Effect of the gap junction blocker 1-heptanol on chondrogenic differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Objective:To investigate the effect of the gap junction blocker 1-heptanol on the in vitro chondrogenic differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) following induction by GDF-5. Methods:MSCs were isolated from mouse bone marrow and cultured in vitro. After 3 passages cells were induced to undergo chondrogenic differentiation with recombinant human GDF-5(100 ng/ml), with or without 1-heptanol(2.5μmol/L). The effect of 1-heptanol on MSCs proliferation was investigated using the MTT assay...     

不同低氧分压对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的研究体外不同低氧分压对SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖分化的影响。方法将体外培养的MSCs,分组置于常氧(21%)和低氧(2%、4%、6%、8%)培养箱中培养,用MTT法分别于1、3、5、7、9d检测细胞的增殖活性;用酶联免疫检测法分别于1、3、5、7、9d检测细胞碱性磷酸酶(ALP)和Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)的表达。结果不同低氧分压对MSCs细胞增殖活性有明显促进作用(P<0.05);低氧分压抑制MSCs细胞的ALP和COLⅠ表达(P<0.05)。结论低氧微环境可促进MSCs的增殖活性,但对细胞的成骨向分化起到抑制作用。     

Combined Use of RGD-peptide Modified PLGA and TGF-β1 Gene Transfected MSCs to Improve Cell Biobehaviors in vitro

In order to improve the surface properties of PLGA polymer for a better material/cell interface to modulate the cells behaviors, we prepared a novel three-block copolymer, PLGA-[ASP-PEG], and immobilized an RGD-containing peptide, Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys （GRGDSPC） on the surface of it. Transforming growth factor-β1 （TGF-β1） was transfected into bone marrow stromal cells （MSCs） employed as seeded cells. Cell adhesion, spreading, proliferation and differentiation on this material were investigated. The results showed that the cell adhesive ratio on RGD-modified materials was higher than on un-modified materials （P〈0.05）. The extent of cell spreading was also wider on RGD-modified materials than on un-modified materials. Cell proliferation indices of transfected MSCs were increased as compared with the un-transfected MSCs （P〈0.05）. The ALP activities in the MSCs cultured with RGD-modified materials were higher than on un-modified materials after 14 days （P〈0.05）, and those in transfected MSCs were higher than in un-transfected MSCs （P〈0.05）. It was suggested that the combined use of RGD-modification and TGF-β gene transfection could improve the interaction of biomaterial and cells.     

骨髓间充质干细胞体外诱导免疫调节机制的探讨

目的:观察骨髓间充质干细胞(BM MSCs)对体外活化T细胞的免疫调节作用。方法:提取Wistar大鼠BM MSCs及新鲜脾淋巴细胞做共培养。实验分3组,3个时间点:分别为0、24、48 h脾淋巴细胞/BM MSCs+刀豆蛋白A(ConA)(实验组),脾淋巴细胞+ConA(对照组),单纯淋巴细胞组(空白组)。MTT检测T淋巴细胞活性,ELISA检测细胞因子TNF-α、IL-10及TGF-β水平,流式检测Foxp3+调节性T细胞表达率。结果:(1)与对照组相比,实验组24、48 h在2个时间点T淋巴细胞活性均显著降低(P<0.05);(2)与对照组相比,实验组TNF-α在2个时间点有显著降低(P<0.05),实验组IL-10、TGF-β表达水平有显著升高(P<0.05);(3)实验组Foxp3+T调节细胞表达率高于对照组;(4)随着时间延长,空白组及对照组T淋巴细胞活性均显著降低(P<0.05),实验组T淋巴细胞活性随时间延长差异无统计学意义。结论:BM MSCs可以抑制T淋巴细胞活化,并通过减少炎症因子TNF-α的释放抑制免疫应答。另外,BM MSCs可通过自分泌及诱导T调节细胞产生并分泌免疫抑制因子IL-10、TGF-β下调免疫反应,产生免疫耐受。     

人骨髓间充质干细胞向Leydig细胞或产类固醇激素细胞体外诱导分化的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向睾丸Leydig细胞分化,并确定诱导条件。方法将分离培养所获得的第3代MSCs细胞经含黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血小板衍化生长因子(PDGF)及白介素-1α(IL-1α)的诱导液诱导,按诱导液中各因子浓度不同分为A、B、C组和对照组,分别于7d、14d、21d时观察细胞形态变化,并行3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫细胞化学染色和免疫荧光染色,检测各组细胞3β-HSD的表达。以人睾酮ELISA试剂盒检测诱导细胞分泌类固醇的功能情况。结果诱导10～14d后,细胞具有Leydig细胞的形态特点;免疫细胞化学染色及免疫荧光染色显示,本研究条件下,随着诱导液中各因子浓度加大及诱导时间延长,诱导细胞3β-HSD表达阳性数和阳性率逐渐增多,以A组浓度及21d为最佳诱导浓度及时间(P<0.05),并且A组诱导21d分泌睾酮量最高(P<0.05)。结论人骨髓MSCs经体外诱导后可以分化为Leydig细胞或产类固醇细胞。     

电离辐射对胎鼠皮肤间充质干细胞支持骨髓粒系造血作用的影响

目的：观察不同剂量的X射线照射对体外培养的胎鼠皮肤间充质干细胞(MSCs)支持造血细胞增殖作用的影响,为提高造血干细胞体外扩增效率提供一种更为有效的方法,进而为造血干细胞移植提供一个新的途径。 方法：分别用不同剂量的X射线照射培养的胎鼠皮肤MSCs层,然后将骨髓细胞种植于该细胞层上,扩增后不同时间(0~12 d)进行骨髓CFU-GM集落培养,同时取经X射线照射的皮肤MSCs的上清液进行骨髓CFU-GM、CFU-E及BFU-E培养,观察射线对胎鼠皮肤MSCs造血支持作用的影响。 结果：6、8和10 Gy剂量X射线照射胎鼠皮肤MSCs与骨髓细胞共同作用7 d时,骨髓祖细胞集落显著增加,其中6 Gy组增加最为明显,CFU-GM是0 Gy组的2.17倍。6、8和10 Gy剂量X射线照射培养皮肤的上清液体外亦可刺激骨髓CFU-GM、CFU-E、BFU-E的生长,与0 Gy组比较差异均有显著性(P<0.05)。其中6 Gy组增加最为明显,分别达0 Gy组的1.81倍、3.94倍和3.51倍,集落亦明显加大。 结论：一定剂量X射线照射胎鼠皮肤MSCs,其体外支持造血的作用增强,无论照射后的单纯MSCs细胞层还是上清液都可使骨髓细胞集落数增多。     

内皮祖细胞条件培养基对间充质干细胞增殖和成骨分化的影响及其机制

目的:探讨小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)条件培养基(CM) 对同源间充质干细胞(MSCs)增殖和成骨分化功能的影响,并阐明其作用机制。方法:小鼠骨髓细胞经差速贴壁法结合专用培养基分别培养扩增MSCs和EPCs,采用流式细胞术(FCM)检测MSCs和EPCs表面标记物,以成骨、成脂和成软骨诱导分化对MSCs进行功能鉴定,以成血管对EPCs进行功能鉴定。将MSCs分为0% EPCs-CM组(对照组,采用LG-DMEM培养)、50% EPCs-CM组(采用50% EPCs-CM+50% LG-DMEM培养)和100% EPCs-CM 组(采用100% EPCs-CM培养)。采用MTT比色法检测各组MSCs的增殖活性;采用茜素红染色检测各组MSCs的成骨分化能力。结果:FCM法检测,第3代MSCs高表达Sca-1、CD29, 低表达CD45、CD11b;经诱导可向成骨、成软骨和成脂方向分化。第3代EPCs 高表达CD34、CD133和VEGFR2;在铺有基质胶的96孔培养板中可形成血管样结构。与对照组比较,50% EPCs-CM组和100% EPCs-CM组MSCs增殖活性明显增加,且呈浓度依赖性(P<0.05)。茜草色素红染色法检测,培养21 d后50%和100% EPCs-CM组MSCs的钙结节数量和钙盐沉积均高于对照组(P<0.05)。结论:利用差速贴壁法可同时分离MSCs和EPCs,EPCs-CM能促进MSCs 的增殖和成骨分化。     

犬骨髓间充质干细胞体外培养及诱导成软骨特性初步研究

目的：观察月龄、来源部位对犬骨髓MSCs体外增殖能力及成软骨细胞分化能力的影响，对软骨组织工程种子细胞的选择提供参考。方法：体外分离、培养4月龄、12月龄Beagle犬髂骨和胫骨骨髓中的MSCs，向软骨细胞诱导分化。依靠形态学观察、原代集落生成率、MTT法测生长曲线等方法观察各组MSCs的增殖能力，通过GAG含量、Ⅱ型胶原免疫组化比较诱导成软骨细胞效果。结果：4月龄犬髂骨与胫骨来源MSCs体外增殖特性及诱导成软骨细胞特性比较差异无统计学意义；12月龄犬髂骨组MSCs较胫骨组原代融合时间短、集落生成率高、生长曲线左移，但成软骨细胞特性无差异。相同部位比较，4月龄来源MSCs均较12月龄表现出较高的增殖能力和成软骨细胞分化能力，差异具有统计学意义。结论：成年犬不同部位来源MSCs增殖能力不同，分化能力相同；幼龄犬MSCs增殖、分化能力均高于成年犬。     

血管内皮生长因子基因对人骨髓基质细胞增殖及代谢的影响

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)基因对人骨髓基质细胞(hBMSc)增殖、代谢的影响.方法 实验分为3组:①VEGF165和eGFP基因转染hBMSc组;②空腺病毒载体转染hBMSc组;③单纯hBMSc组.培养细胞,进行MTT检测,流式细胞仪分析细胞周期.取各组生长状态良好的第3代细胞,转染后,进行ALP含量检测,骨钙蛋白和层粘连蛋白榆测.结果 各组细胞数量随培养时间的延长都有所增加,各时间点经VEGF165基因转染的hBMSc吸光度值无显著性差异(p>0.05).经转染基因的hBMSc与转染空载体、未转染的hBMSc相比较,DNA合成前期细胞所占百分比无显著性差异,反应增殖活力的增殖指数PrI(包括DNA合成期、DNA合成后期和有丝分裂期)也无显著性差异(P>0.05).经转染的hBMSc碱性磷酸酶、骨钙蛋白和层粘连蛋白合成与转染空载体、未转染的hBMSc相比较有显著性差异(P<0.05),证实经转染的hBMSc碱性磷酸酶、骨钙蛋白和层枯连蛋白合成明显高于其他两组.结论 本实验证实了构建的Ad-VEGF165感染哺乳动物细胞后具有分泌VEGF165的能力,并获得了转VEGF165基因hBMSc.转染VEGF165对hBMSc体外增殖明显影响,同时可以显著提高BMSc分泌ALP,骨钙素(OC)和层粘连蛋白(LN),说明VEGF165对hBMSc体外向成骨细胞分化起到了促进作用.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化及凋亡的研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经细胞诱导分化的潜能,及分化后的凋亡情况?方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用含有表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导培养基对第三代MSCs进行诱导分化,诱导分化的细胞按分化时间3?7?14 d分成A?B?C三组?三组诱导分化细胞分别进行NSE免疫组织化学,MAP2免疫荧光化学以及TUNEL凋亡细胞检测?结果:A?B?C三组细胞在细胞形态上与神经细胞相似,并且表达神经细胞特异性标记抗原NSE?MAP2,但是C组细胞表达强度弱于B组,并且阳性细胞比例少于B组(P < 0.05)?A?B?C三组TUNEL凋亡阳性细胞比例呈逐渐增多趋势(P < 0.05)?结论:含有表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导培养基可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,随着诱导时间的推移,分化细胞状态下降,凋亡比例增多?     

兔骨髓间充质干细胞的筛选与体外培养

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离筛选及扩增的条件 ,同时观察骨髓细胞体外培养的生物学特性。方法 :无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液 (相对密度为 1 .0 77)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,进而贴壁培养 ,获得MSCs。采用常用细胞培养技术和细胞培养的研究方法 ,观察不同贴壁时间、不同种植密度、有无包被成分及不同蛋白包被培养板对MSCs生长增殖的影响。结果 :预先蛋白包被培养板有利于MSCs贴壁。在细胞生长和增殖方面 ,纤粘连蛋白优于明胶和Ⅰ型胶原 ,以贴壁 48～ 72h ,种植密度 (3～ 9)× 1 0 4 /ml为最适条件 ,有利于梭形细胞形态和快速增殖能力的维持 ,保持成体干细胞的多向分化性。结论 :建立了MSCs体外分离和培养的最适条件 ,为进一步研究MSCs的诱导分化和应用提供了保证     

Electromagnetic Field Change the Expression of Osteogenesis Genes in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

In order to identify the differentially expressing gene of bone marrow mesenchymal stem cells （MSCs） stimulated by electromagnetic field （EMF） with osteogenesis microarray analysis, the bone marrow MSCs of SD rats were isolated and cultured in vitro. The third-passage cells were stimulated by EMFs and total RNA was extracted, purified and then used for the synthesis of cDNA and cRNA. The cRNA of stimulated group and the control group was hybridized with the rat oligo osteogenesis microarray respectively. The hybridization signals were acquired by using X-ray film after chemiluminescent detection and the data obtained were analyzed by employing the web-based completely integrated GEArray Expression Analysis Suite. RT-PCR was used to identify the target genes： Bmp1, Bmp7, Egf and Egfr. The results showed that 19 differentially expressing genes were found between the stimulated group and the control group. There were 6 up-regulated genes and 13 down-regulated genes in the stimulated group. Semi-quantitative RT-PCR confirmed that the expressions of Bmpl, Bmp7 mRNA of the stimulated group were up-regulated （P〈0.05） and those of Egf, Egfr were down-regulated （P〈0.05）. It was suggested that the gene expression profiles of osteogenesis of the bone marrow MSCs were changed after EMF treatment. It is concluded that the genes are involved in skeletal development, bone mineral metabolism, cell growth and differentiation, cell adhesion etc.     

感觉、运动神经匀浆对兔成骨细胞增殖与成骨功能的影响

目的 研究兔周同感觉、运动神经匀浆对兔骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞增殖与成骨能力的影响.探讨周围神经影响成骨的可能原因.方法 提取大隐神经、坐骨神经肌支分别作为感觉、运动神经组织,制备匀浆.体外培养兔骨髓间充质干细胞,常规成骨诱导后鉴定备用.以含感觉、运动神经匀浆的诱导培养基、成骨诱导培养基、无地米诱导培养基及对照培养基作用于干细胞来源的成骨细胞,观察其增殖、分化及矿化情况.结果 感觉神经组较其他各组显著促进成骨细胞增殖(P<0.01),成骨诱导组及对照组抑制细胞增殖(P≤0.001);感觉神经匀浆显著促进成骨细胞总蛋白及碱性磷酸酶(ALP)的合成(P<0.05),成骨诱导组及对照组ALP蛋白比活性显著高于运动神经组及无地米组(P<0.05);感觉神经组、成骨诱导组及对照组茜素红结合量显著高于无地米组及运动神经组(P<0.001),前三组之间无显著性差异.结论 感觉神经成分能显著促进成骨细胞的增殖、分化与矿化,运动神经成分未见促成骨作用.     

骨髓间充质干细胞诱导分化表达角蛋白的信号机制

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）分化为表皮样细胞过程中,相关P38、ERK、Rho等信号机制.方法（1）采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离扩增大鼠骨髓MSC,免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测.（2）定向诱导中磷酸化P38和ERK表达：分为正常对照组、单纯诱导组、Rho阻断组;培养1、3、5、7 d后,流式细胞检测磷酸化P38和ERK.（3）SB203580和PD98059对MSC诱导为表皮样细胞的影响：分为对照组、单纯诱导组、p38阻断组（在诱导液基础上加入SB203580）,ERK阻断组（在诱导液基础上加入PD98059）,诱导7 d后分别采用免疫细胞化学和流式细胞仪检测各组细胞细胞角蛋白CK5/8、CK19的阳性表达率.（4）Rho阻断剂HA1077对CK5/8、CK19的影响：设正常对照组、单纯诱导组、RHO阻断组.取培养7 d的细胞,流式细胞检测CK5/8、CK19表达.结果（1）大鼠骨髓MSC在体外扩增后,免疫细胞化学及流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44表达阳性,CD34、CD45表达阴性.（2）磷酸化P38正常对照水平为0.02%.在诱导组1d（0.01%）、3 d（0.01%）变化不大,诱导5 d为0.04%,明显升高,7 d时（0.01%）复接近诱导前水平;磷酸化ERK对照水平为4.23%,诱导后3 d（0.39%）、5 d（0.40%）均呈下降趋势,7 d时（5.10%）恢复至诱导前水平.RHO阻断组：磷酸化P38水平在1、3、5和7 d,分别为1.11%、71.19%、0.25%、6.86%,均升高;ERK磷酸化在1、3、5和7 d,分别为6.17%、4.13%、3.97%和0.41%,其中7 d低于对照水平.（3）SB203580和PD98059对MSC诱导为表皮样细胞的影响：流式细胞显示诱导7 d后CK5/8、CK19阳性率分别为3.01%、6.47%;p38阻断组CK5/8、CK19阳性表达率分别为1.43%、5.41%,低于诱导组.ERK阻断组CK5/8、CK19阳性表达率分别为5.54%、7.56%.（4）HA1077对CK5/8、CK19的影响：单纯诱导组CK5/8阳性率为1.81%,CK19为10.19%;加入HA1077后,CK5/8为21.65%,CK19为39.41%,升高显著.结论P38途径在促进MSC分化为表皮样细胞过程中可能起积极作用,上游信号Rho阻断后可能增加P38途径途径激活,一定程度上促进MSC分化为表皮样细胞.     

成骨生长肽对大鼠骨髓基质细胞增殖分化的影响

目的 研究成骨生长肽(osteogenic growth peptide, OGP)在体外对骨髓基质细胞增殖和成骨向分化的影响.方法 在体外培养的大鼠骨髓基质细胞中加入不同浓度的OGP(10-11～10-7 mol/L),用MTT法检测细胞增殖,酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)的表达,RT-PCR法检测细胞内核心结合因子1(Cbfa1) mRNA的表达.结果 OGP对骨髓基质细胞增殖有促进作用(P《0.05),最大效应浓度为10-9 mol/L;能增加细胞内ALP活性(P《0.05),最大效应浓度为10-8 mol/L;可诱导Cbfa1 mRNA的表达(P《0.05).结论 OGP可促进骨髓基质细胞的增殖,并通过诱导其内Cbfa1 mRNA的表达促进其成骨向的分化.     

人重组骨形成蛋白-7对人牙周膜成纤维细胞增殖及分化能力的影响

目的:研究人重组骨形成蛋白-7（ rhBMP-7）对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)增殖、分化能力的影响,为进一步探讨其促进牙周组织再生奠定细胞学基础。方法：选取因阻生或正畸需要拔除的牙齿,无菌条件下刮取根中1/3的牙周膜组织,采用组织块法培养牙周膜成纤维细胞,经免疫细胞化学鉴定后接种培养板,加入含浓度为50、100、200及400 μ mol·L^-1 rhBMP-7的培养液。分别于培养后1、3及5 d,采用MTT法测定HPDLCs的增殖能力,采用ELISA检测HPDLCs培养液中ALP的活性。结果:原代牙周膜细胞生长缓慢,加入rhBMP-7后细胞生长旺盛,细胞形态为纺锤形或成纤维样,胞浆透明,生长状态良好。随着时间的延长,rhBMP-7在100、200及400 μ mol·L^-1 各浓度时,HPDLCs细胞的增殖率呈逐渐增加的趋势(P<0.01),但各浓度组间比较差异无显著性(P>0.05);
与对照组比较,100、 200及400 μ mol·L^-1 rhBMP-7 各浓度组HPDLCs细胞裂解液和培养液中的ALP活性均增高(P<0.05或P<0.01),其中200 μ mol·L^-1 rhBMP-7 组ALP活性最高。结论: BMP-7可能通过促进HPDLCs细胞的增殖和向骨细胞分化功能而参与牙周组织改建。     

IGF-Ⅰ联合BMP-2促MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞的增殖和分化及钙化效应

目的：探讨重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ（rhIGF—Ⅰ）和重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2）单独或联合应用对MC3T3-E1和NIH 3T3细胞增殖、分化和钙化的影响。方法：单独或联合应用不同浓度rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2作用于小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1和小鼠成纤维细胞株NIH 3T3，采用四唑盐比色法（MTT）和流式细胞技术检测细胞增殖，碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测细胞分化，放射免疫法检测细胞分泌的骨钙素水平（OC），以及Von kossa钙化染色法观察细胞的钙化。结果：1～50ng／ml rhIGF—Ⅰ作用于MC 3T3-E1细胞或5～75ng／ml rhIGF—Ⅰ作用于NIH 3T3细胞后，均能显示明显的促细胞增殖作用（P〈0．01），使S期细胞百分率升高、G1期细胞百分率减少，以及使胞内ALP活性、钙化面积百分比增高（P〈0．05）。10～100ng／ml rhBMP-2也可促进MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞的增殖作用（P〈0．01），使S期细胞百分率升高、G1期细胞百分率减少，并使2种细胞ALP活性、钙化面积百分比升高（P〈0．05）。各浓度rhIGF—Ⅰ或rhBMP-2对MC 3T3-E1及NIH 3T3细胞作用8h、24h和48h的MTT检测结果相似。rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2联合作用后，对2种细胞的促增殖、增强ALP活性、促钙化的作用均较各自单独作用更为明显（P〈0．05）。单独或联合应用不同浓度rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2对细胞分泌的OC水平均无显著性差异（P〉0．05）。结论：rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2具有明显的促进细胞增殖、早期分化及钙化的协同作用，但对成骨末期细胞分化影响不大，而其活性主要与使用剂量有关。     

MSC体外诱导分化为心肌样细胞的鉴定及Nesprin蛋白表达研究

目的 体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向心肌细胞分化并进行相关鉴定,观察分化过程中细胞Nesprin蛋白表达的变化.方法 大鼠MSC经Ficoll密度梯度离心法分离获得后贴壁传代培养,流式细胞术鉴定第2代MSC表面抗原表达.以10μmoL/L 5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导第2代MSC向心肌细胞分化,观察细胞形态学改变;RT-PCR、免疫组织化学法和免疫荧光细胞化学染色鉴定心肌细胞相关蛋白Desmin、α-sarcomeric actin、cardiac Troponin I(cTn I)mRNA和蛋白表达;Western blotting检测MSC分化前后Nesprin蛋白表达.结果 经5-Aza诱导分化后的MSC细胞及细胞核增大,形态渐趋一致,大部分呈长梭形;细胞Desmin、α-sarcomeric actin、cTn I mRNA和蛋白呈阳性表达.免疫荧光细胞化学染色显示Nesprin蛋白定位于核膜,Western blotting分析发现诱导分化后细胞Nesprin蛋白表达明显增加(P<0.05).结论 成功诱导大鼠MSC向心肌细胞分化;Nesprin蛋白在分化后细胞中的表达明显增加,提示Nesprin可能参与MSC向心肌细胞样变化的过程.     

壳聚糖-明胶-果胶仿生网络膜对间充质干细胞增殖和矿化的影响

目的：探讨采用壳聚糖、明胶和果胶制备的仿生网络膜对间充质干细胞（MSCs）增殖和矿化的影响,评价其用于构建组织工程骨的可行性。方法：采用仿生学方法,将壳聚糖、明胶和果胶按照一定比例制作成新型仿生网络膜。实验分为对照组（MSCs+常规培养基）、材料组（MSCs+网络膜+常规培养基）和材料+成骨诱导培养基（OS）组（MSCs+网络膜+OS培养基）。倒置相差显微镜下观察细胞形态表现,扫描电镜（SEM）观察细胞生长及细胞外基质分泌情况,MTT法检测细胞增殖情况（MSCs分为阴性对照组和材料组,分别以空白培养液和含材料的培养液培养）,茜素红染色检测细胞中钙无机物表达情况,实时聚合酶链反应（Real time-PCR）测定细胞中骨钙素（OC） mRNA和骨桥蛋白（OPN） mRNA表达水平。结果：网络膜材料呈半透明薄膜状,倒置相差显微镜下MSCs为短梭形,细胞成簇状聚集生长。SEM下观察,细胞培养第7天可见梭形细胞;培养第14天时细胞数量增多,以伪足状突起锚定于材料表面;培养第21天时,细胞聚集并分泌大量细胞外基质。材料组细胞增殖水平与阴性对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。茜素红染色,网络膜上细胞被染成橘红色。Real time-PCR法,材料组和材料+OS组MSCs中OC mRNA在接种后第7和14天时表达水平较低,第21天时其表达水平明显升高,达到峰值;OPN mRNA在第7天明显表达,第14天时表达水平达峰值,第21天略有下降;与对照组比较,不同时间点材料组和材料+OS组细胞中OC mRNA和OPN mRNA表达水平明显升高（P<0.01）,而材料组与材料+OS组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：壳聚糖-明胶-果胶仿生网络膜具有良好的生物相容性,MSC在其表面可正常生长和增殖,在不加诱导剂的情况下可以诱导MSCs表达矿化相关的基因和蛋白。