3种重要虫媒病毒的RT-PCR检测

目的：建立快速、敏感、特异的虫媒病毒RT-PCR检测方法。方法：采用改进的核酸制备方法，分别从感染的乳鼠脑和细胞培养上清液中提取病毒RNA，再用RT-PCR和套式PCR方法进行检测。结果：通过对肌PCR反应条件的优化，用3种虫媒病毒的特异引物均可从不同稀释度的感染小鼠脑和细胞上清中提取的病毒RNA扩增出特异的目的基因片段。甲病毒属的东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒之间，及与黄病毒属的黄热病毒均无交叉反应，表明建立的RT-PCR检测方法特异性强。套式PCR与肝PCR比较可提高检测敏感性10～10000倍。结论：建立的肝PCR和套式：PCR法可用于3种虫媒病毒的快速检测。     

含5种烈性出血热病毒的假病毒阳性参考品的制备

目的：利用慢病毒载体系统制备含有马尔堡病毒（Marburg virus）、扎伊尔型埃博拉病毒（Zaire Ebola virus）、苏丹型埃博拉病毒（Sudan Ebola virus）、拉沙热病毒（Lassa fever virus）和黄热病毒（Yellow fever virus）5种烈性病毒核酸片段的假病毒,为其核酸检测提供一种通用的阳性参考品。方法体外合成该5种病毒的目的基因片段,通过融合 PCR 技术将5个片段连接成一条基因,然后克隆到慢病毒表达载体上,并与其辅助载体共转染293T细胞;转染后分别于48、72 h 收集培养上清,用 DNase 和 RNase 进行消化处理及纯化浓缩,最后提取核酸,利用普通PCR 和实时荧光定量 PCR 鉴定假病毒是否包装成功。结果测序结果表明,体外合成的该5种病毒的目的基因片段已正确连接并插入慢病毒载体中;载体转染293T 细胞后收集上清中的假病毒,提取核酸经上述两种 PCR 鉴定均可特异性检测到靶基因,表明已成功包装出含该5种出血热病毒靶基因的假病毒颗粒。结论该研究获得的假病毒颗粒可作为上述5种出血热相关烈性病毒核酸检测的通用阳性参考品。     

乳腺癌患者人乳头状瘤病毒检测的临床价值研究

目的：探讨女性乳腺癌患者人乳头状瘤病毒（HPV16、HPV18）检测的临床价值。方法：选择我国西北地区经病理检查确诊的乳腺癌80例为观察组,乳腺良性疾病80例为对照组,采用实时荧光定量PCR技术（FQ-PCR）及透射电镜技术检测两组病例组织中HPV16、HPV18感染情况。结果：采用FQ-PCR及透射电镜技术两组病变组织中均未检测出HPV16、HPV18。结论：在我国西北地区,HPV16、HPV18与女性乳腺癌的发生、发展并无直接确切的关系。     

13种虫媒病毒基因芯片检测方法的建立

目的 建立能对虫媒病毒进行属水平筛查及种水平鉴定的基因芯片技术,为虫媒病毒提供一种高通量的检测与鉴定技术.方法 从GenBank获得13种虫媒病毒的全部基因组序列,利用Clustal X和BLAST等比对软件,设计针对这些虫媒病毒所在的3个属的通用寡核苷酸探针,用于病毒的属水平筛查.然后设计针对每种病毒的特异性寡核苷酸探针,用于每种病毒的检测鉴定.寡核苷酸探针长度均为70mer,将设计好的探针与GenBank上所有病毒基因组序列进行比对,验证其种属特异性,然后进行探针合成和基因芯片制备.所有病毒在BSL-3和BSL-2实验室进行培养,待检病毒核酸通过锚定随机PCR进行扩增,经荧光染料标记后与基因芯片杂交,利用激光共聚焦扫描仪扫描后进行结果分析.结果 所检测的13种虫媒病毒均可获得种特异性及所在属的属特异性杂交信号,非特异性杂交信号不明显.分别用两种不同的病毒混合后,进行模拟混合病毒感染,也得到了相应的特异杂交信号.结论 初步建立了13种虫媒病毒的基因芯片检测技术,可用于这些病毒的属水平筛查及种水平鉴定,并且可以进行混合感染标本的检测,为虫媒病毒的检测与鉴定提供了一种新的手段.     

IL-2促进大鼠子宫平滑肌细胞增殖及IL-2R的表达

目的：研究白细胞介素-2(IL-2)对大鼠子宫平滑肌细胞增殖的影响，并探讨其可能的机制。方法：以培养的大鼠子宫平滑肌细胞进行了以下实验：以MTT比色法，测定IL-2对该细胞增殖的剂量效应；用流式细胞技术，观察IL-2对该细胞细胞周期各阶段DNA含量的影响；用激光共聚焦显微镜技术，检测IL-2对该细胞内Ca^2 水平的影响；用RT-PCR技术，检测IL-2R在该细胞的表达。结果：IL-2(10～1000U／ml)可显著促进大鼠子宫平滑肌细胞的增殖。用流式细胞技术检测细胞中DNA的含量发现，IL-2(100 U／ml)可提高该细胞由G1期进入S期的比例。激光共聚焦法检测到IL-2(100U／ml)可升高细胞内的Ca^2 浓度。RT-PCR技术检测到细胞表达IL-2R a mRNA、IL-2RβmRNA和lL-2R γmRNA三条链。结果：IL-2参与了对大鼠子宫平滑肌细胞增殖的调节，其促进增殖作用可能与该细胞周期DNA含量的变化、Ca^2 浓度的改变和IL-2R的表达有关。     

DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

目的：构建DEK基因的RNA干扰（ RNAi）慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经BamHⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA（ siRNA）表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素（ puromycin,puro）筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应（ real time-PCR,RT-PCR）和Western印迹分别检验DEK在信使RNA （ mRNA ）和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。 RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明, DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。     

应用一步和套式PCR法检测SARS患者标本中的SARS病毒核酸序列

目的：建立敏感、特异和快速的针对SARS病毒的RT-PCR方法，为SARS的早期诊断及防治提供依据。方法：采用一步和套式PCR法对SARS患者不同标本中的SARS病毒RNA进行扩增及序列测定。结果与结论：应用外引物和内引物可分别扩增出约380bp和150bp的单一条带，其大小与预期的相一致。应用套式PCR可使检测敏感性从l0-6提高到lO-15。采用这种方法从SARS患者粪便、痰、鼻咽拭子和血液标本中均可扩增出与预期大小一致的条带，且测序结果显示该扩增片段为SARS病毒的特异序列，表明本研究建立的RT-PCR方法敏感、特异，可用于SARS的快速检测.．     

与HIV-1共感染的HHV-6毒株的分离、传代培养与鉴定

目的：对一株从中国河南省一名艾滋病患者体内分离的、可在MT4细胞上稳定传代的未知病毒29A进行鉴定，确定该病毒种类及型别。方法：用从该患者外周血单核细胞中分离的病毒株感染MT4细胞，获得可在该细胞上稳定传代的病毒株29A。通过细胞病变特征、电镜观察结果、HIV-1 p24抗原检测以及HIV-1 pol区基因扩增结果，对该毒株是否为HIV-1进行鉴别。在电镜下对病毒感染细胞的超薄切片进行观察，发现该病毒呈现疱疹病毒形态特征，因此设计人类疱疹病毒6型（HHV-6）U69、U16／U17、U60／U66三个不同基因片段的特异性引物并进行巢式PCR扩增，对扩增产物进行序列测定和结果分析。结果：该毒株HIV-1 p24抗原检测为阴性；用HIV-1 pol区特异性引物未扩增出目的片段；细胞病变形态不同于HIV-1引起的病变；电镜观察该病毒直径为160～200nm，明显大于HIV—1，表明该传代株不是HIV-1。用人类疱疹病毒6型（HHV-6）U69、U16／U17、U60／U66等基因的特异性引物均扩增出了目的片段，序列分析的结果表明该毒株为HHV-6病毒B亚型。结论：在国内首次从艾滋病患者的外周血淋巴细胞中分离出HHV-6，为进一步研究HHV-6和HIV-1的相互作用奠定了基础。     

6种核酸提取试剂盒对甲型H1N1流感病毒核酸提取效果的比较

目的研究5种国产病毒RNA提取试剂盒对甲型H1N1流感病毒检测的相对效率、耗时和成本,为各级实验室甲型H1N1流感病毒核酸提取检测提供技术参考。方法对滴度为105pfu/ml的甲型H1N1流感病毒参考株悬液作10-1~10-4系列稀释,采用德国Qiagen公司的QIAamp Viral RNAMini Kits和5种国产试剂盒对上述样本进行核酸提取,用复合探针实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对其提取效率进行平行检测,分析5种国产试剂盒与QIAamp Viral RNA Mini Kits提取效率的差异,同时对试剂盒提取时间及价格进行比较。结果对不同稀释度流感病毒样本的提取检测,各试剂盒存在显著差异,均以QIAamp Viral RNA Mini Kits提取效率最高。综合提取效率、耗时及成本等因素考虑,B试剂盒性价比最高。结论不同核酸提取试剂盒对病毒核酸的提取,可影响RT-PCR的检测效果,各实验室应根据自身条件及试验目的,合理选择性价比较高的试剂盒对临床样本进行核酸提取。     

再次从SARS患者肺组织中分离与检出呼肠病毒

我们已报道从北京市第 1例SARS患者及其母亲的咽拭子中分离、检出呼肠病毒[1 ] 。在透射电镜下 ,发现感染细胞胞浆内有典型的晶格状排列的病毒颗粒和病毒包涵体。血清学、RT_PCR和核酸序列分析证实是一种独特的呼肠病毒 (呼肠病毒科正呼肠病毒属 )。初步动物实验显示该病毒可导致小鼠非典型肺炎的发生和死亡。最近 ,我们又从北京市佑安医院 1例SARS患者 (2 0 0 3年 6月 7日死亡 )病理尸检的肺组织标本中分离、检出呼肠病毒。透射电镜观察可查见在感染细胞核周胞质内有大小不等、无定形的病毒包涵体。包涵体由中等致密的细丝状病毒浆 (…     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导HeLa细胞p21WAF1/CIP1表达的分子机制研究

目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDIs）诱导肿瘤细胞产生周期阻滞以及诱导p21^WAF1／CIP1表达的分子机制。方法：以人宫颈癌HeLa细胞为模型，用曲古抑茵素A（TSA）处理HeLa细胞，通过流式细胞术检测细胞周期及凋亡，通过Western印迹及RT-PCR检测周期相关分子的蛋白及mRNA的表达；并构建TSA靶分子启动子区的荧光素酶报告质粒，进一步检测TSA的主要作用位点，寻找相关作用途径。结果与结论：TSA可诱导HeLa细胞发生周期阻滞，并呈现明显的剂量和时间依赖关系，加大用药剂量及延长用药时间可诱导凋亡。TSA可显著诱导p21^WAF1／CIP1的表达，表现为转录水平的调节，其变化可以指示周期阻滞的程度。p21^WAF1／CIP1启动子区3′端是TSA作用的主要位点，同样被TSA诱导表达增加的p53很可能通过与其效应元件的结合而使TSA诱导p21^WAF1／CIP1表达的总效果增强。     

利用荧光极化技术在均相系统内建立基于Bcl-2/Bak作用模式的高通量药物筛选体系

目的：利用荧光极化原理，在液相系统内建立基于Bcl-2／Bak相互作用模式的高通量药物筛选体系。方法：在液相系统内建立Bd-2蛋白和多肽的相互作用体系，用光度计检测荧光极化值，分析荧光极化值随蛋白或多肽浓度变化而改变的趋势。结果：对应于Bak蛋白BH3结构域的5FAM标记肽（LP）可与Bcl-2蛋白相互作用，建立了二者相互作用的饱和曲线；非标记竞争性短肽（CP）和LP竞争性地与Bcl-2蛋白结合，而无关肽（NP）则不与Bcl-2相互作用；基于Bcl-2结构筛选到的小分子化合物SC对体系内LP荧光极化值的影响模式与CP相同。结论：在均相系统内初步建立了基于抑制Bcl-2活性进而促进细胞凋亡的药物高通量筛选方法，为实现药物的高通量筛选奠定了基础。     

多效生长因子基因沉默抑制PTEN基因敲除细胞的增殖

目的：在肿瘤抑制基因PTEN缺失的小鼠胚胎成纤维细胞Pten-/-MEF241细胞中,研究多效生长因子（pleiotrophin,Ptn）对细胞增殖的影响.方法：设计并合成可编码针对小鼠Ptn基因的小干扰RNA （siRNA）寡核苷酸,构建至pSilencerTM3.1-H1载体,将载体转染进Pten^-/-MEF241细胞中,获得稳定表达细胞克隆株,通过Northern印迹检测Ptn基因表达被抑制的情况,根据细胞生长曲线检测沉默Ptn基因对Pten^-/-MEF241细胞生长的影响.结果：获得的稳定克隆株中,与对照细胞相比,Ptn基因的表达在转染Ptn siRNA-B的3株细胞中均得到了有效的抑制,而在转染Ptn siRNA-C的2株细胞中抑制效果较差.生长曲线结果显示,在Pten^-/-MEF241细胞中,沉默Ptn基因能够减缓Pten^-/-MEF241细胞的生长速度.结论：本研究获得了可有效抑制Ptn基因的小干扰RNA,证明沉默Ptn基因可抑制PTEN 基因缺失细胞的增殖,提示Ptn可作为治疗具有PTEN基因突变的肿瘤的药物靶标.     

Medical examiners and Crimean-Congo hemorrhagic fever contamination risk

Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) is an acute zoonotic infection caused by the CCHF virus. The viruses' activity peaks during April and May with a mortality rate of 3–30%. Transmission of the virus to human occurs through tick bites or exposure to infected animals' tissues or blood. The major at-risk group includes farmers living in endemic areas. Health-care workers are the second most affected group. Virus has shown up in a diverse geographic area which includes Middle East, Asia, Africa and Eastern Europe and is considered one of the most wide-spread tick borne infections. The most recent cases are from Iran and Turkey. This article represents autopsy results of four CCHF infected cases in 2011 and 2012, in Ankara, Turkey.     

1999年福建省暴发不明热病毒病原的分离与鉴定

目的：对１９９９年８月福建省福州市暴发的不明热的病毒病原进行分离与鉴定。方法：首先采用传代蚊细胞的微量培养方法进行病毒分离,并通过脑内接种途径观察对乳小鼠的致病性。然后经间接免疫荧光法和ＲＴ－ＰＣＲ技术对毒株进行型别鉴定。结果：患者恢复期血清标本中存在登革２型病毒特异抗体。从急性期血清标本中分离出１１株病毒,在传代蚊细胞中可产生稳定的细胞病变并驿乳小鼠致病。其基因组为登 革２型病毒特异的ＲＮＡ分子     

豚鼠咽鼓管分泌细胞的电镜观察

目的　进一步研究咽鼓管表面活性物质的分泌来源，为耳气压损伤的预防、治疗提供理论依据。　方法　应用超微细胞化学方法分段观察正常豚鼠咽鼓管的分泌细胞。　结果　可观察到三种分泌细胞，主要分布于咽鼓管咽口的亮颗粒细胞，主要分布于咽鼓管峡部的混合颗粒细胞，及分布于鼓室口和鼓室粘膜的暗颗粒细胞，并在三种细胞中均观察到表面活性物质样板层体。　结论　证实了咽鼓管中表面活性物质样板层体的存在，为深入研究咽鼓管及其表面活性物质的功能作用奠定了基础     

Cytological basis for enhancement of radiation-induced mortality by Friend leukaemia virus infection

PURPOSE: To analyse the cytological basis for enhancement of radiation-induced mortality by Friend leukaemia virus infection. MATERIALS AND METHODS: Cellularity in haematopoietic tissues of C3H mice infected with FLV and/or whole-body irradiation was examined. RESULTS: When mice were treated with a sublethal dose (3 Gy) of irradiation at 1 week after virus infection, most manifested a severe loss of cellularity in the spleen, bone marrow and peripheral blood 2 weeks after irradiation. More than 90% of the mice died within 1 month post-irradiation. However, this deleterious effect of virus infection on the survival of irradiated mice was observed only when they were irradiated at around 1 week after virus inoculation. Strain differences in the sensitivity to this effect were observed among virus-sensitive strains of mice. CONCLUSIONS: The results indicate that Friend leukaemia virus infection can cause enhancement of radiation sensitivity of haematopoietic cells in host animals in a restricted manner in terms of genetic background and the interval between infection and irradiation.     

我国两株森林脑炎病毒的生物学性质及E蛋白基因核苷酸序列的比较

目的：比较我国1953年从患者脑组织分离的森张株和2001年从患者血清中分离的MDJ01株森林脑炎病毒(TBE)的生物学特性及E蛋白基因核苷酸序列的变化，分析TBE病毒E蛋白基因的变化与功能的关系，从分子水平上探讨我国TBE的传播、流行规律及致病机制。方法：两株病毒同时接种乳鼠和，BHK／21细胞，观察两株病毒对乳鼠和BHK／2l细胞的致病性；从两株病毒感染的BHK／2l细胞中提取病毒的RNA，对E蛋白基因进行RT-PCIR扩增，扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接，分别进行克隆测序。结果：森张株对乳鼠和BHK／21的致病性均比MDJ01株明显；两株病毒E蛋白基因长为l488nt，编码496个氨基酸，核苷酸的变异为33个，导致了2个氨基酸的变化，第一个氨基酸的变异发生在113位(MDJ01株由Ⅰ变成Ⅴ)，第二个氨基酸的变异发生在163位(MDJ01由P变成A)，两株病毒核苷酸序列的同源性为97．8％，推测的氨基酸序列的同源性为99．6％。与国外远东株比较，森张株核苷酸序列的同源性稍高于MDJ01株，与欧洲株、西伯利亚株的同源性基本一致。结论：新分离株MDJ01对细胞和乳鼠的致病性稍低于1953年分离的森张株，E蛋白基因的核苷酸序列分析表明两株病毒同属于远东亚型，推测MDJ01株可能是由森张株在自然界长期演变而来。     

西部马脑炎病毒基因组序列的RT-PCR检测

目的 :建立敏感、特异的西部马脑炎 (westernequineencephalitis,WEE)病毒RT_PCR检测方法。方法 :首先采用逆转录法将病毒基因组RNA逆转录为cDNA ,然后以此cDNA为模板 ,进行PCR扩增。并对PCR扩增过程中的模板量、循环数、Mg2 浓度、退火温度和延伸时间等条件进行优化 ,以提高检测的特异性和敏感性。结果 :采用经优化的条件进行PCR扩增获得了约 35 0bp的单一DNA片段 ,其大小与预期的相一致 ,且可自 0 .1TCID50 的病毒液中检测出WEE病毒基因组序列。结论 :所建立的RT_PCR方法可自病毒感染的小鼠脑组织和传代细胞中检测WEE病毒的基因组RNA。