉｔｙｏｆａｎｉｎｖｉｔｒｏｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｆｏｒｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓ．ＩｔｈａｓｂｅｅｎｆｏｕｎｄｔｈａｔＰＶｍａｊｏｒｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎＬ１，ａｌｏｎｅｏｒｗｉｔｈｍｉｎｏｒｐｒｏｔｅｉｎＬ２，ｃｏｕｌｄｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｉｎｔｏＶＬＰｓｗｈｅｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｓｙｓｔ…     

绿色荧光蛋白作为供体细胞标记物的可行性

目的研究绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的荧光稳定性及对转染细胞的影响,探讨其作为供体细胞标记物的可行性.方法将增强型GFP基因转入PC12细胞,经G418筛选并连续传代,在荧光显微镜下观察荧光蛋白阳性表达率;比较未转染细胞和转染细胞的形态、细胞活性、细胞周期等.结果第5代、第40代及未用G418筛选3个月后的转染细胞,荧光蛋白阳性表达率为100%;未转染细胞和转染细胞的形态无明显区别,细胞活性、细胞周期等差异无统计学意义(P＞0.05).结论GFP荧光稳定,对转染细胞无明显影响,是良好的供体细胞标记物.     

绿色荧光蛋白作为神经干细胞示踪标记的实验研究

目的研究携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的腺病毒感染神经干细胞(neural stem cells,NSCs)后的荧光稳定性和持久性及其对NSCs生物学特性的影响;探讨利用其作为NSCs示踪标记的可行性.方法利用GFP-腺病毒空载体感染NSCs(NSCs-GFP),经G418筛选并连续传代,在相差显微镜下观察未感染NSCs和感染NSCs的形态以及在荧光显微镜下观察感染NSCs及其诱导分化后的GFP表达情况;并检测NSCs-GFP的细胞活性和细胞周期.调整GFP标记神经干细胞浓度为1×105/μl,将其植入大鼠侧脑室内,观察其在脑内的表达.结果未感染NSCs和感染NSCs的形态学、细胞活性和细胞周期等无明显差异(P＞0.05).GFP在诱导分化后的NSCs-GFP子代细胞中有高表达,并且第1代和第20代NSCs-GFP的绿色荧光无明显差别.在植入侧侧脑室周围可见绿色荧光的强表达,且持续时间较长.结论 GFP荧光稳定持久,对转染细胞的生物学特征无明显影响,并且移植后的荧光呈长时间强表达,因此可以将其作为神经干细胞的示踪标记,这将有利于神经干细胞移植后的可塑性研究.     

PC12细胞中增强型绿色荧光蛋白基因的表达

目的：研究PC12细胞中增强型绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达。方法：用脂质体转染法将增强型GFP基因转入PC12细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞GFP表达及荧光强度。用碘化丙啶(PI)标记缺氧血清剥夺再灌流后的PC12／GFP细胞,在流式细胞仪上分选GFP阳性(活)细胞并测定其比例。结果：克隆转移后几乎所有细胞表达GFP,可连续稳定传40代以上。流式细胞仪可精确分选出GFP( )／PI(-)、GFP( )／PI( )、GFP(-)／PI(-)、GFP(-)／PI( )4组细胞。结论：增强型GFP基因可在PC12细胞中稳定高表达。PC12／GFP细胞株的建立为短暂脑缺血再灌流后干预治疗的研究提供了理想的对照实验细胞模型。     

逆转录病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染标记间充质干细胞

目的:为使间充质干细胞(MSCs)被绿色荧光蛋白(GFP)稳定标记,探讨通过逆转录病毒载体介导的GFP基因高效转染MSCs的方法,以便为研究在体干细胞分化奠定基础。方法:全骨髓法分离培养纯化大鼠MSCs,利用携带GFP基因的复制缺陷性逆转录病毒(R t-GFP)转染MSCs,荧光显微镜观察GFP阳性的MSCs。结果:R t-GFP转染后,80%~90%MSCs可激发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。结论:R t-GFP可以使MSCs获得长效稳定标记。     

绿色荧光蛋白基因在小鼠胚胎干细胞中表达效率的影响因素分析

目的：研究绿色荧光蛋白（GFP）基因在小鼠胚胎干细胞系R1中表达的影响因素。方法：构建3个不同的GFP真核表达载体。并从转录,蛋白表达水平比较了它们整合于宿主细胞染色体中的表达效率。结果：在GFP蛋白表达水平上,含肽链延长因子（EF）启动子的表达载体和所转染的克隆明显高于含CMV启动子及含双拷贝CMV-GFP表达单元的表达载体;而录水平与蛋白质水平的测定结果相一致。结论：（1）在NIH3T3和R1胚胎干细胞系中,EF启动子引导下的GFP基因表达效率明显高于CMV启动子;（2）外源基因表达单元的拷贝数在染色体中的少量增加,不能明显提高表达效率;（3）获得了在R1胚胎干细胞系中稳定、高效表达GFP的载体,为后续工作奠定了基础。     

绿色荧光蛋白为报导基因快速筛选重组羊痘病毒表达载体

目的利用绿色荧光蛋白（GFP）为报导基因,构建通用、高度减毒的外源基因表达载体IA82△121-V。方法抽提病毒
DNA,扩增ORFV132左右同源臂,构建穿梭质粒pSPV-132LF-EGFP-132RF;转染OFTu细胞,与羊痘病毒IA82△121同源重组,
通过荧光信号筛选重组体IA82△121-V,PCR及测序鉴定,并经病毒滴定、体外血管内皮细胞增殖实验以检测ORFV132缺失后
的功能变化。结果成功快速筛选出重组羊痘病毒IA82△121-V,初步判断ORFV132的缺失不影响病毒体外的生长复制功能,
但是减轻了其毒力。结论利用GFP为报导基因能简单、快速、稳定地筛选出重组羊痘病毒,高度减毒的重组羊痘病毒IA82△
121-V有望成为新一代外源基因表达载体。
     

绿色荧光蛋白基因在脂肪细胞分化研究中的应用

目的建立人脂肪细胞分化的绿色荧光蛋白活体检测动态模型，为进一步进行脂肪细胞分化及其相关基因表达研究奠定基础。方法用PCR法从培养的人前脂肪细胞总DNA中扩增出过氧化物体酶增殖物激活受体γ2（PPARγ2）基因启动子．将该启动子插入真核细胞表达载体pEGFP-1后转染3T3成纤维细胞及人前脂肪细胞，并诱导脂肪细胞分化，结果在胰岛素、地塞米松及30异丁基-1-甲基黄嘌呤诱导下，人前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞时表达绿色荧光蛋白基因，而3T3细胞则不能防导为脂肪细胞及表达绿色荧光蛋白基因。结论脂肪组织特异表达的PPARγ2基因启动子与绿色荧光蛋白基因构成的重组基因转化人前脂肪细胞后，能够用来动态活体检测脂防细胞分化状态。这一模型的建立为脂肪细胞分化调控的分子机制研究提供一个更加方便的检测途径。