Mir-148a 慢病毒表达载体构建及其稳定表达细胞系的筛选

目的：构建人源性 mir-148a 慢病毒过表达载体,并筛选过表达 mir-148a 稳定细胞株 U251、U87、BT325,鉴定 mir-148a 在稳定细胞系中的表达水平。方法：设计并合成 mir-148a 上下游引物,PCR 扩增 mir-148a基因片段,经过酶切后克隆至慢病毒载体上,构建 pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-mir-148a 过表达载体,在293T 细胞中与 pHelper1.0、pHelper2.0包装产生慢病毒,测定 mir-148a 慢病毒滴度。用构建好的慢病毒感染神经胶质瘤细胞系 U251、U87、BT325,用嘌呤霉素筛选,筛选稳定细胞系后 qRT-PCR 检测 mir-148a 的表达情况。结果：测序结果证明 mir-148a 慢病毒载体构建成功并获得了相应的慢病毒。嘌呤霉素筛选后获得稳定表达mir-148a 的 U251、U87、BT325细胞系,mir-148a 表达水平在三种细胞中分别升高167.38倍、7.19倍、11.46倍。结论：成功构建了 mir-148a 的慢病毒载体,筛选得到了 mir-148a 过表达稳定胶质瘤细胞系 U251、U87、B325。     

pGenesi1-1-EGFP-shRNA／survivin真核表达载体构建及其表达验证

目的构建用survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白（EGFP）的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin并验证其在宫颈癌Caski细胞中的表达。方法用有活性的survivin启动子取代pGenesil-1-EGFP-shRNA／U6载体中的u6启动子从而获得新的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP—shRNA／survivin;将pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin转染到宫颈癌Cash细胞及正常人脐静脉内皮HuVEC细胞,观察EGFP在两种细胞中的表达变化。结果成功构建pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin载体,分别转染Caski及HuVEC细咆,在Caski细胞中观察到较少的绿色荧光蛋白表达,而在HuVEC细胞中观察到较多的绿色荧光蛋白表达。结论survivin启动子能驱动shRNA在宫颈癌Caski细胞中特异性表达,而在正常HuVEC细胞中不表达。     

靶向增强绿色荧光蛋白shRNA的真核表达载体构建

目的构建针对增强绿色荧光蛋白（EGFP）的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6。方法设计并合成针对EGFP的shRNA DNA片段,退火后连接到真核表达载体pGenesil-1上,通过测序证实载体构建成功;用脂质体将构建正确的质粒转染到中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中,72 h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果测序证实针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6构建正确;荧光显微镜下观察转染pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6质粒的CHO细胞中,荧光明显减少。结论针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6能明显干扰EGFP的表达。     

双转基因小鼠模型中microRNA-153对RTN4的表达调控

目的 探讨mir-153在阿尔茨海默病发病机制中的作用.方法 通过microRNA芯片及Real-timePCR检测APPswe/PSAE9双转基因小鼠脑内mir-153的表达;构建高表达mir-153的稳转细胞系,通过western-blot检测稳转细胞系内RTN4的蛋白表达;构建野生型及突变型RTN4的3'UTR荧光素酶报告载体,分别将其与mir-153表达载体或microRNA阴性对照载体共转染入293T细胞内,检测海肾荧光素酶的相对活性以验证mir-153对RTN4 mRNA的作用靶点.结果 microRNA芯片及Real-time PCR检测均证实3月龄APP8we/PS△E9双转基因小鼠脑内mir-153的表达较同龄野生对照显著降低;在高表达mir-153的稳转细胞系内RTN4的蛋白水平明显降低;共转染野生型RTN4的3'UTR/mir-153表达载体可使海肾荧光素酶相对活性较共转染野生型RTN4的3'UTR/miRNA阴性对照质粒组显著降低(P＜0.05),而共转染突变型RTN4的3'UTR/mir-153表达载体组则较之无明显差异.结论 在3月龄APPswe/PS△E9双转基因小鼠脑内存在mir-153的异常表达;mir-153可调控RTN4的蛋白表达;mir-153对RTN4的表达调控是通过结合RTN4 3'UTR 839-845碱基处的作用位点而实现的.     

阿尔茨海默病中mir-34a作用机制的探讨

目的探讨mir-34a在阿尔茨海默病发病机制中的作用。方法取3月龄和6月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织,进行microRNA芯片的检测;利用real-time RT-PCR对芯片结果进行验证;采用western blot的方法检测APPswe/PSΔE9小鼠和对照小鼠脑组织中bcl2蛋白的表达情况;通过构建mir-34a稳定转染细胞系和mir-34aknockdown研究mir-34a与bcl2之间的关系;通过构建bcl23’UTR-荧光素酶报告载体,验证bcl23’UTR序列中包含mir-34a的结合位点。结果mir-34a在模型小鼠中表达水平明显升高,并且其表达水平与bcl2蛋白水平呈负相关;通过体外实验,我们发现mir-34a过表达可以明显降低bcl2蛋白水平,反之,当我们抑制mir-34a的表达以后则可以增加bcl2蛋白水平;荧光素酶报告载体实验表明bcl23’UTR序列中包含mir-34a的结合位点。结论bcl2可能是mir-34a重要的功能靶点,mir-34a的过表达可能通过下调bcl2的蛋白水平,从而参与AD的发生。     

干扰HSP70-2的shRNA表达载体的构建及筛选

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白HSP70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对HSP70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。利用质粒转染大鼠精原细胞,用RT-PCR和Western blotting法检测转染后HSP70-2 mRNA和蛋白表达变化。结果:成功构建靶向HSP70-2的3个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-HSP70-21、pGenesil-1-HSP70-22和pGenesil-1-HSP70-23。酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。质粒筛选实验提示pGenesil-1-HSP70-23质粒对精原细胞HSP70-2基因的抑制作用最强,而pGenesil-1-HSP70-21的抑制作用最弱。结论:成功构建表达靶向HSP70-2的shRNA重组质粒载体。     

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定.方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析.构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性.结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2.酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达.结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体.     

糖皮质激素受体αsiRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建糖皮质激素受体α(GRα)小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,并检测其抑制结肠癌细胞株Lovo中糖皮质激素受体α表达的效果.方法 根据基因文库中GRα的cDNA序列,设计并合成两段siRNA,分别插入到pGenesil-1质粒中,并对重组质粒(命名为pGenesil-1/GRα1和pGenesil-1/GRα2)进行测序鉴定.脂质体介导下转染Lovo细胞株,RT-PCR和Western Blot检测转染后GRα的表达.结果 成功构建GRαsiRNA 真核表达载体(pGenesil-1/GRα1和pGenesil-1/GRα2);pGenesil-1/GRα2转染(脂质体法)Lovo细胞后,RT-PCR和Western blot检测细胞内GRα的表达显著降低.结论 GRαsiRNA真核表达载体的成功构建为进一步研究GR在结肠癌化疗中的作用奠定了重要的实验基础.     

21.5kD MBP RNAi有效靶点的筛选及验证

目的:构建21.5 kD MBP基因干扰序列21.5 kD MBP-shRNA(21.5 kD MBP short hairpin RNA interference),筛选最佳沉默效果的21.5 kD MBP-shRNA真核表达载体,为21.5 kD MBP基因功能研究提供实验材料。方法:将21.5 kD MBP-shRNA阳性真核表达载体和阴性真核表达载体经脂质体介导分别转入人神经胶质瘤细胞株U251中,观察转染24 h后的转染效率;提取各组细胞总RNA,用实时荧光定量PCR技术检测各组21.5 kD MBP基因在mRNA水平的表达差异性。结果:21.5kD MBP-shRNA真核表达重组载体被成功转染入U251细胞,与阴性对照质粒(pGenesil-1-MBP-neg)转染组相比,沉默质粒转染组(pGenesil-1-MBP-1、pGenesil-1-MBP-2、pGenesil-1-MBP-3质粒分别转染)细胞中21.5 kD MBP mRNA表过水平均显著下降(P<0.05),其中pGenesil-1-MBP-3转染组细胞中21.5 kD MBP mRNA表达水平最低。结论:成功筛选出最佳沉默效果的21.5 kD MBP-shRNA真核表达载体,为21.5 kD MBP基因功能研究及基因治疗研究奠定了实验基础。     

miRNA-451表达质粒的构建及对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响

目的：探讨miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响。方法：Hsa-miRNA-451序列通过miRBase数据库查找,根据此序列设计出2条寡核苷酸片段,将目的基因经过退火处理后克隆至真核表达载体pGenesil-1.1质粒中,从而构建成为miRNA-451真核表达载体（pGenesil-1.1-miRNA-451 质粒）。将 pGenesil-1.1-miRNA- 451 及pGenesil-1.1-control 质粒分别转染人A549肺癌细胞,经过G418的筛选,建立pGenesil-1.1-miRNA-451及pGenesil-1.1-control 稳定表达的细胞株。流式细胞术分析检测细胞凋亡的情况;Transwell小室检测miRNA-451对细胞侵袭能力的影响;细胞划痕实验检测细胞的迁移情况。结果：经测序证实miRNA-451真核表达质粒构建成功,与未处理的人A549肺癌细胞和稳定表达 pGenesil-1.1-control 的细胞相比,稳定表达了pGenesil-1-miRNA-451的人A549肺癌细胞的侵袭和迁移能力均明显受到抑制影响,而细胞凋亡无明显变化（P >0.05）。结论：miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移具有显著的抑制作用,但对细胞凋亡作用不明显。     

Pokemon基因表达与胃癌耐药性的关系

目的 探讨okemon基因表达与胃癌细胞药敏性及耐药基因的关系.方法 取60例胃癌组织和癌旁组织石蜡标本,采用免疫组化技术检测组织中pokemon蛋白及耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、肺耐药蛋白(LRP)、生存素(survivin)的表达,并分析pokemon蛋白与其他4种蛋白的关系.采用磺酰罗丹明B(SRB)蛋白染色法检测5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)、奥沙利铂(L-OHP)对胃癌细胞株SGC7901、胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR、胃上皮细胞株GES-1的抑制作用;qPCR及蛋白质印迹法检测上述3种细胞株中pokemon和耐药基因的表达.合成针对pokemon的siRNA并转染SGC7901/ADR细胞,检测转染前后SGC7901/ADR细胞的化疗药敏性及耐药基因的变化.结果 胃癌组织中pokemon、P-gp、MRP1、LRP、survivin蛋白的阳性表达率均高于癌旁组织(P＜0.05);pokemon蛋白表达与P-gp、survivin蛋白表达间存在正相关关系(r=0.385 2,P=0.002;r=0.342 4,P=0.007).Pokemon、P-gp、MRP1、survivin蛋白在SGC7901/ADR细胞株中的表达高于细胞株SGC7901及GES-1;SGC7901/ADR细胞株的耐药性最强,SGC7901次之,GES-1最弱(P＜0.01).Pokemon-siRNA转染SGC7901/ADR细胞后细胞中pokemon mRNA的表达明显受到抑制;转染后化疗药物对细胞的抑制能力增强,P-gp、survivin表达减弱(P＜0.05).结论 Pokemon与P-gp、survivin通过相互调控而促进胃癌耐药性的形成.Pokemon可能成为胃癌靶向治疗的候选基因.     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR中的表达

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体,经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,并检测ｂａｘ基因在转导株的表达．方法：采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ的多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,Ｇ４１８筛选克隆细胞,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达．结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ,将之转入细胞后,经Ｇ４１８筛选３０ｄ获得了稳定的细胞克隆,即ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ－ｂａｘｃｅｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证实了ｂａｘ基因转导株具有明显的Ｂａｘ蛋白表达．结论：ｂａｘ真核表达载体的构建,为胃癌耐药的临床治疗打下了基础．     

miRNA-21-5p通过pdcd4靶向调控胃癌细胞对顺铂敏感性的机制研究

目的:探究微小RNA-21-5p（miRNA-21-5p）通过下调pdcd4基因表达调控胃癌耐药细胞系SGC-7901/DDP对顺铂敏感性机制的研究。方法:采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同浓度的顺铂（0、1、2、4、8、16、32 μmol/L）对胃癌细胞系SGC7901及胃癌耐药细胞系SGC7901/DDP增殖抑制的影响。通过实时荧光定量PCR检测SGC7901/DDP细胞中瞬时转染miRNA-21-5p inhibitors后miRNA-21-5p相对表达量的变化。采用Western blot及实时荧光定量PCR检测转染组、无关序列转染组（NC组）及空白转染组（CON组）分别转染miRNA-21-5p inhibitors及无关序列后对靶基因pdcd4蛋白及mRNA表达量的影响。结果:MTT实验结果显示耐药细胞SGC7901/DDP相对于亲本细胞SGC7901对顺铂不敏感（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果表明,转染组miRNA-21-5p表达量均明显低于NC组和CON组（P<0.01）,转染组pdcd4 mRNA表达量均明显高于NC组和CON组（P<0.01）。Western blot检测结果示,转染组pdcd4蛋白表达量均明显高于NC组和CON组（P<0.01）。结论:miRNA-21-5p表达水平的升高在一定程度上有利于胃癌细胞增殖,并通过下调pdcd4的表达,降低胃癌细胞对顺铂的敏感性。     

SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞血管内皮生长因子表达影响实验研究

目的 观察应用SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞内血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响并对其机制进行初步研究。方法 常规培养胃癌SGC7901细胞,给予不同浓度SKI-Ⅱ干预及DDP干预,MTT法测定各组胃癌SGC7901细胞增殖情况;免疫细胞化学和Western-blot检测药物作用对Sphk1、VEGF表达的影响。结果 MTT检测SGC7901细胞与不同浓度的SKI-Ⅱ共同培养,细胞的生长受到不同程度的抑制,其作用具有剂量依赖性,并随时间的延长逐渐增强,免疫组化及western-blot检测显示SKI-II作用后可显著下调肿瘤细胞SphK1和VEGF蛋白的表达,单用DDP对SphK1、VEGF无作用。结论 SKI-Ⅱ可以通过下调VEGF和Sphk1蛋白表达而有效抑胃癌SGC7901细胞增殖。     

TRF2 siRNA抑制多药耐药胃癌细胞Rapl表达

目的应用RNA干扰技术抑制多药耐药衍生胃癌细胞系TRF2表达,观察其对Rapl表达的影响。方法根据pSilencer3．1-H1载体要求构建TRF2siRNA真核表达载体,分别转染SGC7901／ADR和SGC7901／VCR细胞,免疫荧光技术和Westernblot方法检测Rapl表达。结果成功构建TRF2 siRNA真核表达载体能显著抑制耐药细胞TRF2表达,siRNA转染细胞中Rapl表达明显降低。结论TRF2调控Rapl表达。     

朊蛋白在耐阿霉素胃癌细胞系SGC7901/ADR中的过表达及其意义

目的 探讨朊蛋白(PrP)在耐阿霉素胃癌细胞系SGC7901/ADR中过表达及其与胃癌多药耐药性的相关性。方法(1)利用Northern印迹和Western印迹分别从RNA 水平和蛋白质水平检测朊蛋白在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR及其亲本细胞SGC7901中的表达;(2)借助DNA重组技术构建朊蛋白基因的正反义真核表达载体;(3)通过电穿孔方法将正反义真核表达载体分别转入SGC7901和SGC7901/ADR细胞;(4)以流式细胞仪检测瞬时转染细胞中的阿霉素蓄积和潴留。结果(1)Northern印迹和Western印迹结果提示朊蛋白在SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达显著高于其在SGC7901中的表达;(2)将正反义真核表达载体转入SGC7901(命名为PS)和SGC7901/ADR(命名为PA)中,PCDNA3.1空载体转入SGC7901(命名为BS)和SGC7901/ADR(命名为BA);转染48h后检测转染细胞的平均阿霉素荧光强度,阿霉素蓄积BS为8.9±0.7,PS为6.6±0.3,BA为5.5±0.7,PA7.5±0.6,阿霉素潴留BS为8.0±0.7,PS为5.9±0.5,BA5.1±0.7,PA为7.1±0.5,PS与BS相比两组均为P<0.01,BA与BA相比均为P<0.01表达,并对胃癌细胞,具有统计学意义。结论 朊蛋白在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中高表达并对胃癌细胞的药物蓄积有影响。     

Rap1与胃癌多药耐药的相关性

目的探讨Rap1与胃癌多药耐药的相关性。方法采用免疫荧光技术和Westernblot方法检测胃癌细胞SGC7901、多药耐药胃癌细胞SGC7901／VCR和SGC7901／ADR中Rapl的表达。结果胃癌细胞SGC7901、多药耐药胃癌细胞SGC7901／VCR和SGC7901／ADR胞核和胞浆均有Rap1阳性染色,多药耐药胃癌细胞中Rap1表达明显高于亲本细胞SGC7901。结论Rap1与胃癌多药耐药相关。     

人层粘连蛋白受体调节胃癌细胞多药耐药性的实验研究

目的：探讨相对分子质量为67000的人层粘连蛋白受体（LR）对胃癌细胞多药耐药性（MDR）的调节作用及其机制。方法：应用DNA重组技术构建LR前体蛋白（LRP）的反义RNA表达载体,并借助脂质体将其导入胃癌MDR细胞SGC7901／VCR中。用Western印迹法检测ＬＲ在胃癌细胞中的表达,ＭＴＴ法测定细胞对化疗药物的敏感性,流式细胞仪测定细胞周期以及阿霉素在细胞内的蓄积和潴留。结果：转染LRP反义RNA表达载体显著降低了LR在SGC7901／VCR细胞中的表达。转染细胞（SGC7901／VCR－anLRP)对长春新碱、阿霉素、5－氟尿嘧啶和顺铂的敏感性明显升高,细胞内蓄积和潴留的阿霉素也明显增多。细胞周期分析表明,SGC7901／VCR－anLRP细胞发生了G1期阻滞,并出现了自发性凋亡。结论：LR可能通过影响药物蓄积和细胞凋亡参与对胃癌细胞MDR的调节。     

RAD001对胃癌耐药细胞株SGC7901／DDP的VEGF表达的影响

目的研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）特异性抑制剂RAD001对胃癌耐药细胞株SGC7901／DDP的血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）表达的影响,以期为临床治疗肿瘤提供新的线索。方法常规培养胃癌耐药细胞株SGC7901／DDP,RAD001单独或联合顺铂（DDP）干预48h后,ELISA法测定药物对细胞分泌VEGF蛋白的影响,蛋白免疫印迹法和免疫细胞化学法检测药物作用后细胞中VEGF蛋白的表达情况。结果RAD001单独或联合DDP干预后,SGC7901／DDP细胞分泌的VEGF蛋白减少,呈剂量依赖性;SGC7901／DDP细胞的VEGF蛋白的表达降低。结论RAD001可以减少胃癌SGC7901／DDP细胞的VEGF蛋白的分泌和表达,与DDP联合用药时作用更明显。