膜联蛋白A5低表达对人宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖与凋亡的影响

目的 观察宫颈癌细胞系HeLa细胞在膜联蛋白A5表达降低后,细胞增殖和凋亡的情况. 方法 采用BNA干扰的方法,通过免疫印迹法筛选出对HeLa细胞中膜联蛋白A5的表达抑制效率最高的siRNA,脂质体法将siRNA转染入细胞48h后,用MTT法检测细胞增殖的改变情况,用细胞凋亡光学检测试剂盒检测细胞的凋亡.结果 Helm细胞中膜联蛋白A5的表达被显著抑制,其增殖速度与未转染siRNA的普通HeLa细胞相比,无显著性差异;细胞凋亡显著减少,与未转染siRNA的普通HeLa细胞相比,有显著性差异. 结论 膜联蛋白A5低表达对宫颈癌细胞系HeLa细胞的增殖未见显著影响,但可能影响了细胞的凋亡.     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体(pSUPER-XBP1S)并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

半乳糖凝集素3低表达对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响

目的 探讨半乳糖凝集素3（galectin-3）表达抑制对人胃癌细胞系MGC-803细胞增殖产生的影响。 方法 将胃癌细胞系MGC-803细胞分为3组,siRNA干扰组（转染靶向galectin-3 的特异siRNA）,空白对照组（只加转染试剂）和阴性对照组（转染非特异性的siRNA）。用Western blotting法检测转染后细胞中galectin-3蛋白的抑制效率,应用MTT法、集落形成实验检测galectin-3基因低表达对MGC-803细胞增殖的影响;用Western blotting和免疫组织化学法检测细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达情况。 结果 siRNA干扰组细胞中galectin-3蛋白的表达与阴性对照组和空白对照组相比明显降低（P<0.05）;细胞集落形成实验和MTT显示,siRNA干扰组细胞的增殖能力与阴性对照和空白对照组细胞比较显著降低（P<0.05）;cyclin D1和PCNA蛋白表达均为siRNA 干扰组细胞表达显著低于两对照组（P<0.05）。 结论 Galectin-3低表达可抑制胃癌MGC-803细胞的增殖能力,这可能与抑制cyclin D1和PCNA的表达有关。     

低表达S100钙离子结合蛋白A6促进食管腺癌SK-GT-4细胞的增殖和迁移

目的 探讨S100钙离子结合蛋白A6（S100A6）对食管腺癌SK-GT-4细胞增殖和迁移的影响。 方法 慢病毒转染,构建稳定细胞系shNC和shS100A6,Real-time PCR检测S100A6 mRNA表达情况;倒置显微镜和MTT检测细胞的增殖能力,Transwell检测细胞的迁移能力及U0126（MER1/2的抑制剂）、LY294002（PI3K抑制剂）对细胞增殖、迁移的影响;Western blotting检测细胞中S100A6、p-ERK、p-Akt及其下游参与增殖、迁移的相关蛋白的表达情况,检测U0126、LY294002对p-ERK、p-Akt及其下游参与增殖、迁移的相关蛋白表达的影响。 结果 构建了敲低S100A6的稳定细胞系,敲低S100A6促进了细胞的增殖和迁移,p-ERK、p-Akt水平升高,细胞周期抑制蛋白p21表达量下降、细胞周期蛋白D1(cyclinD1）表达升高,间质细胞标志蛋白——波形蛋白（vimentin）、β-连环蛋白（β-catenin）表达升高;U0126处理shS100A6细胞后,对细胞的增殖无影响,抑制细胞的迁移,p-ERK、β-catenin表达下降;LY294002处理shS100A6细胞后,抑制细胞的增殖和迁移,p-Akt表达下降,p21表达量升高,cyclinD1表达量下降,β-catenin表达下降。 结论 低表达S100A6促进细胞的增殖和迁移,其可能机制是通过p-Akt调控细胞周期的进程促进细胞增殖,通过激活p-Akt/p-ERK调控β-catenin促进细胞的迁移。     

Nrf2靶向siRNA对小鼠神经干细胞增殖和分化能力的影响

目的:探讨核因子E2相关因子2(Nrf2)对小鼠神经干细胞(NSCs)增殖和分化能力的影响。方法:分离新生小鼠海马组织，培养NSCs,采用电穿孔法将Nrf2 siRNA序列转染至NSCs,分别用real time RT-PCR和Western Blot检测敲减效率；运用BrdU掺入实验、Tuj1免疫荧光染色和CCK-8法检测Nrf2靶向siRNA对NSCs的增殖、分化能力和细胞活力的影响。通过脑立体定位技术，在成年小鼠海马部位注射Nrf2抑制剂Brusatol,应用Western Blot检测Nrf2的蛋白表达水平；通过Ki67、DCX免疫荧光染色检测下调Nrf2对海马神经发生的影响。利用活性氧簇(ROS)水平测定法和real time RT-PCR分别检测活性氧水平和氧化应激相关通路超氧化物歧化酶(SOD1和SOD2)的表达。结果:Nrf2的siRNA序列转染至NSCs, real time RT-PCR结果显示siRNA的敲减效率为(54.56±7.05)%(P<0.01),Western Blot结果显示siRNA的敲减效率为(39.50±7.90)%(P<0.01)...     

染色体驱动蛋白KIF4A稳定低表达胃癌细胞系的构建及鉴定

目的 构建稳定低表达染色体驱动蛋白KIF4A的胃癌细胞系,观察KIF4A低表达细胞的有丝分裂期纺锤体中央区的形成.方法 针对人类驱动蛋白KIF4A mRNA的编码区设计特异性siRNA序列,构建KIF4A短发夹RNA（shRNA）表达质粒pGPU-GFP-KIF4A.将质粒转染胃癌细胞SGC-7901,经过G418筛选获得稳定低表达KIF4A的细胞株.使用蛋白免疫印迹方法鉴定细胞株内KIF4A蛋白的敲降效果,并通过细胞免疫荧光染色法观察细胞纺锤体中央区的形成.结果 成功获得了3株不同水平稳定低表达KIF4A的SGC-7901细胞株（SGC-shKIF4A）和稳定表达无意义shRNA的对照细胞（SGC-shNC）;同时,与对照细胞SGC-shNC相比,SGC-shKIF4A细胞中有丝分裂纺锤体中央区延长,并随KIF4A蛋白表达水平的降低而增加.结论 成功构建了不同水平稳定低表达KIF4A蛋白的胃癌细胞SGC-shKIF4A,为进一步研究驱动蛋白分子KIF4A的功能及其在胃癌发生发展过程中的作用奠定基础.     

沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖及凋亡的影响

背景：研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的：构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法：采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过...     

siRNA干扰Ezrin基因对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的探讨细胞膜与细胞骨架连接蛋白埃兹（Ezrin）对人脐静脉内皮细胞生长和转移能力的影响。方法培养人脐静脉内皮细胞,选择3对小干扰RNA（siRNA）序列下调Ezrin的表达,实时定量PCR和Western-blot印迹法分别检测Ezrin mRNA和蛋白表达水平的变化。BrdU ELISA法检测Ezrin siRNA干扰后细胞增殖能力的改变,伤口愈合实验检测Ezrin siRNA干扰后细胞迁移能力的变化,流式细胞术检测Ezrin siRNA干扰后细胞凋亡能力。结果实时定量PCR和Western-blot印迹结果显示,siRNA干扰后Ezrin的基因和蛋白水平均显著下调;BrdU法显示Ezrin siRNA干扰后细胞生长速率降低（P〈0.05）,划痕实验显示Ezrin siRNA干扰后细胞迁移率降低（P〈0.05）,流式细胞仪检测显示Ezrin siRNA干扰后细胞凋亡率升高。结论 Ezrin蛋白可影响脐静脉内皮细胞的增殖和迁移能力,推测其在血管功能和肿瘤研究中可能具有重要意义。     

膜联蛋白A7低表达对人宫颈癌HeLa细胞系增殖与凋亡的影响

目的 探讨膜联蛋白A7表达减少是否对人宫颈癌HeLa细胞系的增殖和凋亡产生影响. 方法 采用Western blotting鉴定siRNA可否有效抑制膜联蛋白A7表达,然后用脂质体转染法将siRNA转染入HeLa细胞,将细胞分为siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,分别在转染后48h进行刃天青实验以观察细胞增殖状况的改变;流式细胞术检测3组细胞凋亡情况. 结果 在转染膜联蛋白A7的siRNA后48h的HeLa细胞, 刃天青实验可见siRNA干扰组细胞增殖较阴性对照组和空白对照组显著降低(P<0.05);流式细胞术实验可见siRNA干扰组细胞凋亡显著增多(P<0.05). 结论 膜联蛋白A7的低表达可能影响HeLa细胞的增殖和凋亡.     

使用RNAi技术抑制HeLa细胞p42MAPK表达

目的筛选可抑制HeLa细胞p42^MAPK表达的siRNA。方法采用体外转录合成的方法,合成针对p42^MAPK的siRNA 3条和阴性对照siRNA 1条,并进行Cy-3荧光标记,用脂质体转染HeLa细胞,以判断转染效果。应用噻唑蓝（MTT）法和流式细胞仪检测siRNA的作用效果,筛选具有功能的siRNA序列;应用Western blot方法鉴定siRNA抑制p42^MAPK表达的效果。结果从3条p42^MAPK siRNA中筛选出2条有效的序列siRNA-2和siRNA-3,与空白对照组、脂质体对照组和随机siRNA-4相比,两者均可诱导HeLa细胞p42^MAPK表达下调,Western blot结果分析显示,与随机siRNA-4相比分别下调了1／2和2／3,并抑制HeLa细胞的增殖（P〈0．05）,同时改变了细胞周期各时相的细胞分布。结论p42^MAPK siRNA-2和siRNA-3在体外实验中可沉默目的基因以及抑制HeLa细胞增殖。     

MTT与HOECHST染色法检测膜联蛋白A7基因沉默对Hela细胞的影响

目的　探讨膜联蛋白A7（ANXA7）低表达对人宫颈癌细胞系Hela细胞增殖和凋亡的影响。 方法 　(1)体外培养Hela细胞,应用免疫组化和Western blot鉴定细胞膜联蛋白A7的表达,Western blot鉴定siRNA干扰对膜联蛋白A7表达的抑制效果;(2) MTT实验检测siRNA抑制膜联蛋白A7的表达后对Hela细胞增殖情况的影响;(3)激光共聚焦检测siRNA抑制膜联蛋白A7的表达后对Hela细胞凋亡情况的影响。 结果　(1)免疫组化和Western blot结果均显示Hela细胞内有膜联蛋白A7的表达。siRNA干扰效率的检测显示：siRNA干扰组与阴性对照组、空白对照组比较膜联蛋白A7的表达明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）;(2) MTT实验显示：siRNA干扰组与阴性对照组、空白对照组比较细胞增殖速度无显著性差异（P>0.05）;(3)激光共聚焦检测结果显示：与阴性对照组和空白对照组相比,siRNA干扰组细胞凋亡率显著增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论　膜联蛋白A7的低表达可促进人宫颈癌细胞系HeLa细胞的凋亡。     

siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及稳定表达细胞株的筛选

目的：构建并鉴定巨噬细胞移动抑制因子（MIF）特异性siRNA重组逆转录病毒载体，将其导入PHOENIX细胞中，筛选出分泌MIF-siRNA病毒的包装细胞，其分泌的病毒可以抑制MIF蛋白的表达，并初步了解稳定沉默MIF细胞株的特性。方法:体外合成含针对MIF特异基因序列的寡核苷酸并定向克隆入pSuper.retro逆转录病毒载体，构建的载体通过酶切、测序鉴定后，采用脂质体介导转染包装病毒细胞株PHOENIX，收获病毒上清；将其感染HeLa细胞株，经过嘌呤霉素筛选得到抑制MIF表达的HeLa细胞株。Western blotting鉴定MIF表达的抑制效果并通过迁移实验、软琼脂糖克隆形成实验比较HeLa-pSuper-MIF和HeLa-pSuper-mock之间的特性。结果:构建了重组逆转录病毒载体pSuper-MIF，转染包装病毒细胞株PHOENIX，病毒上清感染HeLa细胞，抑制了HeLa细胞内源性MIF蛋白的表达。沉默MIF蛋白后导致HeLa细胞迁移能力下降，不依赖支持物生长的特性减弱和黏附能力下降，同时稳定表达沉默MIF蛋白的细胞株生长周期停留在G0/G1期与对照组相比凋亡减少。结论:构建了重组逆转录病毒载体pSuper-MIF，转染包装细胞所产生的病毒上清，能够抑制HeLa细胞内的MIF蛋白表达，表明MIF对HeLa细胞的迁移和不依赖支持物生长能力有重要作用。     

Msi1siRNA对人结肠癌SW-480细胞增殖的影响

目的 探讨siRNA沉默Msi1基因表达对人结肠癌SW-480细胞增殖的影响.方法 针对Msi1 mRNA序列设计合成siRNA,转染SW-480细胞;采用RT-PCR法检测Msi1基因表达;MTT比色实验、群体倍增时间及平皿克隆形成实验分析Msi1 siRNA对人结肠癌SW-480细胞的生长抑制效应,流式细胞术检测Msi1 siRNA 对其细胞周期的影响.结果 Msi1 siRNA能有效抑制人结肠癌SW-480细胞中Msi1基因的表达;Msi1 siRNA转染SW-480细胞24、48、72 h后,与其它各组比较,其吸光度值明显降低,Msi1 siRNA 组SW-480细胞生长、增殖速度明显减缓(P<0.05);空白对照组的SW-480细胞群体倍增时间为22.15 h,而Msi1 siRNA处理后的细胞,群体倍增时间延长至37.76 h(P<0.05);平皿克隆形成实验结果发现,Msi1 siRNA处理后的细胞与其它各组相比,细胞生长明显减慢.流式细胞术表明Msi1 siRNA可导致SW-480细胞G0/G1期阻滞,S期细胞减少.结论 沉默Msi1基因对人结肠癌SW-480细胞增殖有负性调节作用.     

TLR4通过NF-κB信号途径对宫颈癌细胞增殖的影响

目的:研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)小干扰RNA(siRNA)是否通过NF-κB信号途径下调Bcl-2而抑制宫颈癌细胞的增殖。方法:设计并合成针对TLR4基因的3条特异性siRNA)及阴性siRNA,并同时设立空白对照,然后用脂质体LipofectamineTM2000转染细胞。通过半定量RT-PCR和Western印迹法分别检测转染前后He La细胞中TLR4 mRNA和蛋白表达水平,Western印迹法检测p65及Bcl-2蛋白表达水平,MTT法和平板克隆检测细胞增殖率,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期。结果:3条针对TLR4基因的siRNA均能抑制TLR4的mRNA和蛋白表达,其中TLR4-siRNA-003的沉默效率最高。转染TLR4-siRNA-003 48 h后细胞中TLR4的mRNA和蛋白表达水平分别下调62%和89%,p65及Bcl-2蛋白水平明显下调,同时细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率显著升高,细胞周期被阻滞于G1期。结论:TLR4特异性siRNA能够有效沉默TLR4基因表达,并通过NF-κB信号通路下调Bcl-2而显著抑制宫颈癌He La细胞的增殖。TLR4可能成为治疗宫颈癌的一个新靶点。     

Bmi-1 siRNA inhibited ovarian cancer cell line growth and decreased telomerase activity

The knockdown of Bmi-1 could effectively suppress cancer cell proliferation and tumourigenicity in several cancers. This study aims to investigate whether or not Bmi-1 plays a causative role in the proliferation of ovarian epithelial cancer cells and telomerase activity. The messenger RNA (mRNA) and protein expression levels of Bmi-1 in the human ovarian carcinoma cell line OVCAR-3 were downregulated by Bmi-1 siRNA, as confirmed by real-time polymerase chain reaction (PCR) and Western blot. Cell viability was analysed by MTT assay, and telomerase activity was analysed by a modified telomeric repeat amplification protocol. Targeting Bmi-1 with siRNA inhibited Bmi-1 mRNA over five-fold compared with the control cells, and inhibited Bmi-1 protein expression over three-fold compared with control cells. The viability of the OVCAR-3 ovarian cancer cell line was reduced by Bmi-1 mRNA compared to control cells. Telomerase activity was decreased 22.73% (from 0.33 to 0.255) by Bmi-1 siRNA treatment compared to control cells. As Bmi-1 siRNA depressed telomerase activity, cell immortalisation may be prevented; thus, silencing Bmi-1 may be a potential therapy to manage ovarian cancer.     

Rab1A对多发性骨髓瘤细胞系8226增殖和凋亡的影响

目的 探讨Rab1A对多发性骨髓瘤(MM)细胞系8226增殖和凋亡的影响.方法 采用siRNA干扰RabIA表达,将多发性骨髓瘤细胞8226分为空白对照组、阴性对照组和Rab1A siRNA组.其中空白对照组的多发性骨髓瘤细胞8226不做任何处理,阴性对照组的多发性骨髓瘤细胞8226转染阴性对照siRNA.Rab1A ...     

芪三酚与人乳腺癌MDC1基因关系的研究

目的探讨芪三酚（Res）对人乳腺癌MDA—MB-231细胞增殖抑制的相关效应及其与MDCl基因的关系。方法以人乳腺癌MDA—MB-231细胞株为研究对象,采用MTS方法测定细胞增殖,应用吖啶橙荧光染色观察Res对乳腺癌MDA—MB-231细胞的影响,用RT-PCR与免疫印迹方法测定MDCl基因与蛋白表达水平,用小RNA干扰MDCl基因后,用流式细胞仪检测细胞的凋亡并观察其对Res的敏感性影响。结果40μmol／L以上的Res可显著抑制乳腺癌MDA—MB-231细胞的增殖（P〈0．05）,给予0、60、120μmol／LRes能明显降低MDCl基因和蛋白的表达（P〈0．05）。用小RNA干扰MDC1基因后,流式细胞术分析显示,实验组（MDCl．siRNA）的细胞凋亡率[（45．13±6．2）％]较阴性对照组[（24．34±2．6）％]和未处理组[（17．69±4．9）％]明显上升（P〈0．05）,MTS结果显示MDCl基因干扰后细胞对Res的敏感性增加。结论40μmol／L以上的Res可以抑制MDA-MB-231细胞的增殖,Res可以有效降低MDC基因和蛋白的表达并促进细胞的凋亡。用小RNA干扰MDCl基因（MDCl-siRNA）后,MDA-MB-231细胞对Res的敏感性增加。     

脑源性神经营养因子基因沉默对HeLa细胞增殖和凋亡的影响

目的 以高表达脑源性神经营养因子(BDNF)的官颈癌细胞系HeLa细胞为模型,筛选针对BDNF基因的有效干扰RNA序列,并观察BDNF基因沉默对HeLa细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计和构建两个针对人BDNF基因的siRNA真核表达载体,经酶切鉴定和DNA序列分析鉴定后用脂质体Lipofectamine 2000介导转染,将空载体质粒pGenesil-1和两个重组质粒pGenesil-shRNA-BDNF1、pGenesil-shRNA-BDNF2分别转染人人HeLa细胞(依次命名为P_0、P_1和P_2组);采用RT-PCR和Western blot法分别从mRNA水平和蛋白水平检测BDNF表达的变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞的增殖水平;流式细胞仪和Hoechest 33258染色检测细胞凋亡.结果 成功构建了针对BDNF的siRNA真核表达载体.P_1组与未转染、P_0、P_2组相比,BDNF mRNA表达水平(F=48.19,P<0.01)和BDNF蛋白表达水平(F=13.74,P<0.01)均明显降低,P_2组则未达实验预期的干扰目的 (P>0.05).通过MTT实验,发现P_1组细胞生长速度明显减慢,增殖高峰后移;流式细胞术检测证实早期凋亡率P_1组[(53.4±4.2)%]明显高于未转染组[(0.8±0.4)%]、P_0组[(5.1±1.8)%]和P_2组[(7.9±2.4)%;F=269.77,P<0.01].结论 BDNF基因高表达于官颈痛细胞系HeLa细胞,BDNF基因沉默能明显增加HeLa细胞的凋亡并抑制其增殖,提示BDNF基因可能成为恶性肿瘤治疗的新靶点.     

siRNA沉默转酮醇酶样基因1下调人宫颈癌细胞HIF-1α表达及糖酵解关键酶活性

 目的：通过siRNA技术沉默宫颈癌细胞转酮醇酶样基因-1（TKTL1）后观察其在缺氧条件下低氧诱导因子1α（HIF-1α）表达水平及糖酵解途径中2个关键酶己糖激酶Ⅱ（HK-Ⅱ）和乳酸脱氢酶（LDH）活性的变化情况,旨在探讨肿瘤细胞TKTL1表达与糖酵解途径的关系。方法：用构建的靶向TKTL1基因siRNA干扰质粒载体转染HeLa细胞株,RT-PCR检测TKTL1 mRNA表达并结合转酮醇酶（TKT）活性测定判断其干扰效率;以未转染HeLa细胞为对照,进一步观察TKTL1沉默的癌细胞在缺氧条件下HIF-1α和HK-Ⅱ表达水平,以及HK-Ⅱ和LDH活性的变化。结果：siRNA沉默HeLa细胞TKTL1基因后TKTL1 mRNA表达下降,TKT活性显著降低（P<0.01）,HIF-1α和HK-Ⅱ表达水平及HK-Ⅱ和LDH活性较对照组细胞均显著降低（P<0.01）。结论：沉默肿瘤细胞TKTL1基因能下调HIF-1α表达并降低糖酵解代谢关键酶活性,从而影响肿瘤细胞的恶性表型。