新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR2的体外研究

目的 探讨趋化因子受体CCR2在体外培养神经干细胞的表达.方法 采用无血清方法分离、培养新生大鼠海马神经干细胞,细胞免疫荧光方法检测神经干细胞标志巢蛋白(nestin)表达及干细胞多向分化为神经元及胶质细胞的能力,通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测神经干细胞表达趋化因子受体CCR2的情况.结果 体外培养新生大鼠海马神经干细胞呈nestin阳性,可分化为NF200阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞及CNP阳性少突胶质细胞,CCR2细胞免疫荧光及RT-PCR证实神经干细胞表达趋化因子受体CCR2.结论 新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR2,为进一步研究其体内、外迁移提供理论依据.     

大鼠星形胶质细胞CB1R体内外差异表达

目的探讨大鼠脑在体和培养中星形胶质细胞大麻素Ⅰ型受体(cannabinoid type 1 receptor, CB1R)表达特点。 方法取3月龄大鼠脑海马切片,进行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和CB1R荧光免疫荧光双标染色;同时取刚出生大鼠鼠脑进行原代、传代培养,获取高纯度星形胶质细胞,行GFAP和CB1R免疫荧光双标染色。所有标本在激光共聚焦显微镜下,观察星形胶质细胞CB1R表达状况。 结果大鼠在体海马切片染色显示,CB1R呈点状分布于海马CA1区,尤其以锥体细胞层明显,GFAP标记的星形胶质细胞CB1R呈阴性表达;而培养中的GFAP标记阳性的星形胶质细胞,CB1R呈阳性表达,且主要集中在细胞核周围分布。 结论在体海马和细胞培养中的星形胶质细胞CB1R表达不同,与生理状态比较,细胞培养状态下星形胶质细胞CB1R表达存在明显改变。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法建立及鉴定

目的：纯化和鉴定体外培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞.方法：取1~3天新生大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元等,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）鉴定星形胶质细胞.结果：培养的细胞具有典型的星形胶质细胞形态且生长旺盛,第3代95%以上为星形胶质细胞,特异性抗原GFAP表达阳性.结论：该方法操作简单,可靠,是一种有效的新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法.     

aFGF对庆大霉素所致海马星形胶质细胞损害的保护作用

目的 研究酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对庆大霉素(GM)引起的体外培养的大鼠海马星形胶质细胞损害的保护作用.方法 大鼠海马经分离、剪切、胰蛋白酶消化,进行星形胶质细胞的体外培养.采用兔抗GFAP多克隆抗体进行免疫组织化学染色鉴定,传3代细胞接种于96 孔培养板.(1)培养24 h后加入一系列浓度的GM,再培养2...     

大鼠星形胶质细胞培养方法的改进

目的 改进星形胶质细胞的体外纯化培养方法,为研究星形胶质细胞的生物学功能提供实验模型.方法 采用新生 SD大鼠,无菌操作取其大脑皮质,用0.025%的胰酶吹打消化成单个细胞,替代传统的0.25%的胰酶水浴消化15 min,单个细胞悬液接种于预先包被好PDL的24孔板或25 cm2的细胞培养瓶中,体外培养9~14天至细胞完全融合并铺满瓶底后进行传代.第2代细胞应用抗GFAP的抗体进行免疫荧光染色来鉴定星形胶质细胞的纯度.结果 免疫荧光染色结果显示这种培养方法分离培养出的星形胶质细胞纯度达到90%以上.结论 采用本实验改进的方法,培养的大鼠星形胶质细胞纯度高、生长状态良好,符合体外研究要求.     

枸杞叶及枸杞多糖对星形胶质细胞α7nAChR的表达影响

【目的】 探讨不同剂量枸杞叶和枸杞多糖对5、7个月龄快速老化模型小鼠SAMP8脑海马星形胶质细胞及原代培养的SD大鼠脑海马星形胶质细胞α7nAChR表达的影响。 【方法】 实验一:选用 5、7 个月龄SAMP8,以同龄正常老化SAMR1 为正常对照。SAMP8随机分为给药组和对照组,给药组分为枸杞叶全汁高、低剂量组和枸杞多糖高、低剂量组。给药组灌胃服用高、低剂量枸杞叶全汁或枸杞多糖,每天1次,连续8周,对照组灌胃服用等量蒸馏水;免疫荧光双标染色检测SAMP8脑海马星形胶质细胞α7nAChR的表达。实验二:用含10%、20%枸杞叶及枸杞多糖脑脊液培养海马原代星形胶质细胞,于给药后培养24、36、48、72 h后收集细胞,采用MTS细胞活性检测,免疫荧光及蛋白质印迹法检测α7nAChR的表达。 【结果】 实验一:免疫荧光双标结果显示:(1)5、7 个月龄SAMR1较同月龄SAMP8脑海马区星形胶质细胞和α7nAChR阳性细胞表达均减少;(2)5个月龄SAMP8对照组较7个月龄SAMP8对照组脑海马区星形胶质细胞和α7nAChR阳性细胞表达均减少;(3)5、7个月龄SAMP8各给药组与同月龄SAMP8对照组比较,各给药组脑海马区星形胶质细胞和α7nAChR阳性细胞表达均减少;(4)同月龄高、低剂量组间无明显变化。实验二:(1)细胞活性结果显示:与空白脑脊液组比较,含10%、20%枸杞叶及枸杞多糖脑脊液培养海马原代星形胶质细胞36、48、72 h后,其细胞的活性均增加,但10%枸杞多糖脑脊液组有显著性差异;(2)蛋白质印迹结果显示:与空白脑脊液组比较,含10%、20%枸杞叶及枸杞多糖脑脊液培养海马原代星形胶质细胞36、48 h后,α7nAChR表达均增加,但10%枸杞多糖脑脊液组有显著性差异。 【结论】 不同剂量枸杞叶和枸杞多糖对5、7个月龄快速老化模型小鼠SAMP8及原代培养的SD大鼠脑海马星形胶质细胞α7nAChR表达均有影响。     

新生大鼠海马区神经干细胞分离培养和单细胞克隆系建立及鉴定

目的:分离培养新生大鼠海马区神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),建立NSCs单细胞克隆系。方法:取新生SD大鼠海马组织分离NSCs后无血清技术培养,建立其克隆系并行单细胞传代克隆培养。采用细胞免疫荧光和RT-PCR等技术对NSCs进行鉴定,分子标志物选择Nestin和Sox2。NSCs诱导分化的神经元的鉴定,标示物选择早期神经元特异性微管蛋白(β-tubulin),星形胶质细胞标示物为特异性胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),少突胶质细胞特异性标记蛋白为髓鞘相关蛋白(cyclic nucleotide phosphodiesterase,CNP)。结果:无血清培养法可维持NSCs生长和促进其增殖。成功建立NSCs单细胞克隆系,传代可获得大量亚克隆NSCs株团。单细胞克隆NSCs球团经早期酶消化结合后期机械吹打法传代,分散为单细胞或类单细胞后,增殖及分化能力依然存在。单细胞克隆系株经Nestin和Sox2细胞免疫荧光或RT-PCR检测均为阳性表达。在加有胎牛血清培养基条件下进行诱导分化,来自单细胞克隆系的细胞株同样可分化为神经元样、星形胶质细胞样和少突胶质细胞样3种神经细胞,即β-tubulin、GFAP、CNP免疫荧光染色分别呈阳性。结论:无血清培养可成功建立新生SD大鼠海马区NSCs单细胞克隆系,并可稳定传代增殖,并在一定条件下可诱导分化为成熟的神经元和神经胶质细胞。     

柴胡皂苷a对体外培养大鼠海马星形胶质细胞激活的抑制作用

目的 研究柴胡皂苷a(SSa)对体外培养大鼠海马星形胶质细胞激活的干预作用,为癫痫的中医药防治提供实验依据.方法 首先分离剥取SD大鼠(1～3 d)大脑海马.体外培养海马星形胶质细胞,经纯化鉴定后将其分为5组:a组(正常组)、b组(谷氨酸激活组)和c、d、e组(SSa药物干预组,分别为5、2.5、1.25 mg/L),经相应处理后,分别运用MTT法、流式细胞技术、Western-blotting测定星形胶质细胞数量及活性、细胞周期、星形胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达量,并分析比较各组星形胶质细胞激活情况.结果 与b组比较,MTT比色法检测结果显示SSa抑制了谷氨酸激活星形胶质细胞的增殖(P<0.05);流式细胞技术检测结果显示SSa阻滞了谷氨酸激活星形胶质细胞的分裂周期(P<0.05);Western-blotting检测结果显示SSa可抑制谷氨酸激活星形胶质细胞异常增加的GFAP表达量(P<0.05);与a组比较,3种检测结果均显示2.5 mg/L SSa对体外培养星形胶质细胞激活的抑制作用较强,并可维持其在正常范围(P>0.05).结论 SSa具有抑制谷氨酸激活体外培养星形胶质细胞的作用,其可能通过抑制星形胶质细胞的激活来发挥抗癫痫作用.     

aFGF对庆大霉素所致海马星形胶质细胞损害保护作用的实验研究

目的 研究酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对庆大霉素（GM）引起的体外培养的大鼠海马星形胶质细胞损害的保护作用。方法 大鼠海马经分离、剪切、胰蛋白酶消化,进行星形胶质细胞的体外培养。采用兔抗GFAP多克隆抗体进行免疫组织化学染色鉴定,传3代细胞接种于96 孔培养板：（1）培养24 h后加入一系列浓度的GM,再培养24h后用MTT法检测细胞存活率;（2）培养24h后在系列GM浓度的基础上加入一定浓度的aFGF,继续培养24h后用MTT法检测细胞存活率。结果 aFGF能使GM对星形胶质细胞的半数抑制浓度(IC50)升高。结论 aFGF对GM损伤的大鼠海马星形胶质细胞有一定的保护作用。     

水通道蛋白1、4在培养大鼠星形胶质细胞、BT325细胞及人脑胶质瘤组织中的表达

目的 水通道蛋白作为细胞膜特异性水转运蛋白在脑内分布广泛,参与脑内水平衡调节,与脑肿瘤、脑创伤等多种疾病导致的脑水肿有关.本实验主要研究水通道蛋白1、4在培养大鼠星形胶质细胞、人多形性胶质母细胞瘤系BT325细胞及人脑胶质瘤组织中的表达情况.方法 应用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定培养大鼠星形胶质细胞及BT325细胞.应用反转录PCR法检测GFAP、AQP1及AQP4在不同组织细胞中的表达.结果 实验中培养大鼠星形胶质细胞及BT325细胞GFAP免疫细胞化学染色阳性.体外培养大鼠星形胶质细胞、人胶质母细胞瘤组织及对照组标本均有GFAP表达,同时也有AQP1及AQP4表达.BT325细胞只有GFAP表达,无AQP1及AQP4表达.结论 AQP1、4在培养大鼠星形胶质细胞及胶质瘤组织中均有表达,可能对脑功能的维持及肿瘤性脑水肿的发生、消散有重要影响.     

成年大鼠侧脑室下区星形胶质细胞的培养与纯化

目的:探讨SD大鼠侧脑室下区星形胶质细胞(AST)的体外培养与纯化方法。方法:将差速贴壁后SD大鼠侧脑室下区AST置于含有B27添加剂的DMEM/F12中培养,采用低浓度血清(2.5～5ml/L)调整法对AST进行纯化。观察AST生长变化,采用形态学和GFAP免疫细胞化学染色进行细胞和纯度鉴定。结果:体外培养的大鼠侧脑室下区星形胶质细胞呈纤维状聚集或类圆形散在生长,GFAP染色呈阳性反应,细胞胞浆着色较深,高倍视野下细胞骨架形态清晰可见,细胞核不着色。在体外培养14～15d时可以获得91%的AST。结论:差速贴壁结合低浓度血清调整法是一种简单实用的AST体外培养纯化方法。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法的建立及鉴定

目的:大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外培养、纯化和鉴定.方法:新生1-3d大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定星型胶质细胞.结果:培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态且生长旺盛,第3代星形胶质细胞纯度达95％.结论:本研究建立的星形胶质细胞体外培养方法操作简单、可靠.     

地塞米松抑制星形胶质细胞P2Y_1受体表达及TNF-α分泌

目的观察不同浓度地塞米松对大鼠体外培养脊髓背角星形胶质细胞P2Y1受体表达及TNF-α分泌的影响。方法培养并纯化大鼠脊髓背角星形胶质细胞,地塞米松(终浓度分别为0.1、1、10μmol/L)处理24 h后,采用免疫组织化学染色观察P2Y1受体的表达,双抗夹心间接酶联免疫吸附法测定上清液中TNF-α含量。结果地塞米松(0.1、1、10μmol/L)作用24 h后,与对照组比较,脊髓背角星形胶质细胞P2Y1受体表达下调,并呈剂量依赖性(P<0.01),TNF-α分泌量亦呈剂量依赖性下降(P<0.01)。结论地塞米松能抑制体外培养大鼠脊髓背角星形胶质细胞P2Y1受体表达及TNF-α的分泌。     

大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞的生物学特性

目的 探讨大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞在体外条件下的增殖及分化等生物学特性,为进一步研究脊髓脱髓鞘疾病的髓鞘再生奠定基础.方法 采用免疫吸附法原代培养大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞,并用免疫荧光染色鉴定其表面标志物A2B5及NG2;采用Alarm blue法检测其在体外的增殖能力,并绘制生长曲线;诱导原代培养的少突胶质前体细胞向成熟少突胶质细胞分化,并用免疫荧光染色鉴定成熟少突胶质细胞表面标志物MBP及GalC的表达情况.结果 免疫吸附法可以对大鼠脊髓组织中的少突胶质前体细胞进行有效的分离纯化,分离获得的少突胶质前体细胞A2B5及NG2表达呈阳性,Alarm blue法检测结果显示少突胶质前体细胞在体外具有良好的增殖能力,诱导分化实验证实少突胶质前体细胞可以分化为成熟少突胶质细胞并且MBP及GalC表达呈阳性.结论 采用免疫吸附法原代培养的大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞在体外具有良好的增殖能力以及分化为成熟少突胶质细胞的能力.     

大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠脊髓组织星形胶质细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法:于无菌条件下取新生1~2 d的SD大鼠脊髓组织,采用机械吹打及胰酶消化法制成细胞悬液,通过差速贴壁和恒温摇床震荡去除杂细胞,进行培养。用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色对所培养的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态,传至第3代细胞纯度达95%以上。结论:成功建立了大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法,为脊髓星形胶质细胞的实验研究奠定基础。     

短暂性前脑缺血-再灌注后小鼠海马星形胶质细胞bcl-2和bax蛋白表达的动态变化及抗呆Ⅰ号的影响

应用免疫组织化学方法观察抗呆Ⅰ号对小鼠前脑缺血再灌注损伤海马星形胶质细胞表达bcl-2和bax动态变化的影响,探讨其与缺血性神经元的联系.结果发现:前脑缺血再灌注3～7 d bcl-2表达呈强阳性.再灌注7～10 d bax表达呈强阳性.用药组bcl-2和bax的表达较模型组均减弱.而正常对照组和假手术组无bcl-2和bax的表达.且星形胶质细胞表达bcl-2和bax的强弱与神经细胞的存亡有关.本实验提示:前脑缺血再灌注后海马反应性星形胶质细胞表达bcl-2和bax呈动态变化,抗呆Ⅰ号对缺血再灌注损伤星形胶质细胞和神经细胞有良好的保护作用.     

红藻氨酸致痫后大鼠海马神经元和星形胶质细胞的反应性变化

目的研究红藻氨酸(Kainic acid, KA)诱导大鼠癫痫发作后海马内神经元和星形胶质细胞的反应变化情况。方法立体定向大鼠侧脑室内注射KA引起大鼠癫痫发作,用抗即早反应基因Fos蛋白和抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学方法,分别观察痫性发作后在各时间点反应性神经元和星形胶质细胞在海马各区的分布情况。结果KA诱导大鼠癫痫发作后,海马内Fos阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞明显增多。癫痫发作30 min后GFAP开始增多,1 h达高峰;1 h 后Fos阳性产物开始增多,2 h达高峰。结论海马内反应性的神经元和星形胶质细胞在癫痫发作后增加,反应性星形胶质细胞可能参与癫痫的发生及其调节。     

新生大鼠大脑皮质神经干细胞的分离培养与胆碱能神经元的鉴定

目的:体外分离和培养新生大鼠大脑皮质神经干细胞并进行鉴定,为用于脑梗死动物模型梗死区移植细胞作准备.方法:分离新生大鼠皮质神经干细胞,进行体外培养,使用免疫细胞荧光染色技术对细胞的特性进行鉴定,并对细胞的胆碱能特征进行鉴定.结果:获得了Nestin阳性的神经干细胞,其分化后可获得MAP-2、GFAP和 CNPase阳性的神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞;通过胆碱能鉴定发现大脑皮质干细胞可分化为胆碱能神经元. 结论:体外分离和培养的大脑皮质神经干细胞具有增殖分化的能力,并可以分化为胆碱能神经元,有望应用于皮质损伤后认知障碍及运动障碍的细胞移植治疗.     

体外血脑屏障模型的建立

目的:利用自发转化的人脐静脉内皮细胞系ECV304和分离纯化的大鼠星形胶质细胞共培养试图建立一种具有重复性好、细胞纯度高、培养操作简便、接近在体状态的体外血脑屏障模型。方法:分3步:(1)分离纯化培养大鼠星形胶质细胞;(2)建立体外血脑屏障BBB模型(内皮细胞系/星形胶质细胞非接触共培养);(3)模型鉴定。结果:利用ECV304与原代培养的星形胶质细胞共培养建立的血脑屏障模型无论是在形态学、屏障功能上还是内皮细胞的特异性标志物的表达水平上都与在体血脑屏障的特性相似。结论:可以利用ECV304与原代培养的星形胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型。     

SD大鼠脑皮层星形胶质细胞的原代培养及纯化方法改良

目的:探讨大鼠大脑皮层星形胶质细胞的培养方法,以获得纯度高的细胞进一步对其进行体外实验研究。方法:在Mc-Carthy方法基础上改用出生后1d的SD大鼠的大脑皮层,结合机械分离和胰酶消化后制备单细胞悬液接种,差速贴壁1h,培养14d以后上摇床以去除混杂细胞,细胞融合后传代,每次传代前都经历胰酶冲洗和差速贴壁,传3代后利用GFAP-FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果:经过原代传代及纯化,大脑皮层星形胶质细胞体外培养成功,并有较高的纯度。GFAP-FITC免疫荧光染色阳性。结论:经过合理取材、改良纯化方法后,可以更为简便得到纯度很高的星形胶质细胞。