Identification and expression of a novel human testis-specific gene by digital differential display

Background Evidence for the importance of genetic factors in male infertility is accumulating. This study was designed to identify a novel testis-specific gene related to spermatogenesis by a new strategy of digital differential display (DDD).Methods Based on the generation of expressed sequenced tags (ESTs), comparing the testis libraries with other tissue or cell line libraries by the DDD program, we identified a new contig of the ESTs which were derived from testis libraries and represented a novel gene. Multi-tissue RT-PCR was performed to analyse its tissue-specific expression. The full-length cDNA of the new gene was obtained using the BLAST program. Sequencing was performed and the result was analysed. Semiquantitative RT-PCR and Northern blot analyseis of mRNA from differential normal tissues were performed to clarify the expression pattern of the new gene. The sequence of the opening reading frame was integrated into the pQE-30 vector expressed in Escherichia coil strain M15(pREP4). With IPTG induction, the target protein was detected.Results A full-length cDNA sequence of the new gene named SPATA12 (GeneBank accession number AY221117) in human testis was identified. SPATA12 was 2430 bp in length, located in chromosome 3p21.1-3p21.2. The sequence of the opening reading frame was 676 - 1248 bp, as was confirmed by RT-PCR and sequencing. The cDNA encodes a novel protein of 190 amino acids with a theoretical molecular weight of 20417. 8 and isoelectric point of 5. 23. The sequence has no significant homology with any known protein in databases. Semi-quantitative RT-PCR and Northem-blot analyses of multiple tissues showed that SPATA12 was expressed significantly in normal human testis. The expression recombinant of SPATA12 was constructed and a high level of the histidine-tagged fusion protein was obtained.Conclusions DDD can be confirmed by SPATA12 as a novel computational biology-based approach for identification of the testis-specific expression genes. SPATA12 may function as a testicular germ cell associated gene that plays some roles in spermatogenesis. Moreover, a great amount of SPATA12 protein could be obtained by the gene recombination technique, thus providing a reliable foundation for investigating the biological function of this new protein.     

丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶SRPK2在小鼠睾丸组织中的表达及意义

【摘要】 目的 通过研究丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2（serine/arginine-rich protein specific kinase 2，SRPK2） 基因mRNA及其编码蛋白产物在小鼠睾丸组织中的表达特征，探讨该基因在精子发生过程中的作用及意义。 方法 分别采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹杂交（Western blotting）分析该基因mRNA及蛋白产物在小鼠多种组织中的表达；利用实时定量PCR（real-time quantitative PCR）分析SRPK2 mRNA在不同发育阶段小鼠睾丸组织中的差异表达；应用免疫组织化学染色和间接免疫荧光技术观察SRPK2蛋白在小鼠曲精小管中的细胞定位和生精细胞内的亚细胞定位。 结果 半定量RT-PCR和Western blotting分析显示SRPK2 mRNA和蛋白在小鼠睾丸组织中均大量表达；实时定量PCR分析发现SRPK2 mRNA在5周及8周龄雄性小鼠睾丸组织中显著表达，具有明显的阶段特异性表达特征。免疫组织化学染色结果表明SRPK2蛋白阳性着色主要位于曲精小管中的长形精子细胞核；间接免疫荧光分析显示SRPK2蛋白定位于长形精子细胞核表面。 结论 SRPK2基因在小鼠睾丸组织中大量表达，并且具有显著的阶段特异性表达特征和明确的细胞核定位，极有可能在小鼠精子发生的变态成形期参与mRNA前体分子的剪接过程，其作用机制值得进一步深入研究。     

人受精促进肽受体(TCPllc)基因的克隆、表达及选择性剪接

目的 分离、克隆人受精促进肽受体TCPll基因1个新的转录本TCPllc的全长cDNA,研究其表达的阶段性、组织特异性及TCPll基因3种转录本的剪接方式。方法 运用BLAST方法获得与TCPlla同源的ESTs,以逆转录的人睾丸cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR扩增片段克隆入pGEM-T easy载体并测序;采用BLAST、ClustalW及RT-PCR方法分析各转录本的基因组结构及剪接方式;RT-PCR方法分析其组织表达的特异性和阶段性。结果 获得1个新的全长cDNA,它编码440个氨基酸的蛋白质,与TCPlla、b相比,在基因组的5′-端存在复杂的外显子剪接现象。RT-PCR结果显示该转录本在正常睾丸中表达,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中未见该基因表达。结论 从人睾丸组织中分离到人受精促进肽受体TCPll基因1个新的转录本TCPllc, 结合mTcp-11的功能提示,TCPll基因a、b、c这3种转录本对精子发生和人受精过程可能起重要作用。     

Expression and Bioinformatics Analysis of SPACA4 in Human and Mice

Objective To analyze the expression of SPACA4 in human and mice. Methods Testes cRNA samples from Balb/c mice of different postnatal days were performed with mouse affymetrix chip to screen the expression of SPACA4 in mice. Sub-quantitative RT-PCR and bioinformatic tools were used here to describe the expression profile of SPACA4 in mice and human. Results The results of gene chip analysis indicated that the expression of mSPACA4 began after d 35 of postnatal testis in mice. Sub-quantitative RT-PCR assay showed that SPACA4 gene expressed exclusively in mouse and human testis, and mouse mSPACA4 gene expressed after d 35 of postnatal testis that was consistency with the results of gene chip analysis. By bioinformatics analysis, mSPACA4 is located in cell membrane （34.8%） or plasma membrane （34.8%）, the signal peptide cleavage site between position 19 and 20 amino acids, transmembrane region between 2-20 and 101-126 amino acids, respectively, on mSPACA4 protein. Conclusion mSPACA4 and hSPACA4 were testis-specific genes, and the expression of mSPACA4 begins after d 35 of postnatal testis in mice. SPACA4 is a candidate for targeting in a sperm-based contraceptive vaccine.     

Boule基因在小鼠精子发生过程中的动态表达

目的:研究雄性不育相关基因Boule在小鼠出生后首个精子发生波中的动态表达,探讨Boule在精子发生过程中的调控作用。方法:运用免疫印迹法分析BOULE蛋白在多组织中的表达情况。运用实时荧光定量、免疫组织化学和免疫荧光技术检测Boule m RNA和BOULE蛋白在雄性小鼠出生后首个精子发生波各个时间点中的表达。结果:1免疫印迹法显示BOULE蛋白在睾丸中特异性高表达,在出生后16 d睾丸可被检测到,并在随后的发育中睾丸和成年睾丸持续表达;2实时荧光定量方法证实Boule m RNA在雄鼠出生后14 d睾丸中可被检测到,20 d呈现表达高峰;3免疫组织化学显示在精母细胞及圆形精子细胞胞质中存在BOULE蛋白阳性信号。结论:Boule在精子发生过程中的表达是在发育水平精密调控的,在粗线期精母细胞和圆形精子细胞阶段的特异表达提示Boule可能在精母细胞进程和圆形精子细胞中发挥作用。     

人受精促进肽受体(TCP11c)基因的克隆、表达及选择性剪接

目的 分离、克隆人受精促进肽受体TCP11基因1个新的转录本TCP11c的全长cDNA,研究其表达的阶段性、组织特异性及TCP11c基因3种转录本的剪接方式。方法 运用BLAST方法获得与TCP11a同源的ESTs,以逆转录的人睾丸cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR扩增片段克隆入p哪M—TeMy载体并516序;采用BLAST、ClustalW及RT—PCR方法分析各转录本的基因组结构及剪接方式;RT—PCR方法分析其组织表达的特异性和阶段性。结果 获得1个新的全长cDNA,它编码440个氨基酸的蛋白质,与TCP11a、b相比,在基因组的5′—端存在复杂的外显子剪接现象。RT—PCR结果显示该转录本在正常睾丸中表达,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中未见该基因表达。结论 从人睾丸组织中分离到人受精促进肤受体TCP11基因1个新的转录本TCP1c,结合mTcp-11的功能提示,TCP11基因a、b、c这3种转录本对精于发生和人受精过程可能起重要作用。     

RSD-7的克隆及其在睾丸组织中的定位

目的 分离、克隆精子发生相关基因,深入了解精子发生的分子机制。方法 采用本组克隆的大鼠睾丸EST筛选cDNA文库、Northern blot、原核表达和纯化、抗体制备和免疫组化等技术。结果 (1)获得1个新的全长cDNA序列,命名为RSD-7。全长l238bp,编码232个氨基酸,GenBank接收号为AF315467。序列分析显示,RSD-7基因编码蛋白质含有1个Ubiquitin-like结构域。(2)Northern blot结果显示,在8种成鼠组织中,RSD-7基因仅在睾丸组织中有明显表达。不同发育天龄的大鼠睾丸组织Northern blot结果显示,出生后30d的大鼠RSD-7基因开始表达,一直到120d仍有表达。(3)RSD-7 cDNA在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了GST-RSD-7融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗RSD-7蛋白的多克隆抗体。(4)通过免疫组织化学方法,RSD-7蛋白定位于Sertoli细胞胞浆和质膜上。结论 初步分析了RSD-7基因的表达特征并制备了抗RSD-7多克隆抗体,为进一步研究RSD-7蛋白在精子发生过程中的功能提供了条件。     

小鼠睾丸组织特异表达基因Rnf148的鉴定及其编码E3泛素连接酶的功能分析

目的 研究小鼠Rnf148基因表达的时空特异性及其环指结构域的E3泛素连接酶功能。 方法 提取不同成年小鼠组织、不同胚胎期组织和出生后小鼠睾丸组织的总RNA,通过实时荧光RT-PCR和Northern杂交分析小鼠Rnf148基因的表达谱。构建包含整个Rnf148蛋白的环指结构域与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的融合蛋白原核表达载体,在BL21细菌中诱导表达后,经GST琼脂糖凝胶纯化GST-Rnf148重组蛋白。体外泛素化反应试验检测GST-Rnf148重组蛋白的E3泛素连接酶功能。 结果 在小鼠13种不同器官组织中,Rnf148 mRNA仅存在于睾丸组织中。进一步Northern杂交验证了只在小鼠睾丸组织表达一个1.2 kb左右的Rnf148基因mRNA片段。小鼠Rnf148基因在胚胎期及出生后3周内不表达,出生后21 d开始表达,25 d后达到表达高峰并一直持续表达。实验成功诱导表达并纯化了GST-Rnf148重组蛋白,体外蛋白泛素化反应显示该重组蛋白具有E3泛素连接酶的功能。 结论 小鼠Rnf148基因特异地表达在出生3周后的睾丸组织中,Rnf148蛋白的环指结构域具有泛素连接酶活性。     

染料木黄酮对体外培养乳鼠睾丸组织全基因表达谱的影响

目的 利用基因芯片技术研究染料木黄酮（Genistein, Gen）对体外培养的小鼠睾丸组织全基因表达谱的影响,从基因水平分析Gen影响睾丸细胞增殖凋亡的作用机制。方法 利用旋转通气法体外培养乳鼠睾丸组织,给予5 μmol/L Gen干预,同时设立DMSO溶剂对照组。培养72 h后提取组织总RNA,用单标Agilent小鼠全基因芯片检测两组睾丸组织基因表达,筛选差异基因,进行基因功能分类。结果 与对照组比较,Gen组筛选出84个表达差异有统计学意义的基因（ P<0.05）,其中47个基因表达上调,37个基因表达下调。按差异基因功能富集分析（GO）分类标准进行分类,筛选出有统计学意义的GO分类14个（ P<0.05）,主要涉及生殖发育、细胞增殖、细胞周期等功能。结论 通过全基因芯片检测发现,Gen主要影响睾丸组织生殖发育、细胞增殖和细胞周期等功能相关基因表达,从而影响精子发生和睾丸细胞的增殖和凋亡,影响睾丸的功能。     

His标记小鼠SRG-S基因的克隆和表达纯化

目的构建His标记的小鼠精子发生相关基因SRG-S的原核表达载体并实现其表达及纯化。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆入pGEM-T-easy载体,经测序正确后,定向亚克隆入pET-30a( )表达载体,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,并利用抗His单克隆抗体进行Western blot检测。结果RT-PCR扩增得到大小约591 bp的目的基因片段,DNA序列分析结果与GenBank公布的序列一致,SDS-PAGE电泳显示经IPTG诱导有约32 kD的重组蛋白表达,纯化后的蛋白纯度达90%以上,且Western blot印迹表明该融合蛋白具有特异的抗His抗体特性。结论采用基因克隆技术成功构建了带His标签的小鼠SRG-S原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,有利于后期抗体的制备,为进一步从蛋白质水平研究该基因的功能奠定了基础。     

利用电子差异展示方法克隆人类睾丸特异性新基因

目的 克隆一个新的人睾丸特异性基因.方法 运用电子差异展示方法筛选人类睾丸特异表达新基因,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重叠群Hs.180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达.然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发,采用生物信息学方法克隆一个人类新基因的全长eDNA序列.结果 新基因全长1197 bp,开放阅读框为504～806 bp,定位于6p21.1-p21.2.编码由100个氨基酸组成,相对分子质量为10 000,等电点为6.81的一个蛋白,该蛋白与已知蛋白无同源性.克隆实验验证该基因阅读框完全正确,推测其可能与精子生成相关,暂命名为TDRGI(restis development related gene 1),GenBank登录号为DQ168992.结论 电子差异展示方法与实验验证相结合用于发现人类功能新基因足行之有效的.     

人睾丸组织特异表达新基因HSD-9的克隆及其编码蛋白质功能

目的 利用本室建立的人睾丸组织中不同细胞特异表达的ESTs文库克隆新基因HSD-9,初步研究HSD-9蛋白的特性及功能。方法 采用电子克隆手段获得新基因HSD-9,生物信息学手段分析基因及编码蛋白质的特点。Northernblot研究HSD-9基因的表达谱,原核表达方法得到HSD-9蛋白并制备特异性多克隆抗体,免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术研究HSD-9蛋自在生精细胞中的定位及在哺乳动物细胞中的表达特点。结果HSD-9基因在人睾丸组织特异表达,其大鼠同源物可在大鼠各级生精细胞中表达;HSD-9．EGFP在CHO细胞和s4细胞中表达呈现沿细胞膜分布的小颗粒和偏心分布于胞内一侧的粗大颗粒;HSD-9-EGFP和网格蛋白clathrin可以部分共定位。结论 HSD-9是人睾丸组织特异表达新基因,其编码蛋白质在CHO细胞和S4细胞中表达特点非常类似于内吞小体蛋白的表达特点,推测其可能参与了细胞中内吞过程的调节。     

小鼠腹腔手术睾丸注射抑制模型的建立

摘要： 目的 建立小鼠睾丸注射模型,获得一种蛋白抑制的简便易行、高效且存活率高的方法,为小鼠精子发生的相关实验研究提供借鉴。 方法 通过腹腔手术暴露小鼠睾丸,睾丸内进针注射蛋白抑制剂,间断缝合法缝合切口。 结果 组织学结果观察发现,实验抑制组小鼠睾丸生精小管内精母细胞染色体排列紊乱,存在中期阻滞现象,无法正常分裂。此模型实现了小鼠睾丸内蛋白的功能抑制,且小鼠存活率高。 结论 小鼠睾丸抑制方法常用阴囊注射法,手术时间局限性大。小鼠腹腔手术睾丸注射法可实现3周龄小鼠睾丸内蛋白抑制,实验成功率高,抑制效果好,有利于精母细胞减数分裂相关研究。     

钙网蛋白calreticulin在小鼠睾丸中的表达及意义

目的:研究钙网蛋白(calreticulin,CRT)在成年小鼠睾丸组织中的表达及分布,探讨CRT在小鼠睾丸发育及其精子发生过程的功能?方法:运用免疫印迹法和免疫组织化学术,检测CRT在小鼠睾丸组织中的表达和分布?结果:免疫印记法证实CRT在成年小鼠睾丸高表达,同时免疫组织化学显示阳性信号主要集中在小鼠睾丸精原细胞和间质细胞?结论:CRT在小鼠睾丸中的定位提示其可能与精原细胞更新和分化以及雄激素分泌密切相关?     

无标记定量方法在小鼠精子发生相关蛋白质组学研究中的应用

目的: 利用无标记定量蛋白质组学技术筛选在3周龄及成年小鼠睾丸中差异表达的蛋白质?方法:分别抽提3周龄及成年小鼠睾丸蛋白,酶解后所得肽段经纳升液相色谱分离,并经LTQ Obitrap质谱鉴定,在获得蛋白鉴定信息的同时根据相应肽段离子质谱峰强度对蛋白进行相对定量?结果:在3周龄及成年小鼠睾丸中共鉴定到非冗余蛋白319种,其中30种蛋白在两者之间存在显著的表达差异,这些蛋白主要参与形态发生?收缩?胞吞?受精等细胞事件,与精子变形过程及精子功能相关?结论:无标记定量蛋白质组学技术,具有方法简便?通量大?成本低廉等优点,利用其寻找睾丸发育,精子发生/功能相关蛋白具有广阔的前景?