两株宫颈癌细胞株中HPV16E6/E7蛋白的表达

目的 :探索及检测宫颈癌细胞株 Caski、 Si Ha细胞内 HPV1 6 (16型人乳头瘤病毒 ) E6 /E7蛋白含量 ,筛选宫颈癌基因治疗研究的合适细胞株。方法 :用间接免疫荧光染色及流式细胞术检测 Caski、 Si Ha宫颈癌细胞株中 HPV1 6 E6 、 HPV1 6E7蛋白含量 (荧光强度值 )。结果 :Caski细胞中 HPV1 6 E6 、 HPV1 6 E7蛋白含量分别为 :2 0 .72± 6 .35、 5 6 .80± 4 .30 ;Si Ha细胞中 HPV1 6 E6 、E7蛋白含量分别为 :1.77± 0 .75、 4 9.2 7± 8.0 6。 2细胞株间 HPV1 6 E7蛋白表达量无明显差异 (P>0 .0 5 )。结论 :Caski、Si Ha宫颈癌细胞株中 HPV1 6 E6 、E7蛋白的表达是不平行的。Caski细胞适用于以 HPV1 6 E6 ,HPV1 6 E7蛋白为观察对象的研究 ,Si Ha细胞可用于 HPV1 6 E7蛋白的研究 ,但不适宜用于以 HPV1 6 E6 蛋白为观察对象的研究。     

HPV16E6、E7蛋白在肺癌组织中的表达及意义

目的研究漯河周边地区非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)病变组织中HPV16E6、E7蛋白表达情况及与临床病理参数之间的关系,探讨HPV16E6和E7蛋白在NSCLC发病机制中的作用。方法 2010年3月—2011年6月采用免疫组织化学技术分别检测80例NSCLC标本和55例癌周对照组织中HPV16E6和E7蛋白的表达,并进行对比,计数资料采用χ2检验或确切概率法,P0.05为差异有统计学意义。结果 80例NSCLC组织中,HPV16 E6、E7、E6/E7蛋白的表达率分别为31.3%、33.8%和28.8%,55例癌旁组织中,HPV16E6、E7、E6/E7蛋白表达阳性率分别为14.5%、9.2%、7.3%。NSCLC组织中E6、E7和E6/E7蛋白共表达阳性率均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05),与患者年龄、性别以及肿瘤组织学类型无关,但与肿瘤分化以及淋巴结转移有关。结论 HPV16E6和E7蛋白在NSCLC发生发展中具有重要作用。     

宫颈癌及癌前病变中HPV16E6／E7的检测及其意义

To leam whether HPV16 E6/E7 genes correlate with cervical carcinoma and precancerous lesions. Methods Amplification and cloning of HPV16 E6/E7 genes were performed by PCR and molecular biological techniques for their sequences. Cervical cancer, CIN Ⅱ - Ⅲ and cervicitis were confirmed by pathologic detections. Results Detection rates of HPV16 E6/E7 in biopsies of cervical carcinoma, CIN Ⅱ - Ⅲ and cervicitis were individually 70%, 75% and 65%. Statistic results show that there is no difference among them in HPV16 E7 detection. Also ther is no difference between cervical cancer and CIN Ⅱ - Ⅲ in HPV16 E6 detection, however, both were higher detections than in cervicitis statistically. Conclusion HPV16 E6/E7 genes correlate with cervical carcinoma and precancerous lesions. E6 gene might especially function on occurrence of cervical carcinoma from precancerous lesions.     

新疆地区HPV16型变异体及E6、E7、LCR基因变异分析

目的 探讨新疆地区感染HPV16变异体谱系分布及E6、E7、LCR基因突变研究. 方法 对HPV16阳性的宫颈癌及癌前病变患者,提取基因组DNA,利用PCR扩增HPV16 DNA E6、E7基因及LCR区核苷酸片段,正反向测序.与HPV16基因序列分析比对,确定HPV16谱系分布,分析核苷酸突变位点. 结果 E6基因突变率为80.00％,主要突变位点为T350G(59.78％)和T178G(18.48％);E7突变率为54.78％,主要突变位点为A647G(33.33％)和T846C(26.98％);LCR突变率为23.48％,主要突变位点为C24T(74.07％)和C13T(18.52％).新疆维吾尔族妇女与汉族妇女之间比较,维吾尔族妇女T350G突变率(72.00％)显著高于汉族(45.24％),汉族妇女A647G(33.33％)、T846C(31.25％)、C24T(78.95％)三个突变率均显著高于维吾尔族(依次为20.00％、13.33％、62.50％),差异具有统计学意义.新疆汉族妇女中感染的HPV16主要为亚洲型,新疆维吾尔族妇女感染的HPV16主要为欧洲型. 结论 T350G突变可能是新疆维吾尔族妇女宫颈癌高发的原因之一,新疆汉族妇女中感染的HPV16型主要为亚洲型,新疆维吾尔族妇女感染的HPV16型主要为欧洲型.     

HPV癌基因E6/E7 mRNA在宫颈癌及癌前病变诊断中的临床价值

目的探讨HPV癌基因E6/E7 mRNA在宫颈癌及癌前病变诊断中的临床价值。方法选取2018年1月-2019年4月在庆元县人民医院就诊行宫颈癌筛查的患者275例,接受HPV分型、HPV E6/E7 mRNA以及必要的病理活检。结果 275例患者中,CINⅠ级患者12例,CINⅡ级患者8例,CINⅢ级患者5例,宫颈癌患者4例;随宫颈病变级别升高,HPV分型和HPV E6/E7mRNA阳性率有所升高,但差异无统计学意义(P>0. 05),其中宫颈癌组织HPV分型和HPV E6/E7 mRNA阳性率均达到100. 00%;HPV E6/E7 mRNA诊断CINⅡ及以上病变的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为82. 35%、65. 50%、13. 59%和98. 26%,HPV分型诊断CINⅡ及以上病变的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为88. 24%、65. 12%、14. 29%和98. 82%,HPV分型和HPV E6/E7 mRNA诊断价值比较差异无统计学意义(P>0. 05); HPV分型和HPV E6/E7 mRNA联合诊断CINⅡ及以上病变的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为100. 00%、78. 68%、23. 61%和100. 00%。结论 HPV E6/E7mRNA在宫颈癌及癌前病变诊断中有较好的应用价值,与HPV分型联合应用有助于宫颈高级别病变的检出。     

HPV E6/E7 mRNA检测在液基薄层细胞学异常女性患者宫颈病变筛查中的临床应用

目的探讨高危人乳头瘤病毒(HPV) E6/E7 mRNA检测在液基薄层细胞学(TCT)异常女性宫颈病变筛查中的临床应用价值。方法选取2015年11月-2016年11月在湖州市妇幼保健院妇科门诊就诊患者同时行TCT检测、高危型HPV DNA检测及脱落细胞学HPV E6/E7检测,其中TCT异常且高危型HPV DNA阳性或者HPV E6/E7阳性患者252例进一步行阴道镜检查,必要时行宫颈活检。结果随着宫颈组织学病变的加重,HPV E6/E7 mRNA阳性表达率随之增加,病理组织学诊断≤LSIL组(包括宫颈炎及LSIL)中HPV E6/E7 mRNA的阳性表达率显著低于病理组织学诊断≥HSIL组(包括HSIL及宫颈癌),病理组织学诊断≤LSIL组中HPV E6/E7 mRNA的阳性表达率低于HPV DNA的阳性表达率,差异均有统计学意义(P0. 05);病理组织学诊断≥HSIL组中两者的阳性表达率比较差异无统计学意义(P0. 05)。HPV E6/E7 mRNA检测预测组织学诊断≥HSIL病变的特异度、阳性预测值及阴性预测值均高于HPV DNA,差异均有统计学意义(P0. 05);而两者的灵敏度比较差异则无统计学意义(P0. 05)。HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA对诊断≥HSIL者的ROC曲线下面积分别为0. 777、0. 594,HPV E6/E7mRNA检测≥HSIL者的准确性高于HPV DNA,差异有统计学意义(P0. 05)。结论高危HPV E6/E7 mRNA阳性表达率与宫颈病变级别呈正相关;在TCT异常患者中,结合高危HPV E6/E7 mRNA检测对高级别宫颈上皮内病变具有较高的诊断价值,与HPV DNA相比它具有更高的特异度及阴性预测值,更有助于宫颈病变的筛查。     

宫颈癌中CDC6、Survivin蛋白的表达与HPV16/18感染的相关性

[目的]研究CDC6、Survivin在宫颈癌组织中的表达及其与HPV16/18感染的相关性,以探讨宫颈癌的发生机制,进一步寻找有利于宫颈癌诊断的新的分子标志物,以指导其诊断与预后.[方法]采用免疫组织化学方法对50例宫颈癌、20例宫颈上皮内瘤样病变CIN1、20例CINⅡ-Ⅲ、20例正常宫颈组织进行CDC6、Survivin的检测,同时采用PCR技术检测HPV16/18感染情况.[结果](1)在宫颈癌组织中CDC6和Survivin表达的阳性率高于CIN和正常宫颈组织,差异有统计学意义(均P＜0.05),且CDC6和SurvMn阳性表达率与病理分级、淋巴结转移有关,差异有统计学意义(均P＜0.05),CDC6、Survivin阳性表达率均与年龄分组、临床分期无关(均P＞0.05). (2)HPV16/18在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌中的阳性率逐渐升高,差异有统计学意义(P＜0.05),但与年龄、临床分期、病理分级、淋巴转移无关(均P＞0.05). (3)在宫颈癌组织中CDC6与HPV16/18感染呈正相关(P＜0.05),Survivin与CDC6、HPV16/18感染呈正相关(均P＜0.05).[结论]宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌鲴织中CDC6、Survivin表达的改变可能与HPV16/18感染有关,且互相作用,共同影响CIN的发展及宫颈癌的发生.     

抑制 HPV18型 E7蛋白的表达对 Hela细胞生物学特性及 miR-204表达的影响

目的：通过小干扰RNA（ siRNA）抑制宫颈癌Hela细胞中人乳头瘤病毒（ HPV）18型E7的表达,研究E7蛋白对Hela细胞的生物学特性和miR-204表达的影响和关系,探索HPV致癌的分子机制。方法设计合成靶向HPV18型E7基因的siRNA,转染Hela细胞,抑制HPV18-E7的表达;采用RT-PCR和Western blot分别检测Hela细胞中HPV18-E7的mRNA和蛋白水平,用流式细胞术检测Hela细胞的细胞周期和凋亡,通过荧光实时定量PCR检测miR-204的表达水平。结果 pRNAT-HPVE7与两个对照组比较,明显抑制了Hela细胞HPV18-E7的mRNA（ t值分别为2．69、2．46,均P＜0．05）和蛋白（ t值分别为3．93、4．20,均P＜0．05）的表达,细胞周期趋于正常,凋亡率增高（t值分别为－6．87、－6．92,均P＜0．05）,miR-204表达水平也明显升高（t值分别为0．26、0．22,均P＜0．05）。结论抑制HPV18-E7基因的表达能改变Hela细胞的生物学特性和上调miR-204表达。     

HPV16E6真核表达载体的构建及其在CaSki细胞中的表达及定位

目的:构建pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,转染CaSki细胞,检测其在CaSki细胞中的表达。方法:用RT-PCR法从CaSki细胞中扩增出带有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点的HPV16E6基因片段,将HPV16E6基因全长片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEGFP-C2上,通过脂质体将pEGFP-C2-HPV16E6转染入CaSki细胞。结果:pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体构建成功,转染CaSki细胞48h后经RT-PCR及Western-blot检测可见HPV16E6蛋白的高表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白主要在CaSki细胞核内表达。结论:成功构建了pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,为进一步对HPV16E6的研究奠定了基础。     

Characterization of HPV18 E6-specific T cell responses and establishment of HPV18 E6-expressing tumor model

Human papillomavirus (HPV) has been identified as the primary etiologic factor of cervical cancer, and subsets of anogenital and oropharyngeal cancers. HPV18 is the second most prevalent high-risk HPV type after HPV16. Furthermore, HPV18 is responsible for approximately 12% of cervical squamous cell carcinoma and 37% of cervical adenocarcinoma cases worldwide. In this study, we aimed to characterize the HPV18-E6-specific epitope and establish an HPV18 animal tumor model to evaluate the E6-specific immune response induced by our DNA vaccine. We vaccinated naïve C57BL/6 mice with a prototype DNA vaccine, pcDNA3-HPV18-E6, via intramuscular injection followed by electroporation, and analyzed the E6-specific CD8+ T cell responses by flow cytometry using a reported T cell epitope. We then characterized the MHC restriction element for the characterized HPV18-E6 epitope. Additionally, we generated an HPV18-E6-expressing tumor cell line to study the antitumor effect mediated by E6-specific immunity. We observed a robust HPV18-E6aa67-75 peptide-specific CD8+ T cell response after vaccination with pcDNA3-HPV18-E6. Further characterization demonstrated that this epitope was mainly restricted by H-2K^b, but was also weakly presented by HLA-A¹0201, as previously reported. We observed that vaccination with pcDNA3-HPV18-E6 significantly inhibited the growth of HPV18-E6-expressing tumor cells, TC-1/HPV18-E6, in mice. An antibody depletion study demonstrated that both CD4+ and CD8+ T cells are necessary for the observed antitumor immunity. The characterization of HPV18-E6-specific T cell responses and the establishment of HPV18-E6-expressing tumor cell line provide infrastructures for further development of HPV18-E6 targeted immunotherapy.     

HPV 18型E6蛋白抗原表位预测与分析

目的 用生物信息学方法分析预测HPV 18型E6蛋白的B细胞和T细胞表位,为宫颈癌免疫治疗的疫苗及药物开发提供参考靶点。方法 基于NCBI中HPV18型E6蛋白的氨基酸序列,利用DNA star软件预测其二级结构、亲水性、表面可及性及柔韧性;利用ABCpred软件预测出其B细胞表位;综合使用CTLPred和NetMHC 4.0软件分析其CTL表位;ProPred和NetMHCIIpan 3.1软件预测其Th表位。结果 HPV 18型E6蛋白二级结构中α螺旋和β转角较多且分布较为均匀;预测出了4个B细胞表位,它们大多与亲水性强、表面可及性好、柔韧性好的蛋白区域重叠,易于结合抗体;E6蛋白具有丰富的细胞毒性和辅助性T细胞表位。结论 HPV 18型E6蛋白作为宫颈癌免疫治疗的理想靶点具有同时诱导特异性体液免疫和细胞免疫的潜能,通过对其B/T细胞抗原表位的预测为免疫治疗相关疫苗及药物抗原肽的选择提供了理论依据。     

HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA和TCT检测在宫颈上皮内瘤变筛查中的应用

目的分析人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)E 6/E 7 mRNA、第二代杂交捕获技术(hybrid Capture,HCⅡ)和薄层液基细胞学技术(thinprep cytology test,TCT)在宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)筛查中的效能,选择适宜的分流筛查方案。方法采用病例-对照研究设计,80例CINⅠ~+的病例样本为HCⅡ或TCT筛查阳性并经组织学诊断;132例正常或炎症标本包括:组织学诊断正常或炎症的标本;HCⅡ阴性,TCT阴性且HPV E 6/E 7 mRNA均为阴性的标本。检测方法分别为:TCT进行细胞学检测、用b-DNA技术检测其HPV E 6/E 7 mRNA和用HCⅡ检测HPV DNA。结果在212例正常或宫颈炎和CIN标本中,HCⅡ的阳性率(37.74%)显著高于HPV E 6/E 7 mRNA的阳性率(25.94%)(P0.05);与TCT的阳性率(31.60%)比较差异无统计学意义(P0.05)。TCT的检出率高于HPV E 6/E 7mRNA的检出率,但差异无统计学意义(P0.05)。HPV E 6/E 7 mRNA与HCⅡ的符合率最高,Kappa为0.733,P=0.000;其次为HC II和TCT的符合率,Kappa为0.564,P=0.000;HPV E 6/E 7 mRNA与TCT的符合率,Kappa仅为0.519,P=0.000。并且,在HCⅡ检测结果阳性的67例CINⅠ~+样本中,HPV E 6/E 7 mRNA检测或TCT检测结果皆为阳性。而在HCⅡ阳性的13例正常或炎症样本中,HPVE 6/E 7 mRNA+或TCT结果阳性仅有7例(53.85%)。结论在CINⅠ~+分流筛查方案中,HPV E 6/E 7 mRNA和TCT共同作为HCⅡ阳性分流筛查的方法,可有效降低HCⅡ的假阳性。     

胞质分裂阻断法及染色体畸变实验检测水质诱变性及两种方法的比较

运用人胚肺细胞胞质分裂阻断法（ＣＹ－ＭＮＴ）及染色体畸变实验（ＳＣＡ）检测了某市水源水及自来水的遗传毒性，并比较了两短测实验方法和相应的反映细胞毒性的指标ＮＤＩ（ｎｕｃｌｅａｒｄｉｖｉｓｉｏｎｉｎｄｅｘ）和ＭＩ（ｍｉｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ）之间的关系。结果表明：该市的水源水及自来水中的有机提取物可不同程度地诱导微核率及染色体畸变率的升高，并且各实验剂量组与ＮＤＩ、ＭＩ有很好的负相关关系，源水的相关系数分别为－０．９０４、－０．９８０，自来水的相关系数分别为－０．８８２、－０．９１８，微核率（ＭＮＢＮ，Ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅａｔｅｄｂｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ）与染色体畸变率（ＳＣＡ，Ｓｔｒｕ－ｔｕｒａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｂｅｒａｔｉｏｎ）及ＮＤＩ与ＭＩ有很好的相关性，源水的相关系数分别为０．８８６、０．９５８，自来水的相关系数分别为０．９９４、０．９６０。     

P53、MDM2、P21、P16在云锡矿粉诱导的人支气管上皮恶性转化细胞中的表达

[目的]研究P53通路相关蛋白在云锡矿粉诱导的细胞恶性转化过程中的变化情况。[方法]采用免疫荧光细胞化学染色技术分别检测正常人支气管上皮细胞株(BEAS-2B)、矿粉作用后第25代细胞(BEAS-MD-25)及软琼脂克隆形成细胞(BEAS-MD-C)中P53、MDM2、P21、P16的表达。[结果]P53、MDM2蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阴性,而在BEAS-MD-25及BEAS-MD-C细胞中均呈阳性;P21、P16蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阳性,随细胞转化进程表达不断下降;在BEAS-MD-25细胞中呈弱阳性;在BEAS-MD-C中呈阴性。[结论]转化细胞中P53、MDM2、P21、P16的表达异常,提示其P53通路已发生改变,第25代细胞P53蛋白的阳性表达,提示P53基因异常可能是细胞发生恶性转化的关键步骤之一。     

Preclinical safety evaluation of DNA vaccines encoding modified HPV16 E6 and E7

Persistent infection with high-risk human papillomaviruses (hrHPV) can result in the formation of anogenital cancers. As hrHPV proteins E6 and E7 are required for cancer initiation and maintenance, they are ideal targets for immunotherapeutic interventions. Previously, we have described the development of DNA vaccines for the induction of HPV16 E6 and E7 specific T cell immunity. These vaccines consist of 'gene-shuffled' (SH) versions of HPV16 E6 and E7 that were fused to Tetanus Toxin Fragment C domain 1 (TTFC) and were named TTFC-E6SH and TTFC-E7SH. Gene-shuffling was performed to avoid the risk of inducing malignant transformation at the vaccination site. Here, we describe the preclinical safety evaluation of these candidate vaccines by analysis of their transforming capacity in vitro using established murine fibroblasts (NIH 3T3 cells) and primary human foreskin keratinocytes (HFKs). We demonstrate that neither ectopic expression of TTFC-E6SH and TTFC-E7SH alone or in combination enabled NIH 3T3 cells to form colonies in soft agar. In contrast, expression of HPV16 E6WT and E7WT alone or in combination resulted in effective transformation. Similarly, retroviral transduction of HFKs from three independent donors with both TTFC-E6SH and TTFC-E7SH alone or in combination did not show any signs of immortalization. In contrast, the combined expression of E6WT and E7WT induced immortalization in HFKs from all donors. Based on these results we consider it justified to proceed to clinical evaluation of DNA vaccines encoding TTFC-E6SH and TTFC-E7SH in patients with HPV16 associated (pre)malignancies.     

双向电泳分析结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞恶变后的蛋白表达差异

[目的]建立双向凝胶电泳分析方法，比较结晶型NiS诱发入支气管上皮细胞恶变后的蛋白表达差异。[方法]采用一步法分别提取人支气管上皮细胞系16HBE细胞和结晶型NiS诱发该细胞系的恶性转化细胞N-2细胞的可溶性总蛋白，经双向凝胶电泳分离、银染显色、用双向电泳凝胶图像分析软件ImageMaster2D3．10分析两者之间可溶性蛋白的差异表达。[结果]获得了分辨率和重复性较好的双向电泳银染图谱。图像分析显示在恶性转化细胞中检测到19个新的蛋白点，同时有47个蛋白点消失，有140个蛋白点在两种细胞中表达量有显著差异，其中89个蛋白点在N-2细胞中表达升高，51个蛋白点在N-2细胞中表达降低。[结论]双向电泳技术分析NiS诱发细胞恶性转化后蛋白质组发生了变化，这将为镍致癌相关的蛋白的研究和鉴定奠定基础。     

人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA检测宫颈高度病变的临床评价

目的 评价人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA检测宫颈高度病变的效能.方法 用PreTect~(TM) HPV-Proofer检测法检测65例妇女宫颈上皮细胞HPV E6/E7 mRNA转录情况,以液基细胞学检测(LBC)结果为标准评价HPV E6/E7 mRNA检测宫颈高度病变[不能除外高度不典型鳞状细胞(≥ASC-H)]的效能.结果 高度组(≥ASC-H组)HPV E6/E7 mRNA转录阳性率(63.6%)高于低度组(相似文献