SARS患者病原学诊断及病毒传播规律研究

目的探讨血清抗SARS-CoV特异性LgG、lgM;外周血单核细胞、漱口液以及粪便SARS-CoV特异性套式RT-PCR检测SARS-Cov RNA在SARS确诊中的意义,并通过研究其系列标本,进一步探讨SARS-Coy特异性IgG、IgM出现规律及病毒传播规律。方法临床诊断SARS患者28例。1周采集2次血清、大便及漱口液系列标本。ELISA测定血清抗SARS-CoV特异性lgG、lgM,套式RT-PCR检测外周血单核细胞、漱口液以及粪便SARS-CoV RNA。结果血清SARS-COV-lgM阳性率为50％(14/28);SARS-COv-lgG阳性率为78.6％(22/28)。早期(-10天)lgG可出现;4周阳性率最高;lgG出现晚(11天-)。2-3周阳性率最高;持续时间短(11天-),4周后大部分患者阴转。PBMC SARS-COVRNA阳性率为32.1％(9/28),病程10-14天阳性率最高;漱口液SARS-COVRNA阳性率为57.1％(16/28),大便SARS-COVRNA阳性率为60.7％(17/28);病程2-3周阳性率最高。85.7％(24/28)可确诊SARS;14.3％不能确诊SARS。结论 SARS诊断必须加入病原学诊断标准。而且必须结合特异性抗体、外周血单核细胞、漱口液以及大便SARS-CoV RNA检测,综合判断。由于SARS患者特异性抗体出现晚等特点。因此,SAPS特异性抗体不能作为早期诊断。SARS患者病程2-3周传染性可能最强,而早期(10天内)传染性可能弱。     

SARS冠状病毒的稳定性和抵抗力

分子生物学检测方法 聚合酶链式反应(PCR)可以检测各种标本中(血、粪便、呼吸道分泌物或体液)的SARS冠状病毒(SARS-CoV)的基因物质。世界卫生组织(WHO)网站已公布了SARS-CoV的PCR引物;PCR试剂盒,包括引物、阳性和阴性对照也即将面市。PCR实验是非常特异的,但缺乏敏感性。这就意味着阴性结果不能除外SARS-CoV感染。另一方面,如果实验室质量控制不好造成标本污染,也可有假阳性结果。同时,PCR的检测结果还要与临床和流行病学资料     

恢复期SARS患者排泌物中SARS-CoV核酸的定量检测

目的探讨恢复期严重急性呼吸综合征(SARS)患者是否携带病毒及具有传染性.方法选择SARS抗体(ELISA检测法)阳性的177例恢复期SARS患者,利用实时定量PCR法对患者的尿、粪便、咽漱液共531份标本中的SARS冠状病毒(SARS-CoV)核酸进行定量检测.结果177例患者中有49例(27.7%)标本病毒核酸检测阳性,其中31例(17.5%)1种标本阳性,14例(7.9%)2种标本阳性,4例(2.3%)3种标本阳性.尿、粪便、咽漱液的检出阳性率分别为14.7%(26例)、11.9%(21例)和13.6%(24例).标本中病毒核酸的拷贝数在100～47 000copies/ml之间,3种标本中病毒核酸不同拷贝数量级的患者阳性例数经χ2检验无明显差异.结论住院中的恢复期SARS患者约有十分之一仍然携带SARS-CoV.有必要将SARS冠状病毒核酸的实时定量PCR检测作为SARS患者出院与解除隔离的实验室指标.     

SARS病毒基因和特异性抗体检测效果评估

目的:评估严重急性呼吸综合征(SARS)病毒基因检测和特异性抗体检测效果.方法:采用巢式反转录PCR检测健康人、普通发热患者、不同时期SARS患者痰标本中的SARS病毒核酸即RNA;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上述几组血清标本中的特异性抗体IgG和IgM.结果:SARS患者住院6 d～57 d期间,采用巢式RT-PCR检测痰SARS病毒基因,56例患者中34例阳性,阳性率60.7 %;而采用间接ELISA检测血清抗SARS病毒抗体,56例患者中32例阳性,阳性率为57.1 %.两种方法均阳性的有15例,均阴性的有6例.2种病原学诊断方法检测20例正常人和15例发热非SARS患者,结果均为阴性.住院6 d～13 d组(92.3 %)巢式RT-PCR基因阳性率明显高于ELISA特异性抗体阳性率(7.7 %);住院>35 d组巢式RT-PCR基因阳性率(36.8 %)则明显低于ELISA特异性抗体阳性率(94.7 %)(P<0.01).结论:痰中SARS病毒基因检测可用于SARS的早期诊断,这对于提前确诊和治疗SARS患者,以及尽早排除疑似病例具有非常关键和现实的意义.血清特异性抗体检测可用于流行病学调查,但对SARS早期诊断和鉴别没有意义.     

儿童SARS血清流行病学调查及其依从性初步分析

目的①了解儿童严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome , SARS)患者SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)特异抗体水平;初步调查与成人SARS患者密切接触的儿童及与SARS患儿密切接触的家长中隐性感染情况.②了解本次血清流行病调查的依从性.方法①对开展本研究中的电话联系过程及结果予以记录和分析.②入户收集流行病学资料和采集标本.③采用间接免疫荧光(IFA)方法对北京市24例恢复期儿童SARS患者;与SARS成人患者密切接触的30名儿童和与上述SARS患儿密切接触的29位家长进行血清SARS-CoV 特异IgG检测.结果①在试图联系的527户家庭中,共与431个家庭进行了有效通话,其中191户因不符合条件被排除研究;176户拒绝参加本项研究; 在193个符合条件的家庭中,最终64户同意纳入研究(33.2%).②儿童SARS患儿血清SARS-CoV-IgG阳性者10例(42%).③儿童患者抗体阳性组中有明确SARS接触史的患儿所占比例为8/10,而在抗体阴性组的比例为1/14(P<0.05).④与成人SARS患者接触的儿童标本中1份SARS-CoV-IgG阳性(1/30,3%); SARS患儿的家长中一位(患儿的祖母) SARS-CoV-IgG为阳性(1/29,3%),该患儿的祖父为SARS患者.结论①本次儿童SARS血清流行病调查依从性较低.②临床诊断为SARS的患儿中有42%经血清学证实为SARS-CoV感染.③有SARS接触史的患儿在抗体阳性组的比例较之在抗体阴性组的比例明显增高.④在与成人SARS患者密切接触的儿童和成人中可能存在隐性感染.未能证实与儿童SARS患儿接触的成人中存在隐性感染.     

SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立

目的分析SARS冠状病毒广东株多聚酶基因片段的异质性,建立RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法,为SARS的快速诊断提供依据。方法合成针对SARS冠状病毒多聚酶基因区段的特异性引物,从广东省SARS病人及疑似病人标本中提取RNA,经反转录和巢氏PCR扩增出相应大小的DNA片段。对这些片段克隆后进行DNA序列分析,并将序列与SARS冠状病毒和其他已知冠状病毒进行同源性分析。结果从多例SARS病人痰、咽拭子或血液标本中得到RT-PCR阳性片段,随机选取其中8例经克隆和DNA序列分析证实均为SARS冠状病毒序列(同源性100%),而所有阴性参照标本RT-PCR均为阴性。克隆片段BNI109与已知冠状病毒在核苷酸和氨基酸水平进行分析显示,该片段与牛冠病毒(bovinecoronavirus,BCV)和鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus,MHV)同源性最高,在氨基酸水平上同源性高达75%。结论SARS冠状病毒多聚酶基因片段BNI109的保守性极强,适合建立RT-PCR法检测SARS冠状病毒。     

SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立

目的 分析SARS冠状病毒广东株多聚酶基因片段的异质性。建立RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法，为SARS的快速诊断提供依据。方法 合成针对SARS冠状病毒多聚酶基因区段的特异性引物，从广东省SARS病人及疑似病人标本中提取RNA，经反转录和巢氏PCR扩增出相应大小的DNA片段。对这些片段克隆后进行DNA序列分析，并将序列与SARS冠状病毒和其他已知冠状病毒进行同源性分析。结果 从多例SARS病人痰、咽拭子或血液标本中得到RT-PCR阳性片段，随机选取其中8例经克隆和DNA序列分析证实均为SARS冠状病毒序列(同源性100％)，而所有阴性参照标本RT-PCR均为阴性。克隆片段BNll09与已知冠状病毒在核苷酸和氨基酸水平进行分析显示，该片段与牛冠病毒(bovinecoronavirus，BCV)和鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)同源性最高，在氨基酸水平上同源性高达75％。结论 SARS冠状病毒多聚酶基因片段BNll09的保守性极强，适合建立RT-PCR法检测SARS冠状病毒。     

SARS病毒基因和特异性抗体检测效果评估

目的 :评估严重急性呼吸综合征 (SARS)病毒基因检测和特异性抗体检测效果。方法 :采用巢式反转录PCR检测健康人、普通发热患者、不同时期 SARS患者痰标本中的 SARS病毒核酸即 RNA;采用酶联免疫吸附试验(EL ISA)法检测上述几组血清标本中的特异性抗体 Ig G和 Ig M。结果 :SARS患者住院 6 d～ 5 7d期间 ,采用巢式 RT-PCR检测痰 SARS病毒基因 ,5 6例患者中 34例阳性 ,阳性率 6 0 .7% ;而采用间接 EL ISA检测血清抗 SARS病毒抗体 ,5 6例患者中 32例阳性 ,阳性率为 5 7.1%。两种方法均阳性的有 15例 ,均阴性的有 6例。2种病原学诊断方法检测2 0例正常人和 15例发热非 SARS患者 ,结果均为阴性。住院 6 d～ 13d组 (92 .3% )巢式 RT- PCR基因阳性率明显高于 EL ISA特异性抗体阳性率 (7.7% ) ;住院 >35 d组巢式 RT- PCR基因阳性率 (36 .8% )则明显低于 EL ISA特异性抗体阳性率 (94 .7% ) (P<0 .0 1)。结论 :痰中 SARS病毒基因检测可用于 SARS的早期诊断 ,这对于提前确诊和治疗SARS患者 ,以及尽早排除疑似病例具有非常关键和现实的意义。血清特异性抗体检测可用于流行病学调查 ,但对SARS早期诊断和鉴别没有意义。     

三种检测扎幌样病毒方法的比较分析

目的 比较三种常用检测扎幌样病毒的方法，以选取适合我国标本的较优检测方法。方法 对收集到的169份粪便分别采用三种逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行检测，扩增产物进行测序分析。结果 方法A、B、C检测阳性标本数分别为3份(排出诺瓦克病毒阳性标本后)、4份、1份。4份PCR产物测序分析只有1份为扎幌样病毒，其余为轮状病毒。结论 方法C特异枉最好，即半套式RT-PCR优于其它二种RT-PCR方法。     

SARS患者病原学诊断及病毒传播规律研究

目的探讨血清抗SARS—CoV特异性LgG、IgM；外周血单核细胞、漱口液以及粪便SARS—CoV特异性套式RT-PCR检测SARS—COV RNA在SARS确诊中的意义，并通过研究其系列标本，进一步探讨SARS—CoV特异性IgG、IgM出现规律及病毒传播规律。方法临床诊断SARS患者28例，1周采集2次血清、大便及漱口液系列标本。ELISA测定血清抗SARS—CoV特异性IgG、IsM，套式RT—PCR检测外周血单核细胞、漱口液以及粪便SARS—CoV RNA。结果血清SARS—COV—IgM阳性率为50％(14／28)；SARS—COV—IgG阳性率为78．6％(22／2s)。早期(-10天)IgG可出现；4周阳性率最高；IgG出现晚(11天-)，2—3周阳性率最高；持续时间短(11天-)，4周后大部分患者阴转。PBMC SARS—COVRNA阳性率为32．1％(9／28)，病程10—14天阳性率最高；漱口液SARS—COVRNA阳性率为57．1％(16／28)，大便SARS—COVRNA阳性率为60．7％(17／28)；病程2—3周阳性率最高。85．7％(24／2．8)可确诊SARS；14．3％不能确诊SARS。结论SARS诊断必须加入病原学诊断标准，而且必须结合特异性抗体、外周血单核细胞、漱口液以及大便SARS—CoVRNA检测，综合判断。由于SARS患者特异性抗体出现晚等特点。因此，SARS特异性抗体不能作为早期诊断。SARS患者病程2—3周传染性可能最强，而早期(10天内)传染性可能弱。     

严重急性呼吸综合征康复期患者血清抗体、肺功能和影像学资料动态分析

目的对北京地区临床诊断的严重急性呼吸综合征(SARS)康复者出院后进行定期临床随访,动态观察SARS冠状病毒特异性IgG抗体、肺功能和肺部影像学的变化。方法383例SARS患者康复后1年内定期进行SARS冠状病毒特异性IgG抗体、肺功能和肺部影像学检查,合并有肺弥散功能异常的康复者定期进行肺功能和胸部影像学复查,动态观察肺功能的恢复情况。部分合并有骨关节疼痛的患者进行股骨头磁共振检查。结果383例中有311例SARS冠状病毒特异性IgG抗体为阳性(812%),1年内动态观察康复者血清特异性抗体有明显下降。特异性IgG抗体为阳性的康复者中有85例(273%)合并有弥散功能(DLCO)异常,67例合并有肺部影像学异常。其中40例DLCO异常的康复者1年内肺功能和肺部影像学动态观察均有不同程度改善。78例进行股骨头磁共振检查的康复者中18例发现股骨头缺血性坏死改变(231%)。结论临床诊断为SARS的康复者中可能有部分为误诊病例,SARSCoVIgG抗体水平在出院后1年内逐渐降低,合并有肺纤维化改变的SARS康复者在一定时期内可明显吸收和好转,部分康复者合并有股骨头缺血性坏死改变。     

恒河猴感染SARS-CoV的病毒学、血清学检测

目的对感染SARS-CoV的8只恒河猴进行病毒学、血清学指标检测。方法SARS-CoV经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第1天开始到5、7、10、15、20、30和60天分别安乐处死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和抗体测定。结果RT-PCR证实感染病毒检出时间为5~16d,8只猴中的5只分离到了病毒,感染15d后可检测到抗体。结论感染SARS-CoV的恒河猴不仅出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,也在一定时期内排毒,出现特异免疫反应,这些指标均可作为药物筛选、疫苗评价等方面的重要参数。     

SARS肺纤维化发病机制的比较医学研究

目的初步探讨SARS病毒（SARS-CoV）感染动物模型是否适用于SARS肺纤维化发生机制的研究，阐述SARS肺纤维化发生的可能机制。方法用比较医学的研究的方法，将SARS病人肺纤维化的发病特点及可能的机制同目前已经建立的SARS动物模型进行比较。结果不同病种的肺间质纤维化性改变都是从肺泡炎开始，在发展和修复过程中导致的肺纤维化倾向有共同之处。SARS中大约有7．8％的康复者中出现比较严重的肺纤维化后遗症。SARS肺纤维化发生早，病情进展快，病人可于数日内死亡，病理改变严重。SARS-CoV感染动物模型已经建成，出现了拟人SARS的临床、病理学和血清学改变。SARS肺纤维化在模型动物中表现也比较明显，纤维母细胞及胶原纤维明显增多。结论SARS—CoV感染动物模型可以用于SARS肺纤维化发病机制的实验研究。     

SARS-CoV抗体实验诊断中的假阳性原因分析

目的：探讨严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)抗体在SARS病原学诊断中的假阳性问题。方法：应用酶联免疫吸附试验(EUSA)和荧光定量RT-PCR技术检测了16l例非SARS患者SARS-Cov抗体的阳性率。结果：59例正常对照中，IgG抗体的阳性率为3．4％(2／59)；40例肿瘤患者中，IgG抗体阳性率为17．5％(7／40)；3l例自身免疫病患者中，IgM抗体和IgG抗体阳性率分别为6．5％(2／31)和22．6％(7／31)，IgG抗体和IgM抗体同时阳性为6．5％(2／31)；3l例系统性红斑狼疮(SI正)患者中，IgM抗体和IgG抗体阳性率分别为29．0％(9／31)和58．1％(18／31)，IgG抗体和IgM抗体同时阳性为22．6％(7／31)。IgM和IgG抗体诊断SARS的假阳性率分别为6．8％和21．1％，两种抗体同时诊断SARS的假阳性率为5．6％。经RT—PCR证实上述阳性均为假阳性。结论：两种抗体同时测定可降低诊断的假阳性率，提高诊断的特异性。出现假阳性的原因可能与包被的抗原有关。     

SARS冠状病毒N蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用

目的 应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达SARS—CoV N基因,产生无感染性的核蛋白,作为诊断抗原,用于检测血清中SAILS特异性抗体。方法 从一例输入性SARS病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SAILS—CoV N基因,将它插入昆虫杆状病毒,构建重组昆虫杆状病毒,转染sf 9昆虫细胞,经丙酮固定,制成SARS特异性诊断抗原,建立检测病人血清抗SARS-CoV抗体的免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)。结果 此抗原仅与SARS阳性病人血清起反应,而与正常人及其他发热病人血清不起反应。经双盲试验,与空斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)阳性的2003年SAILS病人血清的符合率为97．8％;检测2004年广东新发4例SAILS病人进展期血清均阳性,发病后第6天即可检出抗体1：40阳性,至第9天,升至1：640.结论 此法用于检测病人血清中SARS抗体,具有特异性强、敏感性高,试剂制备简单、安全,不需P3实验室,为诊断与研究SAILS提供新的途径和手段。     

1起老年精神病区诺如病毒感染暴发的调查

目的:对广东省某精神专科医院老年精神三科暴发的一起诺如病毒急性胃肠炎医院感染进行调查。方法:采用现场流行病学方法进行调查,使用RT-PCR检测诺如病毒。结果:2011年6月17日～6月22日共发生10例诺如病毒胃肠炎,全部为住院患者;该病区14.4%的患者被感染;对收集到的10份大便标本进行诺如病毒检测,其中6份结果阳性;通过隔离治疗患者等综合措施,疫情得到控制。结论:此次急性胃肠炎医院感染暴发是由诺如病毒引起的,暴发于调查处理后1个最长潜伏期(3天)内得到控制。     

SARS冠状病毒M基因在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性初步研究

【目的】在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒包膜(M)蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,并对其进行血清学鉴定。【方法】克隆编码SARS冠状病毒M蛋白的基因,并在原核系统中表达GST-M融合蛋白,用Westernblot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析GST-M融合蛋白。【结果】10份SARS患者恢复期血清均能识别M-GST融合蛋白,并在Mr=52000附近出现特异性结合带;而10份正常人血清不与M-GST融合蛋白起反应。【结论】本研究获得了SARS冠状病毒GST-M融合蛋白,它可与SARS患者的恢复期血清产生特异性的结合反应,为研究SARS冠状病毒感染宿主细胞的过程和制备重组疫苗提供了条件。     

严重急性呼吸综合征病毒基因检测和特异性抗体检测的诊断意义分析

目的探讨严重急性呼吸综合征病毒基因检测和特异性抗体检测的诊断意义和价值。方法采用巢式反转录PCR和ELISA法分别检测健康人、普通发热患者、SARS密切接触医务人员及不同时期SARS患者痰标本中SARS病毒核酸和血清标本中特异性抗体IgG和IgM。结果SARS患者住院1～58d期间,采用巢式RT-PCR检测痰SARS病毒基因,52例患者中33例阳性,阳性率63.5%;而采用间接ELISA检测血清抗SARS病毒抗体,52例患者中30例阳性,阳性率为57.7%。2种方法均阳性的有15例,均阴性的有6例。2种病原学诊断方法检测20例正常人、15例发热非SARS患者和20例SARS密切接触医务人员,结果均为阴性。住院1～13d组(92.9%)巢式RT-PCR基因阳性率明显高于ELISA特异性抗体阳性率(7.1%);住院37～58d组巢式RT-PCR基因阳性率(47.4%)则明显低于ELISA特异性抗体阳性率(94.7%)(P<0.01)。结论痰中SARS病毒基因检测可用于SARS的早期诊断,这对于提前确诊和治疗SARS患者,尽早排除疑似病例具有非常关键和现实的意义。血清特异性抗体检测可用于流行病学调查,但对SARS早期诊断和鉴别没有意义。