脐血造血细胞的体外扩增及分化特性 *

了解造血生长因子的不同组合对人脐血CD34 +细胞的扩增效应及分化特性。方法： 采用人脐血单个核细胞(MNC)经rhIL-1,rhIL-3,rhIL-6,rhG-CSF,rhGM-CSF和rhSCF的不同组合进行体外扩增培养, 动态观察了不同细胞因子组合对有核细胞总数的扩增数量,应用流式细胞技术(FACS)动态分析了造血细胞的表面标志, 并对液态扩增后造血细胞的粒 巨噬集落形成率(CFU-GM)进行了动态观察。结果:经上述6种细胞因子培养20 d, 有核细胞总数增殖44倍, 液态扩增培养8 d后, CFU-GM比原代MNC增加14.74倍, 扩增18 d后, CFU-GM明显减少, 仅为原代MNC的6.42倍, 且集落小于前者。扩增培养至6～8 d时, CD34+细胞总数是原代MNC的127.79～196.40倍, 18 d时下降至101.51倍。结论： 外源性造血生长因子可使脐血CD34+细胞及CFU-GM产生明显的扩增效应。     

脐血造血细胞的定向诱导分化

大剂量化疗是临床治疗恶性肿瘤和骨髓移植前预处理的常规手段之一,但它可导致粒细胞减少,从而引发严重的感染.虽然应用抗生素和造血生长因子可以减少感染并发症,但大剂量化疗往往损伤的是晚期祖细胞和白细胞,由此而导致的感染则需成熟的白细胞来治疗.脐血作为一种新的血源,含有较多的白细胞和具有自我复制及多向分化潜力的造血干、祖细胞,体外诱导造血细胞向粒系定向分化,可以增加脐血粒细胞群数量.目前的研究多限于针对分离纯化的CD34+细胞和采用小牛血清培养[1].我们采用脐血单个核细胞研究脐血血清联合造血生长因子诱导干/祖细胞向粒系的定向分化,为单份脐血粒细胞输注治疗大剂量化疗后的感染奠定实验基础.     

人脐血造血细胞的体外扩增

脐血作为造血于/祖细胞的来源具有诸多优点,应用前景广泛.采用多种造血生长因子组合,建立体外大量扩增脐血于/祖细胞的培养体系,已逐渐成为人们关注的热点.本研究动态观察了脐血单个核细胞(MNC)经不同造血生长因子组合刺激的增殖效应.结果显示,①脐血MNC培养至11～20d时,达到增殖高峰,21d后细胞增殖明显变缓.20d时,不同的造血生长因子组合对脐血造血于/祖细胞扩增倍数不同,结果如下,(a)rhIL-1 rhIL-3 rhIL-6 rhG-CSF rhGM-CSF rhSCF组合使有核细胞总数增殖为初始的43倍;     

脐血造血细胞移植的研究进展

脐带血中含有不同分化阶段的造血细胞,这些造血细胞含量丰富,增殖能力强,对造血调控因子的反应性高,表现出强大的造血潜力.动物实验发现,供鼠的脐血造血细胞可在受体鼠内植活.初步的临床实践表明,脐血造血细胞移植不但可有效的重建受体的造血功能,而且移植后移植物抗宿主反应轻,脐带血作为一种取之不尽的造血细胞源,具有广阔的临床应用前景.     

脐血来源树突状细胞的体外扩增、鉴定及冻存

目的研究脐血来源树突状细胞（DCs）的体外扩增、鉴定和冻存。方法用Ficoll分离获得脐血单个核细胞，以重组hGM—CSF、hIL-4及hTNF-α体外诱导培养14d。在DCs发育过程中，在光镜和电镜下观察其生长情况，应用流式细胞仪检测DCs表型。采用台盼蓝拒染法测定DCs增殖水平，MTT法检测DCs活化的T细胞对肿瘤细胞的杀伤性。同时用二甲亚砜作为保护剂，DCs经过-20℃和-80℃降温，在-196℃液氮保存，然后40℃水浴复苏。结果第6天体外培养的DCs由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞，随着培养时间的延长，此类细胞数量增多，第14天为形态不规则的毛刺状，为典型树突状细胞形态。流式细胞仪检测表明，成熟DCs高水平地表达HLA—DR、CD80、CD83、CD1a、CD11c。被激活的T细胞对2种来源于不同组织的肿瘤细胞均产生了明显的杀伤性。冻存DCs和新鲜DCs的生物活性无明显差异。结论脐血单个核细胞细胞经hGM—CSF＋hIL-4＋hTNF—α体外培养，能诱导出DCs，为进一步开展DCs的实验研究与临床应用奠定了基础。     

脐血造血干/祖细胞体外扩增实验研究

目的:探讨人脐血造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSC/HPC)在适合临床移植条件下体外扩增以获得理想的造血干/祖细胞数量的最佳细胞因子组合及扩增时间,为脐血经体外扩增后成为高体重受者克服脐血移植细胞数量不足及缩短植入时间提供客观指标。方法:采集脐血4份,分离单个核细胞(mononuclear,MNC),免疫磁珠分选(MiniMACS)CD+34细胞,分别在细胞因子组合为A:SCF+FL+TPO、B:SCF+FL+TPO+IL蛳3及C:SCF+FL+TPO+G蛳CSF支持的无血清、无基质的液体培养基中扩增培养14 d,收集扩增前、扩增后7 d及14 d的细胞进行细胞表型分析、半固体集落培养及端粒酶活性分析。结果:在含细胞因子IL蛳3组扩增培养7 d及14 d,均获得了总有核细胞数(total nucleated cells,TNC)及集落形成细胞(colony蛳forming cell,CFC)最大的扩增倍数。扩增7 d,IL蛳3组的CD+34细胞扩增倍数为(10.11±7.21 )倍,较其他两组稍低,但无统计学意义;三组CD+33细胞、CD+41细胞、CD+71细胞也得到了较大程度的扩增,IL蛳3组高于其他两组;3组扩增后的细胞端粒酶活性均上调,7 d时A值达最高,IL蛳3组低于G蛳CSF组(P =0.008)。随着扩增时间的延长,扩增后的细胞端粒酶活性下降;CD+34细胞占TNC的比例也明显下降,部分定向祖细胞的比例也出现先升高后     

树突状细胞体外诱导分化扩增方法的研究进展

树突状细胞(dendritic cells,DCs)是一种重要的免疫辅佐细胞,是体内最广泛的专职抗原递呈细胞(profession-alantigen presenting cells),具有强大的激活静息T细胞,激发初次免疫应答的独特功效,在肿瘤免疫治疗中,具有潜在的应用价值.     

脐血CD+34细胞扩增前后端粒酶活性及微卫星遗传稳定性的研究

目的：通过检测脐血CD^ 34细胞扩增前后端粒酶活性及微卫星DNA序列，探讨其遗传稳定性。方法：用Mini MACS磁分离技术分离脐血CD^ 34细胞．体外扩增2周．PCR-ELISA方法检测扩增前后细胞的端粒酶活性；用PCR银染方法对脐血CD五细胞扩增前后5个微卫星序列进行比较分析。结果：脐血CD去细胞体外扩增过程中，端粒酶活性呈现先升后降的趋势,0天时。端粒酶活性相对值的中位数为14％，第7天明显增高，达57％，第14天回落至29％；扩增前后，BAT-25、Mfd41、D5S436、D5S396、D2S123 5个微卫星位点未见改变。结论：脐血CD^ 34细胞扩增过程中，端粒酶活性会暂时性升高，所测的微卫星位点未见改变。     

人骨髓,脐血CD34^＋干细胞体外扩增的树突状细胞的表型及 …

目的：从人骨髓造血前体细胞体外培养扩增树突状细胞（ＤＣｓ）,测定其表型及Ｔ细胞刺激活性。方法：采用Ｍｉｎｉ－ＭＡＣＳ分离技术,从正常人骨髓、脐血分离ＣＤ３４＾＋造血干细胞,体外以重组ｈＧＭ－ＣＳＦ,ｈＴＮＦ－α,ｈＩＬ－３诱导培养２周,流式细胞术检测扩增细胞的表面表型及细胞内ＩＬ－１２的表达,体外同种混合淋巴细胞反应检测扩增ＤＣｓ的Ｔ细胞刺激活性。结果：从正常人骨髓、脐血分离得到高纯度（〉９０％）     

脐血CIK细胞的体外扩增特性研究

目的动态观察脐血CIK细胞体外扩增特性及其表面抗原变化,并对其细胞毒活性进行检测。方法提取健康足月产妇的胎儿脐带血单个核细胞,第0天加入rh-IFN-γ,第1天加入rhIL-2、抗CD3单克隆抗体来诱导培养CIK细胞,以后每3d更换培养液1次,并补加rhIL-2及抗CD3McAb。用流式细胞仪动态检测培养物的免疫表型变化,同时进行细胞计数,并使用MTT法检测各阶段脐血CIK细胞的细胞毒活性。结果脐血CIK细胞在培养2￣3周后大量增生,扩增约(64.4±16)倍,其中CD3+CD5+6细胞扩增约900倍,是CIK的主要效应细胞,且CD+3CD+8的T细胞达(74.7±10.42)%,CD2+5细胞比例也明显增加,而CD3+4细胞比例却减少。另外CD+3CD1+6CD5+6细胞比例升高最显著;脐血CIK细胞对白血病细胞株K562,HL-60及原代白血病细胞有较高的杀伤活性。结论脐血单个核细胞在体外可以被培养为CIK细胞,且扩增潜能极大,扩增倍数极高,细胞毒活性强,脐血CIK细胞有望应用于恶性肿瘤的生物免疫治疗。     

脐血CD34~+细胞扩增中系特异性分化抗原的变化

目的：探讨CB CD34^ 细胞扩增的最佳HGF组合及移植时机。方法：CB CD34^ 细胞培养于无血清培养液中,分别加入下列HGF,A组：对照组（无HGF）;B组：SCF,IL－3,IL－6;C组：SCF,IL－3,IL－6,G－CSF,Epo;D组：SCF,IL－3,IL－6,TPO,Flt3-L;E组：SCF,IL－3,IL－6,TPO,Flt3-L,G-CSF,Epo。培养22d,对不同培养时间的细胞进行NC数量及系特异性CD动态观察。结果：同对照组相比,扩增组NC和CD34^ 细胞均有不同程度的扩增。NC和CD34^ 细胞扩增高峰分别在第10天和第6天。E组的扩增效果最佳。CD检测显示,各组CD34^ 及CD34^ CD^38-细胞的比例逐渐减少,但B,D2组的CD34^ CD38^-细胞的比例在第6天有一过性回升,CD154^ ,CD13^ ,CD61^ 及Gly-A^ 细胞的比例则逐渐升高,D组CD34^ 及CD34^ ,CD38^-细胞的比例明显地高于E组（P＜0．01）,CD3^ 和CD19^ 细胞的比例在扩增中呈下降趋势,结论：HSPC分化程度与HGF组合及培养时间有关。就细胞总数而言,E组HGF组合最佳,但就HSPC含量来说,以D组为优,第1周扩增产物中HSPC含量较高,移植时间以扩增的第6－10天为宜。     

Human Umbilical Cord Blood for Hematopoietic Progenitor Cells Transplantation

Human umbilical cord blood (HUCB) represents a unique source of transplantable hematopoietic progenitor cells. HUCB from a newborn sibling has been used successfully for hematopoietic reconstitution of more than 50 children with congenital and malignant diseases. Moreover, 13 HUCB transplants have been performed from unrelated donors. Bone marrow transplantation (BMT) has rapidly progressed over the last two decades offering cure and prolonged disease free survival in patients with hemato-oncological malignancies, metabolic and genetic disorders. BMT is limited by the paucity of HLA-matched donors and the morbidity and mortality due to graft-versus-host disease (GVHD). HUCB could alleviate some of the problems associated with BMT and establishment of HUCB bank and registries could become an easily available source of suitable stem cells for transplantation. This review focuses on identifying current scientific problems and clinical achievement as well as noting the most recent developments in the field with special attention to the collection, processing, cryopreservation, and banking of HUCB. Progenitor cells from cord blood may provide an excellent vehicle for future gene therapy. As a result of relative immunodeficiency at birth, it is likely that partially matched unrelated cord blood transplants (CBT) would be successful due to a lower risk of GVHD related problems. Therefore, the establishment of large cord blood banks is of the utmost importance, in the future.     

Ultrastructural Features of CD34+ Hematopoietic Progenitor Cells from Bone Marrow, Peripheral Blood and Umbilical Cord Blood

Hematopoietic progenitor cells from different sources have been widely characterized, but their ultrastructural morphology has never been described in detail. In this study, imunomag-netically separated CD34⁺ cells from normal bone marrow (BM), mobilized peripheral blood (PBSC) and human umbilical cord blood (CB) were studied by transmission electron microscopy (TEM) using a cytochemical method which reveals endogenous myelo-peroxidase (MPO) activity. This technique is particularly suited for detecting early signs of the myeloid commitment. The CD34⁺ cells from PBSC were morphologically very homogeneous and 94.7 ± 4.5% of these cells were MPO^-: these ultrastructural features are generally considered typical of immature cells. The CD34⁺ BM cells were instead more heterogeneous, with 24.6 ± 7.4% showing intense MPO activity. The ultrastructural characteristics of CB cells fell between those observed in PBSC and BM, but there was a high percentage of morphologically immature cells with no evidence of MPO activity (about 83%). The number of apoptotic cells within samples from different sources was also examined both by TEM and flow cytometry. The percentage of apoptotic cells was 0.7% in PBSC, 2.3% in BM, 2.9% in CB from vaginal delivery and 11.6% in CB from cesarean section. These observations confirm the relative phenotypic immaturity of CB in comparison with BM cells; they also suggest that CB collected after cesarean section may be associated with reduced stem cells viability.     

人脐血来源树突状细胞的体外培养及鉴定

目的建立脐血来源树突状细胞（dendritic cells，DC）的体外培养方法，为进一步研究DC的功能、特性及临床应用提供了技术方法。方法取正常人脐血，分离获得单个核细胞，利用贴壁法去除悬浮细胞后，加入1000U／mL rhGM-CSF、500U／mL rhlL-4，至d7再加入500U／mLTNF-α进行培养，收集培养至d10的DC，分别从形态学、免疫表型和功能上加以鉴定。结果体外培养的d10，大量细胞出现典型的树突状形态；经流式细胞仪检测，高表达HLA-DR、CD80、CD83、CD1a、CD11c；混合淋巴细胞反应显示其在体外能有效刺激同种淋巴细胞增殖。结论在合适的细胞因子组合下，能够在体外利用脐血成功诱导出成熟DC。     

Caspase-3在脐血CD34+造血干/祖细胞中的表达及其意义

目的 为了探讨脐血CD34~+干/祖细胞在不同细胞因子支持下体外扩增过程中Caspase-3表达及意义,我们采用了RT-PCR、Western blot和流式细胞仪技术测定了脐血CD34~+细胞在体外扩增过程中的生物学特性及Caspase-3的表达。检测结果显示,Caspase-3mRNA在新鲜分离的脐血CD34~+细胞中低水平表达,在细胞因子支持下体外培养3天,扩增的CD34~+细胞中Caspase-3mRNA和蛋白质水平表达上调,但在这两种细胞中仅能检测到分子量为32KDa的非活性酶原形式的Caspase-3;随着体外培养时间的延长,在IL-3,IL-6和GM-CSF组合条件下,Caspase-3被激活,可检测到分子量力20KDa的裂解片段。本研究表明,虽然造血干细胞的凋亡是个复杂的过程,但在脐血CD34~+干/祖细胞体外扩增过程中,Caspase-3参与了凋亡事件并发挥着重要的作用。     

4 500份脐带血造血干细胞保存研究

目的:制备和保存满足临床造血干细胞移植要求的脐带血造血干细胞.方法:按标准操作规程(sOP)进行脐带血的采集、分离、冷冻保存和检测.结果:在采集的6 232份脐带血中,采集的净血量、TNC、CD34 细胞百分率和CFU-C产率均值分别为90.7±22.2ml,10.5±3.4×108,0.24±0.15%,78.9±44.14/105NC.已保存符合标准的脐带血4 500份;分离后TNC回收率超过80%,而CD34 细胞、CFU-C回收率则超过90%,细胞活率无明显改变;冻存融化后细胞回收率80%～110%,细胞活率＞90%.在接受569例无血缘关系患者查询中,93%患者可查找到≥4个HLA-A,B和DRB1位点相合的脐带血.结论:可为临床造血干细胞移植提供合格的脐带血造血干细胞.     

自体外周血干细胞、脐血及rhG-CSF在肿瘤化疗致粒细胞缺乏中的应用

[目的]观察自体外周血干细胞、脐血和rhG-CSF在肿瘤化疗致粒细胞缺乏症患者中的作用.[方法]22例不同实体瘤患者因化疗致外周血中性粒细胞低于0.5×109/L时进行综合救治;45例实体瘤患者随机分为3组,采用自身对比的方法,观察预防性使用rhG-CSF、脐血和自体外周血干细胞输注后血象的变化.[结果]22例粒细胞缺乏症的患者化疗后白细胞总数及粒细胞绝对值降至最低值的时间为(12.24±2.08)天,其中,粒细胞绝对值低于0.1×109/L者5例,低于0.5×109/L者17例,经采用G-CSF、脐血及预防性使用抗生素后,没有1例发生感染;应用外周血干细胞输注,脐血输注和预防性使用rhG-CSF的三组患者,骨髓抑制的程度治疗周期小于对照周期,恢复至正常的时间也明显缩短.[结论]在粒细胞缺乏症的临床救治中,外周血干细胞输注、脐血输注及rhG-CSF都能加速骨髓造血功能恢复.     

体外扩增的脐血细胞移植BABL/c小鼠的实验研究

目的探讨体外扩增后脐血单个核细胞(CBMC)的应用价值。方法随机分组的BABL/c小鼠经亚致死量照射后,每组分别由尾静脉注入新鲜CBMC悬液、不同细胞因子组合(TPO+FL+IL-6、TPO+FL+IL-6+IL-3)扩增后的CBMC悬液、脐血全血和生理盐水。比较各组小鼠的存活率及造血恢复情况,并应用PCR和免疫组化方法观察小鼠体内人源细胞植入情况。结果扩增前后CBMC均可在BABL/c小鼠体内植入并重建造血功能,且存活率与植入率无显著性差异(P>0.05)。实验组造血恢复情况优于对照组。含IL-3的细胞因子组合对CBMC的扩增效果(8.96±0.52倍)优于不含IL-3者(6.28±0.16倍)(P<0.01)。结论体外扩增后CBMC数量显著增加,且保持了其重建造血功能及植入潜能,比新鲜的CBMC有更大的应用价值。