应用焦磷酸测序法检测进展期结直肠癌中K-ras基因点突变

目的建立基于焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)的结直肠癌K-ras基因点突变的检测方法,并应用于进展期结直肠癌及其转移灶中K-ras基因突变的检测。方法提取116例Ⅳ期结直肠癌及11例转移灶中的DNA,进行PCR扩增后应用Pyrosequencing法检测K-ras基因12及13密码子点突变。结果 116例Ⅳ期结直肠癌中有29例检出K-ras基因点突变,突变率为25.0%,在所有29例突变病例中12密码子点突变率为82.8%(24/29),13密码子点突变率为17.2%(5/29),所有11例转移灶的K-ras基因均与其原发病灶相一致。结论 Pyrosequencing能准确、快速、高通量地进行K-ras基因点突变测定,适合大规模临床标本检测,有利于指导结直肠癌尤其是转移性病变的个体化治疗。     

焦磷酸测序法检测结直肠癌患者K-ras基因外显子2第12和13密码子点突变

目的 探讨焦磷酸测序法检测结直肠癌患者肿瘤组织K-ras基因外显子2第12和13密码子点突变方法的临床应用价值.方法 以已知K-ras基因突变的结直肠癌细胞株SW480、DLD-1和野生型细胞株HT-29 DNA作为测序模板检验焦磷酸测序法的准确性.对含不同比例(2％、3％、5％、10％、20％、30％和50％)结直肠癌细胞株K-ras基因的DNA混合样本采用焦磷酸测序法进行基因突变率检测,并与Sanger测序结果平行进行Fisher精确检验比较,评价其灵敏度.同时用焦磷酸测序法检测分析30份临床结直肠癌患者石蜡包埋组织中K-ras基因第12和13密码子突变.结果 当混合已知突变类型的结直肠癌细胞株K-ras基因的DNA样本突变DNA比例在5％和10％浓度时,Sanger测序法检出K-ras基因突变率分别为33.3％ (4/12)和58.3％ (7/12),焦磷酸测序法分别为91.7％(11/12)和100％( 12/12),且2种方法检出K-ras基因突变率的差异有统计学意义(P＜0.05).此外,用焦磷酸测序法从30例结直肠癌患者石蜡包埋组织标本中检出K-ras基因外显子2第12和13密码子突变10例,均为杂合型突变,突变率为33.3％ (10/30).最常见的突变类型为G＞A转换[50％(5/1O)]和G＞T颠换[(30％(3/10)].结论 焦磷酸测序法检测结直肠癌K-ras基因外显子2第12和13密码子突变具有敏感、准确的优点,可用于临床个体化治疗中肿瘤基因突变检测.     

高通量乙型肝炎病毒YMDD突变区焦磷酸测序方法的建立及其可靠性研究

目的 建立基于焦磷酸测序技术的高通量的乙型肝炎病毒YMDD突变临床检测方法。方法 应用专用的YMDD突变区域的扩增引物，经PCR扩增及磁珠分离，制备YMDD区焦磷酸测序单链模板，并在PSQ96A焦磷酸测序仪上进行焦磷酸测序，应用标准的YMDD区突变质粒作为阳性对照模板和标准品，观察批量分析的可靠性并初步批量检定90例临床血清标本。结果 建立了基于焦磷酸测序技术的YMDD突变检测平台，实现了临床血清标本的高通量检测。能一次获得90人份的YMDD突变临床检测结果。经标准的YMDD突变质粒及血清标本的重复性及可靠性检测，质粒标准品的突变检出率及重复率均达100％，而血清标本达98．8％。结论 本方法可准确．高通量、快速检测YMDD区突变，特别适宜临床批量检测需要。     

PCR-焦磷酸测序法快速检测和鉴定临床常见致病菌的研究

焦磷酸测序（Pyrosequecing）技术为近年新一代短片段DNA序列分析技术。国外主要用于分子流行病学的单个核苷酸多态性位点大容量快速检测和临床微生物菌种鉴定与分型，但国内尚未开展。本研究刚该技术对针对不同细菌的独特分子标志，设计基于PCR技术的快速菌种鉴定方法，以提供从分子水平快速鉴定菌种的新的可靠方法。     

K-ras突变多肽诱导胰腺癌免疫治疗的实验研究

【目的】研究以K ras为靶点体外诱导胰腺癌被动免疫治疗的可行性,为临床进行胰腺癌个体化治疗提供实验依据。【方法】利用RT PCR法克隆K ras基因,通过测序检测K ras癌基因突变类型。合成含突变位点的多肽,负载外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC),检测其表达率,对T细胞进行激发活化,观察肿瘤特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。【结果】Patu8988 胰腺癌株12 位密码子点突变为GGT→GTT,12位氨基酸突变为缬氨酸。合成突变多肽能有效地在树突状细胞表达突变位点,激发的肿瘤特异性T细胞(CTL)能有效地杀伤相应的肿瘤细胞。【结论】突变多肽能有效地诱导针对含K ras突变胰腺癌的免疫治疗。     

焦磷酸测序法检测HBV前C区/基本核心启动子突变的临床应用

目的 建立一种新的基于焦磷酸测序技术的HBV前C区/基本核心启动子(pre-C/BCP)突变的检测方法,并验证该方法的准确性、重复性、可靠性及进行初步临床检测.方法 通过对基因库中100个HBV基因序列的比对分析,设计出专用的pre-C/BCP焦磷酸测序的PCR扩增引物及测序引物,并以标准质粒作为标准品建立其相应的检测方法.通过对标准质粒及PCR扩增产物、经Sanger测序的HBV血清及基因芯片检测结果分析,以验证本检测方法检测的标本的特异度及本方法的检测可靠性.最后对60例HBV临床血清标本进行了初步的检测.结果 本研究成功地建立了pre-C/BCP突变热点的焦磷酸测序方法.其检测结果与pre-C/BCP质粒,Sanger测序法的检测结果符合率达100%(Kappa=1.0),基因芯片检测结果的诊断符合率为91.7%.同一批血清标本的重复率达97.8%,阳性PCR产物测序的重复率100%.充分证明了本方法的准确性、重复性、可靠性.初步批量化检测60份临床标本结果表明,本方法能一次批量检出包括pre-C/BCP的单一、多位点的突变,并发现了一例少见的BCP T1758C突变.结论 本实验所建立的pre-C/BCP突变热点的焦磷酸测序方法是一种可一次性检测HBV pre-C/BCP多位点突变的高通量的检测方法.     

焦磷酸测序技术及其应用进展

焦磷酸测序技术是一种新的依靠生物发光进行DNA序列分析的技术。在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针,也无需进行电泳,具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。在遗传多态性分析、重要微生物的鉴定与分型研究、克隆检测和等位基因频率分析等方面具有广泛的应用。     

焦磷酸测序技术及其应用进展

焦磷酸测序技术是一种新的依靠生物发光进行DNA序列分析的技术.在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列的目的.此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针,也无需进行电泳,具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点.在遗传多态性分析、重要微生物的鉴定与分型研究、克隆检测和等位基因频率分析等方面具有广泛的应用.     

焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

目的利用焦磷酸测序技术，建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法。方法应用生物素标记的引物扩增rpoB基因片段，经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板，设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测rpoB基因耐药突变区的81bp序列突变情况，与H。Rv序列比对后判断耐药结果。结果通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌rpoB基因突变检测平台，32株利福平耐药株均在rpoB基因片段上检测到突变，22株利福平敏感株未检测到突变，检测结果与直接测序符合率达100％。结论本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。     

EGFR19基因体细胞突变焦磷酸测序法室内质量控制的建立

目的试建立适用于表皮生长因子受体基因(EGFR19)体细胞突变焦磷酸测序法日常检测的室内质量控制体系。方法选择EGFR19E746_A750del(1)突变为10%的样本作为外部质控品,前20次的检测数据采用即刻法控制其检测质量,建立EGFR19基因体细胞突变焦磷酸测序的L-J质控图。结果该质控品前20次的SI上限和SI下限均在n2s内,用L-J质控图计算在即刻法质控的基础上获得的前20次外部质控品9C/14G的突变比例,其均值(x珋)为11.78%,标准差(s)为1.70%,变异系数(CV)为14.46%。结论用EGFR19质控品绘制L-J质控图,可对实验误差进行控制。     

检测胰液中K-ras基因突变对胰腺癌诊断的作用

目的:检测经逆行胰胆管造影(ERCP)过程中所获胰液中的K-ras基因突变.探讨其在胰腺癌诊断中的作用和意义.方法:收集ERCP过程中注射促胰泌素后的胰液,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法检测胰腺良、恶性疾病胰液上清和细胞中的K-ras基因突变.结果:胰腺癌病例的胰液上清液中K-ras基因突变检出率为60.0%(18/30),细胞中的检出率为76.7%(23/30).胰腺良性疾病胰液细胞中有15.4%(2/13)的K-ras基因突变,上清液和其他非胰腺疾病对照组胰液中无K-ras基因突变检出.胰腺癌患者的胰液中检测到K-ras基因突变明显高于胰腺良性疾病患者和对照组(P＜0.001).K-ras基因突变检出率与肿瘤的部位及大小无明显关系.结论:胰液K-ras基因突变检出对于胰腺癌的诊断具有一定作用.     

耐异烟肼结核杆菌KatG463condon点突变的分子信标快速检测

目的应用分子信标探针检测结核杆菌耐异烟肼kat G463condon点突变,并与测序结果比较以验证该检测方法。方法运用软件对Beacondesigner设计,katG基因包含463condon的分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法;对扩增产物测序并作比较。结果通过CDC相机观测到结核标准株及耐异烟肼PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;16株耐异烟肼组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐异烟肼组463condon突变检出率为37％,分子信标检测方法与测序法符合率达93％。结论分子信标技术是一种具有高灵敏核酸点突变检测技术;分子信标芯片检测方法与测序法符合率较好。     

耐异烟肼结核杆菌Kat G463condon点突变的分子信标快速检测

目的应用分子信标探针检测结核杆菌耐异烟肼kat G463condon点突变,并与测序结果比较以验证该检测方法。方法运用软件对Beacondesigner设计,katG基因包含463condon的分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法;对扩增产物测序并作比较。结果通过CDC相机观测到结核标准株及耐异烟肼PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;16株耐异烟肼组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐异烟肼组463condon突变检出率为37％,分子信标检测方法与测序法符合率达93％。结论分子信标技术是一种具有高灵敏核酸点突变检测技术;分子信标芯片检测方法与测序法符合率较好。     

高分辨熔解曲线检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的临床价值

目的 研究用HRM分析技术检测经典型PKU患者PAH基因突变的临床应用价值。方法采用HRM分析技术对17例经典型PKU患者PAH基因的13个外显子及外显子-内含子交界区域进行检测,并采用DNA测序验证HRM检测结果。同时评价HRM诊断PKU的敏感度和特异度。另外,对其中2个家系的风险胎儿进行产前诊断。结果采用HRM分析技术从17例经典型PKU患者中检出有2个致病突变的患者16例,检出有3个致病突变患者l例。同时检出194V(c.280A＞G)、IVS4nt-1G＞A(c.442-1G＞A)、R158Q(c.473G＞ A)、Q160X(c.478C＞ T)、W187X(c.561G＞ A)、E6nt-96A＞ G(c.611A＞ G)、G239D(c.716G＞ A)、R241C(c.721C＞ T)、R243Q(c.728G＞ A)、G247R (c.739C-＞ C)、G247V(c.740G＞ T)、R261X(c.781C ＞T)、R261Q(c.782G＞ A)、H264R(c.791A ＞G)、F302 fsX39(c.904delT)、E305K(c.913G＞ A)、G312V(c.935G＞ T)、Y356X(c.1068C＞A)、V399V (c.1197A ＞T)、R408Q(c.1223G＞ A)、T418P(c.1252A ＞C)、A434D(c.1301C＞ A) 22种致病突变;Q232Q(c.696G＞A)、V245V(c.735G＞ A)、L385L(c.1155C＞G)3种沉默突变;1种单核苷酸多态点rs2280615(c.402A＞ C)。其中194V(c.280A＞ G)、Q160X(c.478C＞ T)、H264R(c.791A ＞G)、G312V (c.935G＞T)和E305K(c.913G＞ A)为PAH基因新发现的突变。2例风险胎儿经产前诊断,1例未发现致病突变,1例诊断为携带者。HRM突变筛查经典型PKU的敏感度和特异度均为100％,其检测结果与DNA测序结果完全一致。结论HRM分析技术是一种简单、准确、快速、高通量、低成本的遗传学分析方法,可用于经典型PKU的PAH基因突变筛查,并可用于已知父母突变的经典型PKU家系快速产前诊断。     

炭疽芽孢杆菌特异性基因序列双重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系的建立

目的 以炭疽芽孢杆菌的主基因和致病毒素基因pagA特异性序列为检测标志，建立高敏感、高特异的荧光双重实时TaqMan聚合酶链反应快速检测体系。方法 根据炭疽杆菌主基因组特异性序列（Gs）和特异的毒力岛pagA基因序列（Pag）设计引物及探针，通过构建目的质粒获得标准模板，利用TaqMan标记探针和便携式Smartcycle实时聚合酶链反应检测平台探讨该检测体系的检测敏感性和特异性。结果该体系炭疽芽孢杆菌的检测敏感度为10^2拷贝每反应体系，与其他蜡样杆菌群细菌未出现非特异性扩增，具有较高的特异性。整个反应在1h内完成，适合于实验室或野外环境下炭疽芽孢杆菌的快速检测。结论 本研究建立的双重TaqMan实时聚合酶链反应检测体系可作为炭疽芽孢杆菌快速、准确、特异、敏感的检测手段。     

RT-ARMS-qPCR定量测定线粒体耳聋患者mtDNA A1555G位点突变

目的 探讨RT-ARMS-qPCR(real time amplification refractory mutation system quantitativePCR)系统定量测定线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)A1555G位点突变在线粒体耳聋发病机制研究中的价值.方法 以PeR扩增含mtDNA 1555位点的片段,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上,构建质粒标准品;在引物3'端插入错配碱基AC建立RT-ARMS-qPCR系统,对含突变型和野生型mtDNA 1555位点片段的12例线粒体耳聋患者进行定量检测.结果 RT-ARMS-qPCR系统在检测1个含野生型mtDNA 1555的重组质粒DNA模板时,其批内变异系数(CV)为1.34%,批间CV为1.96%,线性范围为102-108拷贝/ul;突变型或野生型引物只特异扩增相对应的序列,特异性好;突变型/野生型mtDNA拷贝数及突变型所占的百分比与耳聋的严重程度相关(r=0.771,P=0.003),突变型mtDNA所占的比例越高,耳聋程度越严重.结论 RT-ARMS-qPCR系统适合于定量检测mtDNAA1555G点突变的线粒体DNA片段,结果特异、稳定、准确.线粒体耳聋的严重程度与含突变型和野生型mtDNA 1555位点的拷贝数比例有关.