介导人硫氧还蛋白基因转移的重组腺病毒构建

目的应用基因重组方法构建携带人硫氧还蛋白(hTRX)基因的复制缺陷型重组腺病毒。方法用内切酶、RT-PCR、测序方法获得目的基因片段,然后将其cDNA克隆至表达载体pShuttle构建hTRX的重组真核细胞表达载体pShuttle-hTRX,在HeLa细胞中进行瞬时表达检测。从真核表达载体pShuttle-hTRX切下目的基因,并插入至腺病毒载体构建hTRX的重组腺病毒载体Adeno-hTRX,经PCR方法亦证明了成功构建腺病毒重组体。重组腺病毒在293细胞中扩增、纯化。结果成功构建了携带人硫氧还蛋白基因的复制缺陷型重组腺病毒,并以多种方法证实了构建载体的正确性。结论正确构建的人硫氧还蛋白重组腺病毒载体,可为基因治疗心血管系统疾病打下良好基础。     

弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒。方法设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAC而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况。结果PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达。结论成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8。     

人硫氧还蛋白基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人硫氧还蛋白(hTRX)cDNA序列,进行真核表达载体的构建.方法 应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中,经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定;利用阳性脂质体Lipofectamine将其转入COS-7细胞(瞬时表达细胞),RT-PCR检测其表达情况.结果 将所得序列与GenBank(J04026)提供的序列比较,其酶活性中心(Trp-Cys-Gly-Pro-Cya)和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确;COS-7细胞中有hTRX的表达.结论 成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,并在COS-7细胞中得到了表达,为进一步探讨hTRX的生物活性和应用奠定了基础.     

人硫氧还蛋白基因分子克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人硫氧还蛋白（hTRX）cDNA序列并进行真核表达载体的构建。方法应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中;经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定。结果将所得序列与GenBank（J04026）提供的序列比较,其酶活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys）和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确。结论成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX。     

结核分枝杆菌Rv1009基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌Rv1009基因真核表达载体。方法PCR扩增Rv1009基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞后,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pCDNA-Rv1009,RT-PCR结果证明Rv1009可在P815细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有Rv1009蛋白的细胞着染。结论成功构建了结核分枝杆菌Rv1009基因的真核表达载体pCDNA-Rv1009,Rv1009基因可以在P815细胞中表达。     

PRL-3真核绿色荧光蛋白表达载体的构建及其在结肠癌SW480细胞中的表达

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PRL-3,为PRL-3基因功能研究奠定基础.方法:设计人PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW620细胞总RNA,应用RT-PCR方法获取人PRL-3全长cDNA,分别克隆至T载体及真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染大肠癌细胞SW480,应用G418进行筛选获取PRL-3稳定表达细胞克隆,应用荧光定量PCR检测PRL-3基因表达.结果:获得522 bp的PRL-3基因编码序列并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN1-PRL-3,该重组载体能够在SW480细胞中稳定表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-PRL-3和建立PRL-3稳定表达SW480细胞,为进一步深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定基础.     

人GOR基因重组体的构建及其在C_(os)—7细胞内的表达

目的构建能正确表达人GOR蛋白的真核重组体,制备人源性GOR蛋白。方法将人GOR基因片段亚克隆到真核表达载体PCDNA31（－）／Myc－HisA,B,C系统,PCR法和EC。RⅠ酶切筛选重组体,KpnⅠ酶切鉴定重组体方向,正向重组体用磷酸钙共沉淀法分别转染Cos－7细胞。用PCR法和ELISA法分析重组体是否转入Cos—7细胞并能正确编码人GOR蛋白。最后制备人GOR蛋白。结果所构建的人GOR基因重组体A、B、C分别转染Cos—7细胞后,都能在细胞内转录;但只有重组体A能正确表达人GOR蛋白。结论　本研究所构建的人GOR基因真核重组体能正确表达人GOR蛋白。     

pEGFP-C3-hNIS重组质粒的构建及其在人胃癌BGC-823细胞的表达

目的构建人钠碘转运体（hNIS）基因真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3-hNIS,并研究重组hNIS基因在人胃癌BGC-823细胞中的表达情况。方法采用Trizol一步法从甲状腺手术患者的甲状腺组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到hNIS的可编码区基因,并克隆到T载体上,测序后亚克隆到真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3的多克隆位点,获得重组真核表达载体pEGFP-C3-hNIS。分别将pEGFP-C3-hNIS重组质粒（实验组）和pEGFP-C3（对照组）瞬时转染至人胃癌BGC-823细胞中,转染48 h后,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达情况,并通过Western blot方法检测hNIS基因的蛋白表达水平。结果序列分析证实克隆片段与GenBank公布的hNIS基因序列（序列号：NM-000453）相似性达99.90%。转染48 h后,实验组与对照组细胞均可观察到较强绿色荧光信号,用hNIS基因特异性抗体检测表明实验组hNIS表达水平明显高于对照组。结论成功构建hNIS真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3-hNIS,并能在人胃癌BGC-823细胞中高表达。     

人STIM1基因真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的: 构建人STIM1基因真核表达载体, 并观察其在人肝细胞株(HL-7702)中的表达.方法: 提取HL-7702细胞总RNA, RT-PCR扩增,经纯化回收后将片段克隆至pGM-T载体, 酶切琼脂糖凝胶电泳分析鉴定并测序, 最后用重组质粒转染HL-7702细胞, 通过PCR-电泳和Western blot法检测STIM1基因的表达.结果: PCR扩增的片段长度为342 bp, 测序结果以及重组质粒pGM-T-STIM1的酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果均证明STIM1基因成功克隆到真核表达载体中. PCR-电泳和Westernb l o t实验结果分别显示转染重组质粒后的HL-7702细胞在基因与蛋白水平表达STIM1均有所增强.结论: 成功构建了人STIM1基因的真核表达载体pGM-T-STIM1, 并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达, 为研究STIM1蛋白在人肝细胞内Ca2+浓度调控方面及其对人肝细胞分泌功能的影响奠定了良好的实验基础.     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12的构建与表达

目的构建黑色素瘤抗原基因-12(MAGE-12)绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,并在真核细胞中表达。方法于2005-10～2005-12对郑州大学第一附属医院应用RT-PCR方法,从人肺癌组织中扩增出MAGE-12cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至质粒载体(pGEM-Teasy),测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-C3)上,并转染真核细胞,观察其在真核细胞中表达。结果经酶切及基因序列分析验证,PCR扩增出944bp的MAGE-12基因并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,该重组载体能够在真核细胞中广泛表达。结论成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,为建立肿瘤细胞疫苗打下基础。     

轮状病毒VP4蛋白与肠产毒性大肠杆菌热稳定肠毒素蛋白的融合表达

利用DNA重组技术将轮状病毒（Rotavirus RV)VP4蛋白主要抗原编码区基因与产肠毒素大肠杆菌(Enteotoxigenic Escherichia coli ETEC)热稳定肠毒素（Heat-stable enteotoxin Escherichia coli ST)基因融合，插入原核表达质粒pET-28a( )中，经PCR、酶切、测序分析表明已将vp4-st片段克隆入PET－28a( ),而且具有正确的读码框和方向性，正确构建了VP4－ST的融合表达载体pET28-VP4-ST。表达质粒转化受体菌BL21（DE3）plysS，取经IPTG诱导后表达的目的蛋白进行SDS－PAGE、凝胶薄层扫描分析。结果表明：表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，大小约40．2kDa，表达的蛋白量占菌体总蛋白的13．048％。     

染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的构建人染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒。方法以通过全基因合成的FHIT cDNA为模版,用PCR技术扩增,扩增片段用BamHI/Xho I双酶切后克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,用DNA测序法鉴定重组质粒。结果质粒DNA测序显示与文献报道的人FHIT cDNA序列一致。结论成功构建出含人FHIT基因的真核表达质粒。     

四川株多房棘球绦虫elp基因融合表达载体的构建及其诱导表达

目的　实现多房棘球绦虫elp基因在原核中的表达 ,为进一步研究多房棘球绦虫ELP抗原的诊断及免疫保护性提供前提条件。方法　应用RT -PCR方法从中国四川株多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA获得elp基因编码序列 ,克隆测序后亚克隆于含有硫氧环蛋白 (Trx)基因的高效原核表达载体pET32a(+)。经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ELP/Trx融合蛋白。SDS -PAGE及Westernblot进行鉴定。亲和层析纯化ELP/Trx融合蛋白 ,用于ELISA检测患者血清特异性抗体。结果　酶切鉴定显示本研究已将elp基因编码序列插入 pET32a(+)的多克隆位点 ,成功地构建了pETrx -ELP融合蛋白原核表达载体。SDS -PAGE及Westernblot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了ELP/Trx融合蛋白。检测 10份包虫病人血清均阳性 ,10份肝吸虫病、10份乙肝病人和 10份健康人血清均为阴性。结论　中国四川株多房棘球绦虫elp基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达 ,初步实验结果显示该融合蛋白对包虫病具有诊断价值。     

靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的利用siRNA表达载体构建靶向人类心脏发育候选基因hole的pSUPER RNAi载体系(pSUPER-hole)及筛选稳定产毒的细胞克隆。方法化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向人类心脏发育候选基因hole的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、XhoⅠ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSU-PER-hole)。通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果。将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞H9c2,经过puro抗生素的筛选,建立稳定产生逆转录病毒的细胞模型,采用RT-PCR检测其抑制效果。结果 pSUPER-hole载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。重组载体转染包装细胞,筛选的细胞克隆均可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。RT-PCR检测表明pSUPER-hole能成功抑制hole基因的表达。结论靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体构建成功。     

结核分枝杆菌CFP10的基因克隆及表达

目的克隆结核分枝杆菌CFP10基因,在大肠杆菌中进行表达,为进一步研究其在结核病诊断中的价值奠定基础。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR方法对CFP10的基因进行扩增,以PET-30a(+)为载体构建重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α中,抽提质粒,进行双酶切鉴定,再转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达形式。结果构建了具有正确基因序列的CFP10重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。     

小鼠巨噬细胞Ipr1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠Ipr1(intracellular pathogen resistance 1)基因真核表达载体。方法从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pMD19-Tsimple载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复后将Ipr1基因亚克隆于原核真核双系统表达质粒pQE-TriSystem中得到pQE-TriSystem-Ipr1,用脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,RT-PCR鉴定Ipr1基因的表达。结果从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变,经点突变修复后与GenBank报道的Ipr1基因序列一致。亚克隆获得重组质粒pQE-TriSystem-Ipr1,转染RAW264.7细胞经RT-PCR扩增出Ipr1基因相应大小的DNA片段。结论成功调取小鼠Ipr1基因并成功构建含Ipr1基因的真核表达载体,为进一步研究Ipr1基因的功能奠定基础。     

曼氏血吸虫虫卵蛋白IPSE基因合成、表达及特性分析

目的合成并表达曼氏血吸虫虫卵白介素4诱导物(IPSE)基因,并对其免疫特性进行分析。方法应用重叠PCR方法合成曼氏血吸虫IPSE基因,将其定向克隆至表达载体pET32a(+)的硫氧还蛋白(Trx)序列下游,构建重组表达质粒IPSE/pET32a(+)。将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,表达Trx-IPSE融合蛋白。大量制备表达产物,用镍螯合亲和层析胶在变性条件下纯化重组Trx-IPSE融合蛋白。用大量PBS对变性融合蛋白进行透析,获得部分复性的可溶性Trx-IPSE融合蛋白。应用蛋白质印迹(Westernblotting)分析其是否能被慢性日本血吸虫病患者血清中IgG抗体所识别,及其与健康人血清中IgE抗体的结合能力。结果人工合成的IPSE基因序列与天然基因序列完全一致。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,含重组质粒的转化子细菌能表达相对分子质量(Mr)约35700的蛋白分子,与预计Trx-IPSE融合蛋白的相对分子质量大小相符。Westernblotting分析结果显示,变性的和复性的Trx-IPSE融合蛋白均能被慢性日本血吸虫病患者血清中IgG抗体识别,融合蛋白Trx-IPSE能与健康人血清中IgE抗体非特异性结合。结论曼氏血吸虫IPSE基因合成获得成功,重组表达的IPSE具有与天然抗日本血吸虫抗体反应和与IgE非特异性结合的能力。     

结核分枝杆菌蛋白Hsp16.3的基因克隆以及表达

目的克隆结核分枝杆菌蛋白Hsp16.3的基因,在大肠杆菌中进行表达。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR方法对Hsp16.3的基因进行扩增,以pET30a为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析蛋白表达形式。结果构建了具有正确基因序列的Hsp16.3重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。     

日本血吸虫溶血磷脂酶编码基因真核表达载体的构建和表达及鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出溶血磷脂酶编码基因(Si1539),并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),旨在提取重组抗原进行免疫原性分析,并用于免疫学诊断.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,反转录生成cDNA,PCR法扩增出Sj1539基因,通过克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),然后转染至人宫颈癌细胞株(HeLa细胞)中表达,表达产物用Western印迹法进行鉴定.结果 Sj1539基因PCR扩增产物片段长度为684 bp.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539经BamH I、Xho I双酶切和PCR扩增鉴定,证实Sj1539基因已成功插入.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539在HeLa细胞中的表达产物经Western印迹法鉴定能够与日本血吸虫感染的兔血清反应,其相对分子质量(Mr)约为25×103.结论 成功构建了日本血吸虫Si1539基因真核表达载体,并获得了表达产物.

Abstract：

Objective Schistasoma japonicum(S.japonicum)lysophospholipase gene(Sjl539)from cDNA of S japonicum adult worms was amplified and subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)for expression of recombinant antigen and immunogenicity analysis.Methods Total RNA of S.japonicum was extracted to generato cDNA by RT-PCR.The Sj1539 gent was amplified.The DNA fragment was subcloned into eukaryofic expression vector pcDNA3.1(+)following insertion and amplification in pGEM-T.The recombinant plasmid was transfected into human cervical carcinoma cell strain(Hela cells)and expression products were identified by Western blotting.Results The size of PCR product was approximately 684 bp.It was confirmed that Sj1539 gene had been inserted successfully by the recombinant plasmid digested with two enzymes and PCR.It was verified that the expression product could react with S.japonicum-infected rabbit serum by Western blotting and the molecular weight was approximately 25×103.Conclusions The eukaryotie expression vector carrying Sj1539 gene has been established and the expression product has been obtained.