抗人B7（CD80）分子单克隆抗体的制备及鉴定

为了利用抗Ｂ７ｍＡｂ深入研究Ｂ７分子的作用，我们用融合蛋白Ｂ７Ｉｇ免疫小鼠，用细胞ＥＬＩＳＡ及间接膜免疫荧光法进行筛选，得到了两株抗Ｂ７ｍＡｂ３Ａ２和３Ｂ６克隆，其Ｉｇ类别分别属于ＩｇＭ和ＩｇＧ２ａ型。在功能上３Ａ２能明显抑制抗ＣＤ３ｍＡｂ诱导的Ｂ７分子协同刺激的Ｔ细胞增殖     

小鼠B7-1基因转染的黑色素瘤细胞免疫原性探讨

目的 探讨Ｂ７－１分子对肿瘤细胞免疫原性的影响。方法 将小鼠Ｂ７－１基因转染的黑色素瘤细胞（Ｂ１６－ｍＢ７．１）与野 生型及空载体转染细胞（Ｂ１６－ｗｔ和Ｂ１６－ｎｅｏ）的免疫原性在体内外进行了比较。同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养（ＭＴＬＣＳ）后测定淋巴增殖指数和ＣＴＬＳ活性,将Ｂ１６－ｎｅｏｐ和Ｂ１６－ｍＢ７．１细胞接种于小鼠皮下,观察肿瘤生长速度。结果 Ｂ１６ｍＢ７．１在体外刺激淋巴细胞增殖和诱     

协同激活分子CD80（B7—1）在诱导人T细胞活化中的作用

现已证实ＣＤ８０（Ｂ７－１）是参与Ｔ细胞活化的重要分子，应用ＣＤ８０基因转染的人乳腺癌细胞观察了Ｔ细胞增殖的影响，结果表明ＣＤ８０分子在抗ＣＤ３模拟的第一信号下能协同刺激Ｔ细胞活化，ＰＭＡ，Ａ２３１８７能明显增强ＣＤ８０的协同作用，且可促进ＩＬ－２，ＩＦＮ－γ等细胞因子的产生。在第二信号的强度固定后，观察了第一信号的强弱对Ｔ细胞活化的影响，结果显示抗ＣＤ３单抗在１００ｎｇ／ｍｌ时刺激Ｔ细胞增殖最强     

人补体C1—抑制物基因在COS—7细胞中的表达

利用全长人Ｃ１－ＩＮＨ ｃＤＮＡ片段构成建功可在ＣＯＳ－７细胞中瞬间表达重组人Ｃ１－ＩＮＨ的表达质粒ｐＳＶＬＣ１。通过ＤＥＡＥ－Ｅｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ－７细胞，经体外标记、免疫沉淀和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹后发现，转染细胞可分泌一条分子量约１１０ｋＤ的免疫活性蛋白带。     

共刺激分子B7家族

细胞免疫中，需要“双信号”或“多信号”刺激的观点已广为人们接受。近年来发现，Ｂ７家族在细胞免疫的共刺激中起重要作用。本文综述了有关Ｂ７家族的发现命名、结构特点、表达调节及信号转导，并结合研究进展，探讨了其在临床疾病的免疫治疗中的前景。     

B7／CD28和ICAM—1／LFA—1共刺激信号对T及B细胞功？…

目的 研究共刺激途径Ｂ７／ＣＤ２８和ＩＣＡＭ－１／ＬＦＡ－１对Ｔ细胞活化以及Ｂ细胞效应的作用。方法 在体外建立ＡＰＣ：Ｔ：Ｂ细胞反应系统,用Ｂ７－１单抗和ＩＣＡＭ－１单抗分别阻断Ｂ７／ＣＤ２８和ＩＣＡＭ－１／ＬＦＡ－１共刺激途径,利用＾３Ｈ－ＴｄＲ法检测Ｔ细胞增殖,ＥＬＩＳＡ法测定Ｂ细胞分泌的杭体,用ＲＴ－ＰＣＲ法检测细胞因子基因的表达。结果 Ｂ７－１单抗和ＩＣＡＭ－１单坑均可抑制Ｔ细胞增殖及ＩＬ     

人CD81的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 从人外周血淋巴细胞中克隆出CD81基因，构建真核表达质粒，并在COS－7细胞中进行表达。方法 分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，采用RT－PCR扩增CD81基因。将CD81基因克隆至载体pcDNA3.1( )中，进行酶切及测序鉴定。以质粒pcDNA3.1-CD81转染COS－7细胞进行瞬时表达，并用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测蛋白的表达。结果 RT－PCR产物已插入载体pcDNA3.1( )构建成真核表达质粒pcDNA3.1-CD81。经双酶切和测序鉴定表明，克隆出的人CD81全长编码序列同GenBank收录的序列一致，并且真核表达质粒的构建正确。以脂质体转染COS－7细胞后，用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测表明，细胞可表达人CD81。结论 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-CD81，为进一步研究HCV和CD81的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型打下了基础。     

人CD7胞外区基因在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达人白细胞分化抗原CD7胞外区蛋白。方法 采用PCR技术调整CD7基因的阅读框架,使之与生物素化蛋白基因阅读框架一致,缺失了CD7cDNA基因的起始密码子并增加一个大肠杆菌偏性终止密码子,构建CD7胞外区cDNA和生物素化蛋白基因融合的原核表达质粒PinPointxa3-CD7。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α表达,SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果。结果 融合蛋白的分子量约为30000u,Western blotting结果表明,表达的蛋白质可被抗CD7的单克隆抗体识别。结论 为研制抗CD7基因工程抗体奠定了基础。     

人补体C_1－抑制物基因在COS－7细胞中的表达

利用全长人Ｃ１－ＩＮＨｃＤＮＡ片段构建成功可在ＣＯＳ－７细胞中瞬间表达重组人Ｃ１－ＩＮＨ的表达质粒ｐＳＶＬＣ１。通过ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ－７细胞，经体外标记、免疫沉淀和Ｗｅｂｔｅｒｎ印迹后发现，转染细胞可分泌─条分子量约１１０ｋＤ的免疫活性蛋白带。ＥＬＩＳＡ测定其表达水平，在转染后７２ｈ可达２μ／（ｍｌ·１０７细胞）。功能活性测定表明重组Ｃ１－ＩＮＨ具有抑制Ｃ１ｓ酯裂解的作用。     

IL—2,IL—4基因转染后肿瘤细胞表面ICAM—1分子的表达及其作用

为了进一步研究细胞因子基因转染后肿瘤细胞体内致瘤原性、免疫原性变化的分子机制，将ＩＬ－２、ＩＬ－４基因转染入Ｂ１６黑色素瘤细胞，观察了其体内接种后致瘤原性变化，通过ＦＡＣＳ法检测了其细胞表面粘附分子－１（ＩＣＡＭ－１）的表达水平，分析了其细胞表面ＩＣＡＭ－１表达水平以及它们与肿瘤细胞对ＬＡＫ、ＣＴＬ等免疫效应细胞杀伤敏感性变化的关系。结果表明，ＩＬ－２、ＩＬ－４基因转染后Ｂ１６细胞体内致瘤原性明显     

大鼠FEZ1基因的克隆及其在中枢神经系统的表达

轴突成束和延伸蛋白ζ-1(fasciculationandelongationproteinzeta-1,FEZ1),是线虫UNC-76蛋白在哺乳动物中的一种同系物,与轴突向外生长、成束、延伸相关。为了克隆该蛋白的基因并观察其在中枢神经系统(CNS)的表达情况,本研究通过FEZ1的特异引物从SD大鼠脑组织中经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得FEZ1基因;通过RT-PCR法分析FEZ1在生后7d的SD大鼠CNS的不同部位(大脑皮层、嗅球、脊髓)的表达情况。成功获得FEZ1的基因克隆,并观察到生后7d的SD大鼠的大脑皮层、嗅球、脊髓内均有FEZ1表达,且脊髓的表达水平较高。本研究结果为进一步研究大鼠FEZ1基因的生物学活性及在神经系统内的表达和应用奠定了基础。     

三尖杉酯碱对HL60细胞动粒蛋白B基因表达的影响

为了了解三尖杉酯碱对白血病细胞杀伤的分子机制，用间接免疫荧光，免疫印迹，分子杂交和点杂交的方法探讨了ＨＴ的抗急性粒细胞白血病ＨＬ－６０效应和动效 ／着丝粒蛋白这间的关系。     

淋巴瘤细胞与网织红细胞融合——胞质杂交细胞基因产物血红蛋白表达的观察

本实验选用富含有血红蛋白特征面无核的正常小鼠网织红细胞,与小鼠淋巴瘤细胞株融合,对杂交细胞基因产物血红蛋白进行联苯胺组织化学染色、荧光抗体和生化测定。结果与电镜和流式细胞光度计的实验结果一致,表明珠蛋白基因产物血红蛋白住杂交细胞中,能够表达并成为融合细胞的标志。联苯胺阳性细胞数在HAT选择性培液筛选后数量增加。BW×R胞质杂交细肥在传代过程中,仍继续出现血红蛋白。文中对杂交细胞血红蛋白表达及其在传代过程中,在一部分细胞中丢失的可能机理进行了讨论。     

人Nurr1基因克隆及其在真核细胞中的表达

为探讨Nurr1基因治疗Parkinson病的可行性,本研究克隆了中国人核相关受体1(nuclearrelatedreceptor1,Nurr1)基因,并重组携带Nurr1基因的真核表达载体,为该研究提供分子生物学基础。实验采用反转录聚合酶链式反应(RTPCR)方法从人胎儿脑中获取Nurr1cDNA,将其克隆至pGEMTEasy载体中;测序鉴定后,重组携带Nurr1基因的逆转录病毒载体pLNCX2Nurr1;通过脂质体将重组载体转染PT67包装细胞系,用病毒上清感染NIH3T3细胞系以检测病毒滴度。结果发现,RTPCR扩增得到人Nurr1cDNA片段,序列与GenBank登录的序列一致;将Nurr1基因亚克隆至逆转录病毒载体得到插入方向正确的重组载体pLNCX2Nurr1,病毒上清滴度为2×105CFU/ml。结果表明本实验获得人Nurr1基因cDNA序列,检测到Nurr1基因在真核细胞中表达,并得到较高滴度的病毒上清。     

CD34基因克隆和表达

ＣＤ３４分子是高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达于多功能造血干细胞、祖细胞表面，在成熟血细胞表面无ＣＤ３４抗原表达，提示ＣＤ３４分子在早期造血调控方面起着重要的作用。本文采用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从高表达人ＣＤ３４抗原的ＫＧ－１ａ细胞系中成功地克隆出人ＣＤ３４抗原全长ｃＤＮＡ，并将此基因插入克隆“载体ｐＵＣ１８ＨｉｎｃＩＩ酶切位点，构建了重组质粒ｐＵＣ１８－３４。用双酶切ｐＵＣ１８－３４质粒，将分离得到的基因片段插入痘苗病毒载体的ＳｍａⅠ位点，构建了重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－３４。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ＰＪＳＡ１１７５－３４转染已被野生痘苗病毒感染的ＴＫ￣－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人ＣＤ３４抗原全长ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＡＰ检测，表明重组痘苗病毒能特异地表达人ＣＤ３４抗原。人ＣＤ３４抗原ｃＤＮＡ克隆和表达，为进一步研究其结构和功能的关系以及研究造血调控机理奠定了基础。     

构建7q32区域鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞部分基因的表达图谱

目的构建７ｑ３２区域鼻咽癌细胞和组织及原代培养人正常鼻咽上皮细胞的部分基因表达图谱。方法通过差异ＲＴ－ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交的方法检测定位于７ｑ３２区域的２０个ＥＳＴ在鼻咽癌细胞和鼻咽癌组织及原代培养人正常鼻咽上皮细胞ｍＲＮＡ的表达水平。结果８个ＥＳＴ在鼻咽癌细胞ＨＮＥ１和原代培养人正常鼻咽上皮细胞中表达量较一致，７个ＥＳＴ在两种细胞中均无表达，３个ＥＳＴ（Ｗ７２６８８、Ｈ１９８３０、ＡＡ１３０６３０）在鼻咽癌细胞株中表达上调，而２个ＥＳＴ（ＡＡ０７０４３７、Ｈ９０８８２）在原代培养人鼻咽上皮细胞中表达上调。在１３例鼻咽癌活检组织中３０．７％（４／１３）的ＡＡ０７０４３７表达下调，７７％（１０／１３）的Ｗ７２６８８和７７％（１０／１３）的Ｈ１９８３０表达上升。结论构建了７ｑ３２区域鼻咽癌细胞和组织及原代培养人正常鼻咽上皮细胞部分基因表达图谱，并初步认为Ａ０７０４３７的表达下调和Ｗ７２６８８、Ｈ１９８３０的过表达与鼻咽癌的发生有关。     

小鼠白细胞介素18的基因克隆及其融合蛋白的表达

白细胞介素１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １８，ＩＬ－１８）是一种能诱导ＩＦＮ－γ产生的新型细胞因子，在调节Ｔｈ１型细胞免疫应答中起重要作用。采用逆转录ＰＣＲ从活化的小鼠腹腔巨噬细胞中获得了小鼠ＩＬ－１８（ｍＩＬ－１８）ｃＤＮＡ，测序鉴定正确的片段经ＥｃｏＲＩ酶切后克隆入ＧＳＴ融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，再转化至大肠杆菌ＤＨ５ａ高效表达，经纯化获得了有活性的ｍＩＬ－１８融合蛋白。     

恶性疟原虫丝氨酸重复抗原部分基因的克隆及其表达

采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫云南株(PFD-3/YN)丝氨酸重复抗原基因片段,经基因序列测定后克隆于pWR450-1融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌TG1。在不同菌体浓度及不同剂量IPTG诱导下检测SERA融合蛋白的表达。采用dot-ELISA及Western-blot分析对表达产物进行鉴定,结果显示SERA基因与pWR450-1重组后在大肠杆菌TG1中表达一72kDa的融合蛋白,当工程菌OD590值为0.8～1.2时,加入终浓度1mmol/LIPTG进行诱导,表达量较高。dot-ELISA和Westernblot分析表明SERA基因表达产物能被抗SERA单克隆抗体所识别。