PGC-1α对人血管内皮细胞VEGF表达及管腔形成的调控

目的探讨过氧化物酶增殖激活受体-γ共激活子-1α（PGC-1α）对人血管内皮细胞（HUVEC）血管内皮生长因子（VEGF）表达及管腔形成的影响。方法实验研究。HUVEC加入重组PGC-1α蛋白作为重组组,未加入重组蛋白的细胞作为对照组。加入重组蛋白24 h后,将2组细胞分别置于常氧（20% O2）和低氧（1% O2）环境下继续培养16 h,采用real-time PCR和ELISA分别检测VEGF mRNA和蛋白的表达变化。加入重组蛋白48 h后,将2组细胞转移至Matrigel基底膜包被的培养板,并分别置于常氧和低氧环境下继续培养48 h,采用光学显微镜观察细胞在体外管腔形成的情况。应用单因素方差分析对实验数据进行处理。结果real-time PCR和ELISA检测发现常氧和低氧环境下细胞加入重组PGC-1α蛋白后VEGF mRNA和蛋白的表达均较对照组上调,差异有统计学意义（F=131.67、65.96,P<0.01）。2种环境下,加入重组PGC-1α蛋白后细胞管腔形成能力均较对照组增强。结论PGC-1α能上调HUVEC VEGF的表达,并促进细胞管腔的形成。     

microRNA-132在人脐静脉内皮细胞中调控作用的研究

目的：探讨 miR-132在人脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelia cells,HUVEC)中的调控作用。
　　方法：体外低氧培养人脐静脉内皮细胞6h后继续常氧培养3、6、12、24h,利用Real-time PCR检测miR-132和PGC-1α mRNA表达变化,Western-blot检测PGC-1α蛋白表达变化,及观察各组与正常培养的细胞之间的表达差异。通过对人脐静脉内皮细胞转染 miR-132模拟物与拮抗剂后,再分别置于常氧和低氧环境中培养,利用 Real-time PCR检测不同氧条件下miR-132和PGC-1α mRNA的表达变化,Western-blot检测PGC-1α蛋白表达变化。
　　结果：miR-132和PGC-1α在细胞低氧培养后继续常氧培养3 h时蛋白与mRNA表达量最高,与正常培养的细胞表达差异最为明显( P<0.01)。细胞转染后可观察到miR-132和PGC-1α在低氧组表达量要高于常氧组,而两组中转染miR-132模拟物后的表达量要高于转染拮抗剂组( P<0.01)。
　　结论：miR-132在低氧时的人脐静脉内皮细胞中表达明显上调,对PGC-1α存在调控作用。     

Small interfering RNA targeting PGC-1α inhibits VEGF expression and tube formation in human retinal vascular endothelial cells

AIM:To determine whether small interfering RNA (siRNA) of PGC-1α could inhibit vascular endothelial growth factor (VEGF) expression and tube formation in human retinal vascular endothelial cells (hRVECs).METHODS:hRVECs transfected with peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) siRNA were incubated for 24h and then placed into a normoxic (20%, O2) or hypoxic (1%, O2) environment for another 16h. PGC-1α mRNA and protein levels were detected by real-time PCR and Western blot. VEGF mRNA and protein levels were detected by real-time PCR and ELISA. Cell proliferation was evaluated by BrdU incorporation assay. Forty-eight hours after siRNA transfection, hRVECs were planted into Matrigel-coated plates and cultured under normoxic (20%, O2) or hypoxic (1%, O2) conditions for another 48h. The tube formation of hRVECs was observed under an optical microscope and quantified by counting the number of branch points and calculating the total tube length.RESULTS: PGC-1α mRNA and protein levels were significantly reduced by PGC-1α siRNA, and VEGF mRNA and protein levels also decreased significantly. The percentage of BrdU-labeled cells in siPGC-1α groups were significantly decreased compared with control siRNA groups under normoxia and hypoxia in cell proliferation assay. In the tube formation assay, PGC-1α siRNA treated cells formed significantly fewer tubes.CONCLUSION: Blocking PGC-1α expression can inhibit VEGF expression in hRVECs and inhibit their ability to form tubes under both normoxic and hypoxic conditions.     

低氧诱导因子-1α干扰RNA对血管内皮生长因子mRNA表达的抑制作用

目的 探讨低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α．HIF-1α）特异性小片段干扰RNA表达载体pSUPER^H1-SiHIF1α对低氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor．VEGF）mRNA表达的抑制作用。方法 构建HIF-1α特异性小片段干扰RNA表达载体pSUPER^H1-SiHIF1α通过脂质体Lipofectamine2000分别介导pSUPER^H1-SiHIF1α转染低氧状态下培养的人低分化鼻咽鳞癌细胞（nasopharyngeal carcinoma cell line，CNE2），对照组转染pSUPER空载体．采用半定量RT—PCR方法检测HIF-1αmRNA和VEGF mRNA的表达。结果 转染DSUPER^H1-SiHIF1α的CNE2细胞中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达较对照组分别降低79．4％和65．7％。结论 HIF-1α特异性小片段干扰RNA表达载体pSUPER^H1-SiHIF1α能明显抑制HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达。     

RNA干扰技术体外抑制低氧诱导因子-1α及血管内皮细胞生长因子表达的研究

目的研究正常氧及低氧环境下,pSUPER^h1-siHIF-1α。真核表达载体对低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达的抑制效果及由此引起的血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达的差异。方法构建pSUPER^h1-siHIF-1α真核表达载体,并建立pSUPER^h1-siHIF-1α稳定转染细胞系。采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法,筛选HIF-1α mRNA抑制效率最高的细胞系。然后将其与对照细胞在正常氧（20％O2）及低氧环境（1％O2）下培养,采用半定量RT-PCR、免疫印迹法及ELISA技术检测正常氧及低氧环境下pSUPER^h1-siHIF-1α对HIF-1α及VEGF表达的抑制效果。结果低氧环境下,pSUPER^h1-siHIF-1α可明显抑制HIF-1α和VEGFmRNA及蛋白质的表达。而正常氧环境下,pSUPER^h1-siHIF-1α虽可明显下调HIF-1αmRNA表达水平,但对VEGF mRNA和分泌型蛋白表达水平无明显抑制效果。结论低氧环境下,pSUPER^h1-siHIF-1α能显著抑制HIF-1α的表达,且下调其下游基因VEGF的表达。因此,pSUPER^h1-siHIF-1α可能为视网膜新生血管的基因治疗提供新的途径。（中华眼科杂志,2007,43：1028-1035）     

CCR7和VEGF在缺氧时视网膜血管内皮细胞中的表达及意义

目的：探讨CC族趋化因子受体7（ CC chemokine receptor7, CCR7）和血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor,VEGF）在缺氧状态下视网膜血管内皮细胞（ retinal endothelial cell,REC）中的表达及意义。
　　方法：恒河猴脉络膜－视网膜内皮细胞（ RF／6A）分别在常氧和低氧环境中培养,分为正常对照组、低氧对照组和治疗组。低氧对照组和治疗组分别采用脂质体LipofectamineTM 2000（ LF2000）介导转染空载体质粒和CCR7siRNA表达质粒。 CCK8法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot和RT－PCR法检测三组RF／6A内CCR7、VEGF蛋白及mRNA的表达情况。结果：低氧对照组较正常对照组比较及治疗组较正常对照组和低氧对照组比较细胞生长速度明显减慢,增殖能力减弱,细胞凋亡率显著增加（均为P＜0．05）;低氧对照组与正常对照组比较, RF／6 A内CCR7、VEGF蛋白及mRNA表达显著增高,均有统计学意义（ tCCR7蛋白＝3．38,tVEGF蛋白＝4．75,tCCR7mRNA＝4．27,tVEGFmRNA＝5．34,均为P＜0．05）,且二者表达呈正相关（ r蛋白＝0．71, rmRNA ＝0．83,均为 P＜0．05）。治疗组CCR7和VEGF的蛋白及mRNA表达较正常对照组和低氧对照组明显下降（均为P＜0．05）。
　　结论：缺氧时REC中CCR7可上调VEGF的表达,CCR7－VEGF信号途径在视网膜新生血管（ retinal neovascularization, RNV）形成的过程中可能具有潜在功能,CCR7siRNA有望成为防治RNV的一种有效方法。     

p42/p44MAPK通路在高糖诱导的hRPE细胞VEGF表达中的作用

目的：探讨p42/p44丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号转导通路在高糖诱导的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达中的作用。

方法：采用hRPE细胞株,将细胞分为正常对照组(5.6mmol/L葡萄糖)、高糖对照组(15,20,30mmol/L葡萄糖)、PD98059处理组(20μmol/L p42/p44MAPK高效选择性抑制剂PD98059处理hRPE细胞)和溶剂二甲基亚砜对照组(dimethyl sulfoxide,DMSO组)。应用逆转录PCR(RT-PCR)技术检测VEGF及色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF)mRNA的表达。应用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技术检测细胞上清液中VEGF蛋白的表达

结果：高糖作用下VEGF mRNA和蛋白表达显著增高,PD98059处理组VEGF mRNA和蛋白表达受到抑制,且VEGF mRNA/PEDF mRNA比值较高糖组显著降低。

结论：p42/p44MAPK信号转导通路可能参与了高糖引起的hRPE细胞VEGF的表达。     

缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子干扰性RNA对人血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的抑制

目的 探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）小片段干扰性RNA（siRNA）对人血管内皮细胞VEGF表达的影响。 方法 构建HIF-1α siRNA重组质粒。将体外培养的人血管内皮细胞（HUVEC-12）分成常氧（20%）组和低氧（1%）组。低氧组中，采用脂质体Lipofectamine ^TM 2000（LF2000）分别转染空载体质粒（空载体组）、HIF-1α siRNA（HIF-1α组）、VEGF-₁₆₅ siRNA（VEGF组）和HIF-1α siRNA+VEGF₁₆₅ siRNA（共转染组）。低氧组中未转染的细胞为对照组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）鉴定基因转染效率；RT-PCR和免疫细胞化学法检测各组细胞中VEGF基因和蛋白表达的变化。 结果 成功构建HIF-1α siRNA重组质粒。人血管内皮细胞转染24 h后，HIF-1α siRNA和VEGF-₁₆₅ siRNA重组质粒有表达。常氧组细胞中仅见微弱的VEGF mRNA和蛋白表达，而低氧组表达明显上调；HIF-1α组、VEGF组和共转染组表达较对照组减弱，其中共转染组抑制效果最明显。 结论 HIF-1α和VEGF₁₆₅ siRNA能有效抑制人血管内皮细胞VEGF的表达。     

血管内皮生长因子干扰RNA对鼠视网膜中血管内皮生长因子mRNA表达的抑制作用

目的 研究血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factor,VEGF）小片段干扰RNA（small interference RNA,siRNA）对鼠视网膜VEGF mRNA的抑制作用,探讨其对视网膜新生血管治疗的可行性.方法 体外培养人鼻咽癌细胞（CNE-2Z）,分成正常氧培养组（20% O2）和低氧培养组（1% O2）.采用脂质体（LF 2000）将VEGF siRNA转染两组细胞,RT-PCR检测VEGF mRNA的表达,确立VEGF siRNA对VEGFmRNA的抑制效率.然后,建立高浓度氧（75%）诱导的C57BL./6J小鼠视网膜新生血管动物模型,以脂质体为载体,将VEGF siRNA重组质粒注射到鼠玻璃体腔内,RT-PCR检测视网膜组织中VEGF mRNA的表达水平.结果 正常氧培养的CNE-2Z细胞有VEGF mRNA表达,低氧状态下VEGFmRNA表达增多,两者之间差异有显著性（P＜0.01）;与未转染组和转染空载体组相比,在正常氧和低氧状态下,VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达（P＜0.01）;正常氧状态下VEGF siRNA的抑制效率比低氧状态高.高浓度氧诱导的C57BL/6J小鼠视网膜新生血管动物模型中,玻璃体腔注射VEGF siRNA组视网膜组织中VEGF mRNA表达明显下降（P＜0.01）.结论 VEGF特异的siRNA能有效地抑制人鼻咽癌细胞CNE-2Z和C57BL/6J 小鼠视网膜新生血管动物模型视网膜中VEGF mRNA的表达.     

缺氧诱导因子-1α小片段干扰性RNA对人血管内皮细胞缺氧诱导因子-1α表达的调控

目的探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)小片段干扰性RNA(siRNA)对人血管内皮细胞HIF-1α表达的影响。方法构建HIF-1αsiRNA重组质粒。将体外培养的人血管内皮细胞(HUVEC-12)分成常氧(20%)组和低氧(1%)组。低氧组又分为对照组、空载体组和HIF-1α组。采用脂质体LipofectamineTM 2000分别转染空载体质粒(空载体组)、HIF-1αsiRNA(HIF-1α组),对照组不作转染。采用SP免疫细胞化学法检测各组细胞中HIF-1α蛋白表达的变化,并进行计算机图像分析。结果对照组和空载体组细胞HIF-1α蛋白表达较常氧组增强,而HIF-1α组较对照组明显减弱。结论HIF-1αsiRNA能显著抑制HIF-1α的表达,为视网膜新生血管的基因治疗提供了新方法。     

高浓度胰岛素对视网膜Müller细胞VEGF表达的影响

目的探讨在高浓度胰岛素条件下,体外培养的兔视网膜Muller细胞的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)的变化.方法在不同浓度胰岛素条件下(4,8,12kU/L),体外培养兔视网膜Muiler细胞,采用免疫细胞化学法、原位杂交法,定性测定Muller细胞分泌VEGF的变化,采用ELISA方法,定量测定Muiler细胞分泌VEGF的变化.结果高浓度胰岛素能明显增强VEGF的表达(P<0.05).结论高浓度胰岛素可能通过刺激Miiller细胞编码VEGF基因的转录,进而增强VEGF蛋白的表达,而在糖尿病视网膜病变的新生血管生成中发挥重要作用.     

高浓度胰岛素对视网膜M(u)ller细胞VEGF表达的影响

目的:探讨在高浓度胰岛素条件下,体外培养的兔视网膜Muller细胞的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)的变化.方法:在不同浓度胰岛素条件下(4,8,12kU/L),体外培养兔视网膜Muiler细胞,采用免疫细胞化学法、原位杂交法,定性测定Muller细胞分泌VEGF的变化,采用ELISA方法,定量测定Muiler细胞分泌VEGF的变化.结果:高浓度胰岛素能明显增强VEGF的表达(P<0.05).结论:高浓度胰岛素可能通过刺激Miiller细胞编码VEGF基因的转录,进而增强VEGF蛋白的表达,而在糖尿病视网膜病变的新生血管生成中发挥重要作用.     

抑制性PAS蛋白抑制血管内皮生长因子的表达

目的:探讨抑制性PAS蛋白质(inhibitory PAS do-main protein, IPAS)对缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的活性和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的抑制作用。方法:在缺氧条件和正常氧条件,采用脂质体转染法,将pcDNA3-HIF-1α质粒、含促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)增强子的荧虫素酶(lu-ciferase)报告基因和不同量的pcDNA3-IPAS质粒共转染NIH 3T3细胞,通过检测荧虫素酶的活性以反映HIF-1α的活性;以转染pcDNA3-IPAS为IPAS组,转染pcDNA3为对照组,采用半定量RT-PCR法,检测转染两组NIH-3T3细胞中VEGF mRNA的表达。结果:转染pcDNA3-IPAS的NIH 3T3细胞的荧虫素酶活性较对照组明显降低,且随转染量的增加荧虫素酶的活性降低越明显;转染pcDNA3-IPAS的NIH 3T3细胞的VEGF mRNA表达较对照组明显降低。结论:IPAS通过降低HIF-1α的活性抑制了VEGF mRNA的表达。     

IGF-1对人RPE细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelial,RPE)细胞缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法 取体外培养的第3-5代人RPE细胞,经不含IGF-1、含10.00μg.L-1、50.00μg.L-1、100.00μg.L-1IGF-1的无血清培养液处理24h后,通过RT-PCR分别检测HIF-1αmRNA和VEGF mRNA的相对表达量,用Western-blotting分别检测HIF-1α蛋白和VEGF蛋白的相对表达量。结果 对照组、10.00μg.L-1、50.00μg.L-1及100.00μg.L-1IGF-1组人RPE细胞中HIF-1αmRNA相对表达量分别为:1.44±0.18、1.48±0.17、1.51±0.18、1.53±0.21,4组比较差异无统计学意义(F=0.320,P=0.811);而4组HIF-1α蛋白的相对表达量分别为0、678.17±101.49、1175.35±149.71、1467.77±262.76,4组比较差异有显著统计学意义(F=113.550,P=0.000),并随IGF-1浓度的增加,相对表达量增高,各组间比较差异均有统计学意义(均为P<0.05);4组VEGF165mRNA及VEGF165蛋白的表达量比较,差异均有显著统计学意义(F=55.096,P=0.000;F=30.269,P=0.000),各组VEGF165mRNA及蛋白水平随IGF-1浓度的增加而增高,各组间比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 IGF-1能促进人RPE细胞HIF-1α蛋白的累积,诱导VEGF165mRNA及蛋白的表达,是导致增生性糖尿病性视网膜病变重要的细胞因子之一。抑制IGF-1表达可能是防治该病的有效靶点。     

shRNA抑制缺氧条件下人视网膜色素上皮细胞低氧诱导因子-1α基因对血管内皮生长因子表达的影响

目的探讨缺氧条件下人视网膜色素上皮（hRPE）细胞低氧诱导因子-1α（HIF-1α）对血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法利用体外转录法合成针对HIF—1α mRNA序列的靶点之一的小发卡环RNA（shRNA）,以化学低氧诱导剂CoCl2模拟RPE细胞缺氧环境,对缺氧培养条件下hRPE细胞的HIF-1α进行RNA干扰,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIF-1α和VEGF mRNA的表达,免疫印迹法检测HIF—1α和VEGF蛋白水平,以正常组、缺氧组及阴性转染组作为对照,观察其对HIF-1α基因的沉默效果及对VEGF表达的抑制作用。结果转染HIF-1α mRNA的特异性shRNA后,RT-PCR检测结果显示缺氧条件下hRPE细胞HIF-1α基因沉默效果为77．1％,VEGF mRNA的表达水平下降了27．8％;免疫印迹法检测结果显示HIF—1α和VEGF蛋白水平显著降低。结论针对HIF-1α mRNA的shRNA能有效地使HIF-1α基因沉默,进而抑制缺氧对VEGF的上调作用。（中华眼科杂志．2007。43：1022—1027）     

基质细胞衍生因子-1α对牛视网膜血管内皮细胞CXCR-4和VEGF表达的影响

目的 观察基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)对体外培养的牛视网膜血管内皮细胞(bo-vine retinal vascular endothelial cells,BRVEC)表达趋化性细胞因子受体-4(chemotaxis cytokine receptor-4,CXCR-4)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响,探讨SDF-1α对BRVEC作用的机制.方法 取第3-7代选择性培养的BRVEC悬液接种于12孔培养板,常规培养条件下分别用不同浓度的糖和不同浓度的SDF-1α及糖+SDF-1α干预,收集上清液ELISA检测VEGF的表达,收集细胞Western blotting检测CXCR-4的表达.结果 正常浓度葡萄糖(5.6 mmol·L-1)对BRVEC表达VEGF和CXCR-4均无影响,高糖(25.0 mmol·L-1)增强BRVEC表达CXCR-4和VEGF,并呈时间依赖性.SDF-1α促进BRVEC表达VEGF和CXCR-4,并呈剂量和时间依赖性,SDF-1α的作用在100 μg·L-1达高峰,CXCR-4表达增加水平较VEGF明显.高糖联合SDF-1α培养时VEGF和CXCR-4的表达在48 h达高峰,分别为(230.17±19.74)ng·L-1、(0.96±0.12)ng·L-1,均显著高于SDF-1α单独培养时,差异均有统计学意义(P均<0.05),高糖+SDF-1α干预时,二者协同促进BRVEC表达VEGF和CXCR-4,且CXCR-4表达增加水平较VEGF明显.结论 高糖和SDF-1α均能刺激BRVEC表达CXCR-4和VEGF,并且具有协同作用.     

蛋白激酶C在缺氧人RPE细胞表达血管内皮生长因子中的作用

目的探讨蛋白激酶C(PKC)信号转导通路在缺氧诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达中的作用。方法在细胞培养液内加入CoCl2溶液以模拟缺氧环境,培养RPE细胞0·5、48h后,用免疫荧光法检测人RPE细胞内PKC的表达。将PKC激动剂佛波醇-12-豆蔻酰-13乙酸(PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液,在缺氧状态下分别培养6、12、24h后,用ELISA检测各组RPE细胞中VEGF的表达。对照组为常氧状态下培养的RPE细胞。结果免疫荧光染色显示缺氧及常氧状态下,RPE细胞浆及胞核内均有PKC的表达。PKC激动剂PMA可增强缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达,而PKC抑制剂Chelerythrine可减弱缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达。结论缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的。     

抗血管生成作用的VEGFxxxb在缺氧视网膜色素上皮细胞中的表达

背景 缺氧可诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌血管内皮生长因子A（VEGF-A）,从而促进脉络膜新生血管（CNV）形成.VEGF-A依选择性剪接方式的不同,可形成具有促血管生成作用的VEGFxxx和具有抗血管生成作用的VEGFxxxb,但后者在常氧和缺氧状态下在人RPE细胞中的表达变化及其作用尚不清楚.目的 从mRNA水平和蛋白水平检测模拟缺氧状态培养的RPE细胞中VEGFmb的表达,研究VEGFxxxb在常氧和缺氧培养的RPE细胞中的表达变化.方法 以人RPE细胞系ARPE-19为研究对象,将150 μmol/L化学诱导剂CoC12加入细胞培养液制备缺氧细胞模型,分别于0h（常氧培养）及缺氧培养3、6、12和24 h收获细胞或细胞上清液,采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测细胞内VEGFxxxmRNA和VEGFxxxb mRNA的表达;采用Western blot法检测细胞内总VEGF-A蛋白和VEGFxxxb蛋白的表达;采用ELISA法检测细胞上清中总VEGF-A蛋白和VEGFxxxb蛋白的含量.结果 在常氧及诱导缺氧后,ARPE-19细胞中均可检测到VEGFxxxmRNA和VEGFxxxb mRNA的表达,检测出的VEGFxxxmRNA中同时出现VEGF121、VEGF165和极微弱的VEGF189条带;检出的VEGFxxxb mRNA中可见VEGF165b条带.缺氧培养的细胞中随着缺氧时间的延长,VEGFxxxmRNA显示出表达逐渐增加的趋势,而VEGFxxxb mRNA则显示出表达逐渐减少的趋势.Western blot法可检测到细胞中VEGFxxxb蛋白的表达,尤以VEGF165b表达最强,随缺氧培养时间的延长,VEGF165b蛋白表达逐渐减少.培养的细胞上清中VEGFxxxb蛋白质量浓度由常氧培养时的（166.82±2.55） pg/ml下降至缺氧培养24 h的（125.35±2.10）pg/ml,而总VEGF-A蛋白则由（294.27±11.97） pg/ml上升至（582.26±12.98） pg/ml.细胞中VEGFxxxbb蛋白占总VEGF-A蛋白的比例随缺氧培养时间的延长,由常氧培养条件下的（56.71±1.02）％逐渐下降至缺氧培养24 h的（21.53±0.08）％.结论 ARPE-19细胞在常氧和缺氧培养条件下均可检测到VEGFxxxbb mRNA和蛋白的?     

Müller细胞内色素上皮衍生因子与血管内皮生长因子的相互作用

目的 研究Müller细胞内色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的相互作用,为临床上治疗新生血管提供新的思路.方法 大鼠Müller细胞原代培养,取第3代细胞用于实验.实验按以下操作进行:(1)观察VEGF对PEDF的作用:VEGF处理组细胞培养液中加入不同浓度VEGF(100nmol·L-1、500 nmol·L-1、1 000 nmol·L-1、5 000 nmol·L-1),24 h后收集细胞分别用RT-PCR和Western-blot法分析Müller细胞内PEDF mRNA和蛋白的表达.(2)观察PEDF对VEGF的作用:PEDF处理组细胞培养液中加入不同浓度PEDF(10 nmol·L-1、40 nmol·L-1、160 nmol·L-1、640 nmol·L-1),24 h后收集细胞分别用RT-PCR和Western-blot法分析Müller细胞内VEGF mRNA和蛋白的表达.结果 VEGF处理组中,VEGF浓度为1 000 nmol·L-1、5 000 nmol·L-1时,PEDF mRNA分别为正常对照组的0.69倍(P<0.05)和0.44倍(P<0.01),PEDF蛋白分别为正常对照组的0.54倍(P<0.05)和0.52倍(P<0.05).随VEGF浓度的升高,PEDF mRNA及蛋白表达均有逐渐减弱趋势.PEDF处理组中,PEDF浓度为40 nmol·L-1和160 nmol·L-1时,VEGF mRNA分别为正常对照组的0.61倍(P<0.05)和0.42倍(P<0.01),VEGF蛋白分别为对照组的0.70倍(P<0.05)、0.63倍(P<0.05).随PEDF浓度的升高,VEGF mRNA及蛋白表达亦有逐渐减弱趋势.结论 在Müller细胞内,VEGF对PEDF表达具有抑制作用,PEDF对VEGF也具有抑制作用,二者的负反馈调节作用可能在视网膜病理性新生血管中起重要作用.