β3GalT7基因转染HL-60细胞及对其生物学行为的影响

目的:初步探讨人类β1,3半乳糖基转移酶7(β3GalT7)基因对HL60细胞的细胞周期、侵袭能力等方面的影响。方法:通过脂质体介导将本实验室构建好的β3GalT7真核正义表达载体pEGFP-C1-T7-Sense和反义表达载体pEGFP-C1-T7-AntiSense转染入HL60细胞;流式细胞仪分析各细胞株的细胞周期改变;Transwell侵袭实验检测β3GalT7对HL60细胞侵袭转移能力的影响。结果:随着β3GalT7表达的增高,G2 S期细胞增多,且细胞侵袭能力增强;而转染反义表达载体pEGFP-C1-T7-AntiSense的结果是相反的。结论:过度表达β3GalT7的HL-60细胞株体外增殖和侵袭能力增强。     

人类β1，3半乳糖基转移酶7对人4IgB7-H3的修饰作用初探

目的:探讨人4IgB7-H3基因转染人胃癌细胞株SGC7901后人类β1,3半乳糖基转移酶7(β1,3-galacto-syltransferase 7,β3GalT7)的表达变化,以期发现4IgB7-H3与β3GalT7的相互关系。方法:脂质体介导重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/4IgB7-H3转染SGC7901细胞,筛选获得稳定表达4IgB7-H3的亚克隆细胞株,通过RT-PCR和蛋白质印迹方法检测β3GalT7的表达。结果:成功获得稳定表达4IgB7-H3的亚克隆细胞株SGC7901/4IgB7-H3;β3GalT7随4IgB7-H3的表达上调而上调。结论:4IgB7-H3蛋白的修饰成熟可能需要β3GalT7的作用。     

人β4GalTⅡ基因在哺乳动物细胞株中的表达与定位

目的：运用基因克隆技术构建人源β1,4-半乳糖转移酶Ⅱ（β4GalTⅡ）真核表达质粒,并将其转染到 COS7细胞中,观察蛋白在细胞内的定位,同时转染到 HEK 293T 细胞中检测其表达。方法分别设计带 FLAG 标签和 GFP 标签的β4GalTⅡ基因的特异性引物,以含人β4GalTⅡ全长 cDNA序列为模板,定向构建到 pcDNA3．1（＋）及 pCDGFP 真核表达载体中,构建重组表达质粒。通过酶切和测序鉴定阳性重组质粒,利用 Lipofectamine 2000分别转染 COS7、HEK 293T细胞,免疫荧光显微镜观察重组蛋白在细胞内的定位,West-ern blot 法鉴定重组蛋白的表达。结果成功构建 pcD-NA3．1-β4GalTⅡ-FLAG 和 pCDGFP-β4GalTⅡ重组表达载体,定位实验表明：β4GalT Ⅱ-FLAG 和 GFP-β4GalT Ⅱ二者在COS7细胞中均主要定位在细胞核周围,并有明显的块状染色,胞核中未见明显分布;Western blot 法检测显示重组β4GalTⅡ蛋白在 HEK 293T 细胞中稳定表达。结论获得了人β4GalTⅡ的真核表达质粒,并能在 COS7和 HEK 293T 细胞中表达,为进一步研究β4GalTⅡ的功能及其与其他蛋白的相互作用奠定了一定基础。     

人类β3-糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在恶性血液系统肿瘤细胞中的表达差异及其原核表达和鉴定

目的研究一种新的人类β3-糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在恶性血液系统肿瘤细胞中mRNA水平的表达情况,并在原核体系中克隆和表达。方法运用半定量RT-PCR方法研究人β3GnT8/β3GalT7在13种恶性血液系统肿瘤细胞中的表达谱,以其中表达该基因最高的THP-1细胞的cDNA为模板,克隆目的基因,构建重组表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。经超声裂菌,尿素溶解包涵体,过Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化,透析复性浓缩后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot验证。结果 K562、U937、THP-1和NB4细胞株均较高效表达β3GnT8/β3GalT7,其中THP-1细胞株表达最高;并成功构建原核表达载体pQE30-β3GnT8/β3GalT7,表达出相应的重组蛋白。结论人β3GnT8/β3GalT7在13株细胞中表达有显著差异,并获得大量较纯的目的蛋白,其分子量与预测相符,为单克隆抗体制备及进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

硫代反义脱氧寡核苷酸对脑胶质瘤SWO-38细胞的作用

目的　研究α1,4半乳糖糖基转移酶 (α1,4GalT)基因硫代反义核酸对脑胶质瘤细胞系SWO -3 8细胞的增值与凋亡的影响及其与Bcl -2和Bax表达的关系。方法　采用脂质体介导的基因转染方法将人工合成α1,4GalT基因反义核酸转入SWO -3 8细胞中。应用RT -PCR检测对α1,4GalTmRNA表达的影响 ,应用克隆形成实验检测对细胞增殖的作用 ,应用流式细胞术 (FCM)和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的发生 ,应用FCM检测Bax和Bcl -2表达的变化。结果　反义核酸转染后 ,经RT -PCR检测证实α1,4GalTmRNA基因的表达下降 ;克隆形成试验显示细胞生长明显受到抑制 (P <0 .0 1) ;FCM检测表明 ,导入α1,4GalT基因反义核酸的SWO -3 8细胞的凋亡明显增加 (P <0 .0 1) ,Bcl -2蛋白表达显著下降 (P <0 .0 1) ,而Bax蛋白表达显著提高 (P <0 .0 1)。结论　α1,4GalT基因硫代反义核酸可诱导脑胶质瘤细胞系SWO -3 8细胞凋亡 ,其机制与Bcl-2和Bax基因调控有关     

糖基转移酶基因β3GalT7／GnT8和β3GnT2在白血病细胞株及人骨髓有核细胞中的表达

目的: 从mRNA水平观察不同白血病细胞和人骨髓标本中糖基转移酶β3GalT7/GnT8和β3GnT2的表达情况. 方法: 采用RT-PCR技术,在8种白血病细胞株及24例白血病患者骨髓有核细胞中检测β3GalT7/GnT8,β3GnT2 mRNA水平的表达,以10例正常成人骨髓有核细胞作相对正常对照.结果: β3GalT7/GnT8在SHI-1,THP-1,HL-60,K562,NB4,U937细胞和18例初诊白血病患者骨髓标本中有不同程度的表达,在KG1,Raji细胞和相对正常对照中没有表达;β3GnT2在SHI-1,THP-1,HL-60,K562,NB4,U937,Raji细胞,4例相对正常对照和16例初诊白血病患者骨髓标本中有不同程度的表达,在KG1细胞中和6例相对正常对照中没有表达. 结论: β3GalT7/GnT8和β3GnT2与白血病的发生发展存在一定的关系,其mRNA的表达水平可以作为白血病早期诊断的一个标志.     

β3GalT7基因的小干扰RNA筛选及其表达载体构建

目的: 以β3GalT7(人β1,3-半乳糖基转移酶7)基因为研究对象,运用RNA干扰技术平台,筛选出该基因的有效小干扰siRNA并构建该基因的RNA干扰表达载体,建立其下调表达模型.方法: 通过PCR方法筛选针对β3GalT7基因的有效小干扰siRNA,并合成带有荧光标记的RNA oligo进一步验证其有效性,进而构建该基因的RNA干扰表达载体建立其下调表达模型.结果: 成功筛选到β3GalT7基因的有效小干扰siRNA, 并进一步成功构建β3GalT7的RNA干扰真核表达载体.结论: 成功构建β3GalT7的真核干扰表达载体,继而可以获得β3GalT7表达受抑制的人胃癌细胞SGC7901克隆,为研究该基因在肿瘤发生发展中的作用提供实验模型.     

壳聚糖对肝癌和肺癌细胞株糖基化作用的影响

目的:观察中药壳聚糖对肝癌和肺癌细胞株糖基转移酶表达的影响,探讨中药多糖在肿瘤预防和治疗的应用。方法:以浓度为50,100和200 mg/L的壳聚糖分别作用于肝癌细胞株SMMC-7721和肺癌细胞株A549,采用RT-PCR方法检测多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAcT2)和β3GalT7的表达水平。结果:肝癌细胞株中pp-GalNAcT2和β3GalT7仅微弱表达,加药后作用不明显;肺癌细胞株中ppGalNAcT2和β3GalT7均有所表达,加入不同浓度的壳聚糖之后,ppGalNAcT2和β3GalT7的表达均受到抑制,且随着壳聚糖浓度的增加,抑制作用越明显。结论:肝癌细胞株SMMC-7721和肺癌细胞株A549 ppGalNAcT2和β3GalT7的表达不同,壳聚糖能够抑制肺癌细胞株A549中的糖基转移酶ppGalNAcT2和β3GalT7的表达,从而抑制了糖基化作用,对肺癌的预防和治疗具有一定的价值。     

β3GnT8/β3GalT7催化活性的研究

目的进一步验证β1,3半乳糖基转移酶（β3GalT7）的催化功能。方法将重组表达载体pGEX-6p-1-β3GnT8/GalT7转化BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,得到GST-β3GnT8/GalT7融合蛋白,分别进行β3GalT7和β3GnT8反应体系的酶促反应,利用高效液相色谱（HPLC）进行检测。结果HPLC检测结果表明,β3GalT7同时具有β3GalT7和β3GnT8的活性。结论β3GalT7具有双重酶活性,拟初步重命名为β3GnT8/β3GalT7。     

正、反义β-1,4-半乳糖基转移酶V表达质粒在星形胶质细胞瘤细胞中的转染与鉴定

目的：构建β-1，4-半乳糖基转移酶-V(β-1，4-GalTV)正、反义表达质粒，并将其转染到人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中，为探讨神经胶质瘤细胞表达β-1，4-GalTV的生物学意义提供研究基础。方法：构建β-1，4-GalTV表达质粒，并将其转染到人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中；用Western印迹和Northern印迹鉴定转染情况。结果：通过酶切鉴定和测序分析，实验成功构建β-1，4-GalTV表达质粒。将构建的表达质粒转染到胶质细胞瘤细胞SHG-44中，经鉴定表明，转染的正义表达质粒能增加胶质细胞瘤细胞SHG-44中的β-1，4-GalTV表达量，而转染反义质粒则能降低细胞中β-1，4-GalTV表达量。结论：正、反义β-1，4-GalTV表达质粒在人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中的稳定转染和表达，对分析胶质瘤细胞表达β-1，4-GalTV的意义如对肿瘤细胞的增殖、迁移和黏附等的影响提供了研究基础。     

单羧酸转运蛋白反义基因转染人肺腺癌细胞对其生物学特性的影响

目的　研究单羧酸转运蛋白基因第一亚型 (MCT1)反义表达载体转染肿瘤细胞对其细胞内pH(pHi)调节、乳酸转运及生长性质的影响。方法　通过电穿孔法将单羧酸转运蛋白MCT1基因反义表达重组子pLXSN MCT1转染于肺腺癌细胞系A5 49中 ,经G418筛选转染细胞阳性克隆。用PCR方法鉴定MCT1反义表达重组载体在基因组的转染整合 ;以分光光度法测定pHi及乳酸含量变化 ,并以细胞生长曲线研究细胞的生长情况。结果　与未转染的A5 49细胞比较 ,转染MCT1反义表达重组载体的细胞pHi降低、乳酸显著升高 (P <0 .0 0 1) ;且细胞的生长受到明显抑制。结论　单羧酸转运蛋白MCT1基因在肿瘤细胞pHi调节、乳酸转运及细胞的生长中起着重要的调节作用。     

p3GnT8/β3GalT7催化活性的研究

目的 进一步验证β1,3半乳糖基转移酶(β3GalT7)的催化功能.方法 将重组表达载体pGEX-6p-1-β3GnT8/GalT7转化BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,得到GST-β3GnT8/GalT7融合蛋白,分别进行β3GAIT7和β3GnT8反应体系的酶促反应,利用高效液相色谱(HPLC)进行检测.结果 HPLC检测结果表明,β3GalIT7同时具有β3GalT7和β3GnT8的活性.结论 β3GalT7具有双重酶活性,拟初步重命名为β3GnT8/β3GalT7.

Abstract：

Objective To determine the catalytic activity of the (31, 3-N-acetylglucosyltransferase β3GnT8)/β1, 3-galactosyltransferases (β3GalT7). Methods The recombinant plasmid was transformed into E. Coli BL21. Then a fusion protein was expressed after the induction by IPTG. After testified by Western blot, we purified the expression products by affinity chromatography. After renaturation, its enzyme activity was assayed by HPLC. Results It suggested that β3GalT7 own the catalytic activities of β3GalT7 and β3GnT8. Conclusion It has both activities of GalTs and GnTs, so we renamed it as β3GnT8/β3GalT7.     

TGFβ1反义RNA对腹膜间皮细胞分泌细胞外基质的影响

目的 :研究转化生长因子 β1(TGFβ1)反义RNA对体外培养的人腹膜间皮细胞 (HPMC)细胞外基质合成与分泌的影响。方法 :将反义TGFβ1基因真核表达载体转染HPMC ,用ELISA法检测转染细胞上清液中纤维连接蛋白 (FN)和Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂 (PAI 1)的蛋白质水平 ;用半定量逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)法检测转染细胞内FN ,PAI 1和胶原Ⅰ (ColⅠ )的mRNA表达 ,并与未转染HPMC对照组和转染空载体组比较其变化。结果 :TGFβ1反义RNA转染HPMC后 ,与对照组相比 ,转染 2 4h后 ,FN ,ColⅠ ,PAI 1mRNA分别下调 17% ,2 6 % ,9.6 % ;转染 4 8h后FN ,PAI 1蛋白含量亦明显下降 (P <0 .0 5 )。结论 :人反义TGFβ1基因真核表达载体可抑制HPMC合成细胞外基质 ,在腹膜纤维化的研究及防治中有潜在的应用价值     

β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8（β3GnT8/β3GalT7）与转录因子Ets-1相关性的探索性研究

目的初步探索β3GnT8的表达是否受到转录因子Ets-1的调控。方法通过反义核苷酸技术使Ets-1在7种不同细胞株内的表达沉默,分别用RT-PCR和Western bot检测转染Ets-1反义核苷酸前后β3GnT8在mRNA和蛋白水平的表达变化。结果转染Ets-1反义核苷酸后,发现Ets-1的mRNA表达明显受抑制,而β3-GnT8的表达也随之下降,结论初步认为β3GnT8的表达与转录因子Ets-1具有一定的相关性。     

β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8(β3GnT8/β3Ga1T7)与转录因子Ets-1相关性的探索性研究

目的 初步探索β3GnT8的表达是否受到转录因子Ets-1的调控.方法 通过反义核苷酸技术使Ets-1在7种不同细胞株内的表达沉默,分别用RT-PCR和Western bot检测转染Ets-1反义核苷酸前后β3GnT8在mRNA和蛋白水平的表达变化.结果 转染Ets-1反义核苷酸后,发现Ets-1的mRNA表达明显受抑制,而β3-GnT8的表达也随之下降,结论 初步认为β3GnT8的表达与转录因子Ets-1具有一定的相关性.     

反义转化生长因子β1基因对大鼠肾系膜细胞FN和PAI-1分泌的影响

目的通过对大鼠肾小球系膜细胞(MsC)转染反义转化生长因子β1基因(TGF-β1),观察该细胞纤维连接蛋白(FN)及1型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)表达的改变。方法构建反义TGF-β1基因真核表达载体,采用脂质体进行基因转染MsC,用ELISA法检测转染系膜细胞上清液中FN和PAI-1的蛋白质水平,并与无转染的MsC对照组和空载体组比较其表达的变化。结果构建了大鼠反义TGF-β1基因真核表达载体,并将其转染Msc,与对照组相比转染48小时后细胞分泌FN和PAI-1蛋白质水平明显下降(P<0.05)。结论反义TGF-β1基因真核表达载体可从分子水平阻断MsC的FN及PAI-1表达,在肾小球硬化及肾小球肾炎的研究治疗中有一定的应用价值。     

雪旺氏细胞表达β-1，4半乳糖基转移酶-Ⅰ对神经元轴突生长的影响

为了探讨周围神经雪旺氏细胞中不同β-1，4半乳糖基转移酶-I(β-1，4-galactosyltransferase 1，β-1，4-GalT-I)表达水平对神经元轴突生长的影响，本实验首先构建了正、反义β-1，4-GalT-I表达质粒；然后将构建的不同浓度的正、反义表达质粒超表达于分离、纯化的大鼠雪旺氏细胞；最后将转染的雪旺氏细胞与分离的大鼠背根神经节共培养，根据共培养神经元轴突延伸的数目和面积，分析雪旺氏细胞中不同β-1，4-GalT-I表达水平对神经元轴突生长的影响。结果发现：转染正义β-1，4-GalT-I的雪旺氏细胞能促进共培养神经节轴突的长出和延伸。在一定的转染浓度内，这种促神经生长作用随转染浓度增大而增强，而转染反义β-1，4-GatT-I却有相反的作用。提示周围神经雪旺氏细胞中表达β-1，4-GalT-I可能在维持正常神经的功能和促进损伤神经的修复发挥重要作用。     

人类β3GnT8/β3GalT7对人4IgB7-H3蛋白的翻译后糖基化修饰作用

目的探讨人类β1,3N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶8/β3半乳糖基转移酶7（β3GnT8/β3GalT7）与人4IgB7-H3蛋白的相互作用,以期阐明该糖基转移酶对人4IgB7-H3蛋白的翻译后糖基化修饰作用。方法在线预测软件预测人4IgB7-H3蛋白氨基酸序列上潜在的糖基转移酶作用位点;免疫共沉淀探讨β3GnT8/β3GalT7与人4IgB7-H3蛋白的相互结合作用;细胞免疫荧光化学技术研究两种蛋白质在细胞内的空间定位。结果人4IgB7-H3蛋白氨基酸序列上潜在的N-糖基化位点共有8个,O-β-GlcNAc的附着位置共有18个;β3GnT8/β3GalT7与人4IgB7-H3蛋白能相互结合而被共沉淀;两种蛋白质能在人肺癌A549细胞中共定位。结论人类β3GnT8/β3GalT7可能对人4IgB7-H3蛋白有糖基化修饰作用。     

整合素β3反义寡核苷酸抗小鼠妊娠的作用

目的探讨整合素β3反义寡核苷酸(ASODN)活体转染假孕小鼠子宫内膜抗早孕的可能性。方法将整合素β3反义寡核苷酸注入假孕1d小鼠子宫,同时同侧输卵管植入2细胞期受精卵10枚,小鼠正常饲养,5d天取小鼠子宫内膜进行Western Blotting检测整合素β3蛋白表达情况;19d进行小鼠子代出生率评估。结果Western blotting检测5d小鼠子宫内膜整合素β3蛋白强表达,10pmol整合素岛反义寡核苷酸转染假孕小鼠子宫内膜后5d小鼠子宫内膜整合素β3蛋白减弱表达,100pmol整合素β3反义寡核苷酸转染时弱表达,单纯脂质体轻度影响其表达;19d进行小鼠子代出生率评估,受孕鼠转染整合素β3反义寡核苷酸后子代小鼠出生抑制率为85％。结论整合素β3反义寡核苷酸可能整合到假孕小鼠子宫内膜抑制其蛋白表达,阻止胚胎着床。由于例数较少,其整合素β3反义寡核苷酸后抑制子代小鼠出生率需进一步研究。