DDX5和DDX17在卵巢癌组织中的表达及其临床意义

目的：探究DDX5和DDX17在卵巢癌患者组织中的表达及临床意义。方法：采用实时荧光定量PCR检测卵巢癌组织、正常卵巢上皮细胞中DDX5和DDX17的相对表达量,进一步通过基因沉默技术,分别降低DDX5和DDX17的表达后,再采用CCK-8实验测定DDX5和DDX17对卵巢癌细胞增殖的影响。结果：卵巢癌组织中DDX5表达明显高于正常卵巢上皮细胞,而卵巢癌组织中DDX17表达明显低于正常卵巢上皮细胞(P<0.05);沉默DDX5表达后,卵巢癌细胞的增殖活性受到抑制。结论：DDX5和DDX17在卵巢癌组织异常表达,DDX5与卵巢癌细胞的增殖相关。     

地塞米松对乙型肝炎病毒复制与表达的调控研究

乙型肝炎是严重危害人民健康的传染病。据统计，全球ＨＢｓＡｇ阳性人数达３亿。现有抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的药物中，α－干扰素已普遍被接受，有不少报道于短程糖皮质激素治疗撤药后，再用α－干扰素，能提高后者的抗病毒效果。为了解糖皮质激素对ＨＢＶ复制与表达的...     

克隆乙型肝炎病毒DNA在肝与肾细胞中复制与表达的研究

对比研究在外细胞培养系统中乙型肝炎病毒在肝,紧名的复制与表达。方法髟克隆ＨＢＶＤＮＡ分别转染ＨｅｐＧ２与２９３细胞系;ｐ１７７ｔｎ与ｐ３．８Ⅱ还转染了原代人胚肾细胞。培养后收集转染细胞培养上清液,用ＥＬＩＳＡ法检测ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ;提取转染细胞的ＤＮＡ与ＲＮＡ,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ与Ｎｏｒｈｅｒｎ印迹杂交检测细胞内ＨＢＶＤＮＡ与ＨＢＶＲＮＡ。结果转染ＨｅｐＧ２细胞,ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ均有     

长链非编码RNA GAS5靶向调控miR-424表达抑制宫颈癌HeLa细胞增殖

目的探讨长链非编码RNA GAS5(lncRNA GAS5)调控miR-424抑制宫颈癌细胞增殖的机制。方法预测筛选靶向GAS5的miRNA,用双荧光素酶法检测其荧光素酶活性。分析宫颈癌组织和正常宫颈组织GAS5和miR-424 mRNA水平,及其与患者临床病理特征的关系。检测Ect1/E6E7细胞和HeLa细胞GAS5和miR-424 mRNA水平。将miR-NC、GAS5 RNAi和pCDNA3.0-HA-GAS5质粒转染到HeLa细胞,MTT法及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况,Western blotting法检测细胞Dnmts、EZH2和Akt3蛋白表达水平。 结果miR-424-mimic可明显降低GAS5-WT荧光素酶活性(P＜0.05),表明GAS5与miR-424存在靶向调节作用。宫颈癌组织GAS5、miR-424 mRNA表达低于正常宫颈组织(P＜0.05);是否转移、不同FIGO分型患者间GAS5和miR-424表达存在差异(P＜0.05)。HeLa细胞GAS5和miR-424 mRNA表达低于Ect1/E6E7细胞(P＜0.05)。与阴性对照组比较,HeLa细胞GAS5、miR-424 mRNA、细胞凋亡率、Dnmts和EZH2表达GAS5 RNAi组降低,GAS5质粒组增加;细胞增殖率和Akt3表达GAS5 RNAi组增加,GAS5质粒组降低(P＜0.05)。 结论lncRNA GAS5通过靶向调控miR-424的表达抑制宫颈癌HeLa细胞增殖。     

肝细胞核因子3β调控小鼠体内HBV转录和复制的实验研究

目的 应用复制型HBV小鼠模型观察肝细胞核因子3β(HNF3β)对小鼠体内HBV转录和复制的调控作用.方法 通过尾静脉高压注射法将复制型HBV重组质粒pHBV4.1和大鼠HNF3β表达质粒pCMVHNF3β导入小鼠体内,用Northern吸印杂交检测小鼠肝组织中HBV 3.5kb、2.4/2.1kb、0.7kb mRNA的转录情况,Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平.结果 经小鼠尾静脉高压注射法体内转染质粒pHBV4.1后,小鼠肝组织中检测到HBV 3.5kb、2.4/2.1kbmRNA转录信号和HBV DNA复制中间体信号;与共转染pHBV4.1和空载质粒pCMVpA对照组相比,共转染pHBV4.1和pCMVHNF3β使HNF3β过量表达,明显降低了小鼠体内HBV RNA转录和DNA复制水平.结论 肝富集转录因子HNF3β对小鼠体内HBV转录和复制具有抑制作用,有可能成为今后抗HBV生物治疗新的靶点.     

HBV基因在第20代HBV转基因小鼠中的复制和表达

目的研究HBV基因在已传20代BALB／c-TgN（HBV D型1．3）SWS458小鼠中复制和表达情况。方法采用PCR荧光定量检测法、ELISA检测和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的复制和表达情况。结果F20代BALB／c-TgN（HBVD型1．3）SWB458小鼠血清HBVDNA为（104—106）copy／mL，HBsAg表达量为（124．41±33．46）ng/mL，preS1和HBcAg的OD值分别为0．248±0．076和0．635±0．338。肝组织有HBsAg和HBcAg表达，且HBsAg为胞浆型，HBcAg为核型。结论经过筛选和培育，本转基因小鼠传至20代时HBV基因复制表达稳定，表明我们已经获得一个传代表达稳定的HBV转基因小鼠品系。     

DHX15在HBV复制中的意义及其机制初步研究

目的：筛选DEx D/H-box家族中可能影响HBV增强子或核心启动子转录活性的基因,初步研究DHX15对HBV复制的调控作用。方法：克隆DEx D/H-box家族基因到表达质粒PCH9,并构建由HBV增强子和核心启动子驱动的海肾荧光素酶报告质粒pcore-Rluc;分别将各种DDX表达质粒与pcore-Rluc共转染HepG2细胞,筛选影响Rluc荧光素酶活性的DDX家族成员。在HepG2细胞中共转染HBV1.3倍体质粒和DHX15表达质粒,通过Western blot检测DHX15在细胞中的表达,用 South－ern blot、Northern blot检测过表达DHX15对细胞中HBV复制水平和转录水平的影响。构建HBV增强子与核心启动子截短突变体,确定DHX15在HBV增强子或核心启动子上的作用区域。结果：成功构建30种DEx D/H-box家族基因克隆;筛选出对HBV增强子/核心启动子有明显影响的基因DHX15（P=0.042）;与对照组相比,过表达DHX15能促进HBV DNA的复制水平;并且能上调HBV RNA转录水平;成功构建HBV核心启动子截短突变体,发现DHX15促进HBV的复制是通过增强子实现的（t=8.292,P=0.001;t=5.215,P=0.006）。结论：过表达DHX15可通过影响HBV增强子的活性从而促进HBV复制。     

强的松增强 HBV 感染小鼠体内病毒复制表达

目的:检测糖皮质激素对HBV感染小鼠体内HBV复制的作用。方法:采用高压注射体内转染法将HBV复制型重组质粒p AAV/HBV1.2导入雄性C57BL/6小鼠,转染后24 h按体重、年龄、血清HBe Ag水平对小鼠进行配对,分为实验组和对照组,分别连续给予强的松或生理盐水灌胃。于第3天和第10天给药后4~6 h处死小鼠。采用Southern杂交检测小鼠肝脏HBV-DNA复制中间体;化学发光法检测血清中HBe Ag和HBs Ag。结果:对HBV感染小鼠连续给予强的松或生理盐水3 d后,所有小鼠肝脏中均可检测到较高水平的HBV-DNA复制中间体,给予强的松的实验组稍高于给予生理盐水的对照组,二者比值为1.127∶1;连续处理10 d后,实验组小鼠肝脏中HBV-DNA复制中间体的水平明显高于对照组,比值为2.534∶1。处理3 d后对照组和实验组小鼠血清HBs Ag平均值分别为:1 618.28μg/μL、1 666.23μg/μL,实验组与对照组无明显差别;小鼠血清对照组和实验组HBe Ag平均值分别为14.68μg/μL、14.95μg/μL,实验组对照组无明显差别;处理10 d后对照组和实验组小鼠血清HBs Ag平均值分别为:8 059.40μg/μL、11 885.87μg/μL,实验组高于对照组。小鼠血清对照组和实验组HBe Ag平均值分别为183.15μg/μL、286.14μg/μL,实验组高于对照组。结论:强的松可增强HBV感染小鼠体内乙肝病毒的复制和表达,并且随着作用时间的延长,作用也越明显。本研究为糖皮质激素及引起HBV再激活的相关研究奠定基础,同时也再次提醒临床医生,应充分重视糖皮质激素的使用中HBV再激活的问题。     

HBV全基因真核表达载体的构建及表达

目的：为诱导HBV特异性CTL，构建HBV全基因真核表达载体，并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法：以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3，回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3，T4 DNA连接酶连接HBV和pcDNA3，转化、筛选，酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞，经G418筛选，ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，RT-PCR检测转染细胞中PreSl mRNA的表达。结果：经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV，转染HepG2后，建立了新的肝癌细胞系HepG2．02G，细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg，PreSl mRNA在转染细胞中表达。结论：经体外重组，获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体，并可在肝癌细胞中稳定表达。     

肝富集转录因子在HBV基因转录与复制中的作用研究

目的观察各种肝富集转录因子对乙型肝炎病毒（HBV）基因转录和病毒复制水平的影响,探讨其在HBV嗜肝性机理中的作用。方法用复制型HBV重组质粒pHBV4．1与肝富集转录因子HNF1、HNF3、HNF4、HNF6、C／EBP或RXRa／PPARa的表达质粒,分别共转染非肝源细胞株NIH3T3、HeLa、293T、SWl353、CV-1和COSl。用Northern吸印杂交检测HBV3．5kb、2．4／2．1kb、0．7kb mRNA的转录情况,Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平。结果用pHBV4．1转染NIH3T3细胞后,在没有肝富集转录因子表达质粒共转染时未能检出3．5kb HBV RNA转录,也无HBV DNA复制;当用肝富集转录因子共转染时,HNF4和RXRα／PPARα的表达能够激活3．5kb HBV RNA转录和HBV DNA复制,而HNF1、HNF3、HNF6和C／EBP未能激活HBV复制。在HeLa、293T、SW1353、CV-1和COS1细胞中,HNF4、RXRα／PPARα对HBV的转录和复制也具激活作用。进一步用突变型HBV重组质粒研究发现,C启动子HNF4结合位点的突变明显减弱了HNF4和RXRα／PPARα对HBV复制的激活作用。结论肝富集转录因子HNF4和RXRα／PPARα可支持HBV在非肝源细胞中的转录与复制;肝特异性基因转录是HBV嗜肝性的决定因素之一。     

HBV感染者血清HBV PreS1抗原检测与病毒复制的关系

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)PreS1抗原与HBV复制的关系.方法采用ELISA法检测HBV血清标志物和HBV PreS1抗原;采用荧光定量PCR方法检测HBV-DNA,对检测结果作分析.结果HBVPreS1抗原和HBV-DNA在HBeAg阳性标本组中的检出率明显高于其在HBeAg阴性标本组中的检出率(P＜0.01);HBV PreS1抗原和HBV-DNA有较高相关性(P＜0.01).结论HBV PreS1抗原与具有病毒活动性复制意义的指标(HBeAg和HBV-DNA)有良好的相关性,HBV PreS1抗原的检测结果可以较好地反映HBV的复制情况.     

HBV感染者中HBV前S1蛋白检测分析

目的检测HBV前S1蛋白（PreSl-Ag）的水平,分析与HBVDNA复制的关系。方法用酶联免疫吸附分析法（EusA）检测HBV感染者血清中PreSl-Ag和HBV血清标志物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）,同时用RealTimePCR检测血清中HBVDNA含量。结果407例HBV感染者HBeAg（＋）的大三阳模式135例血清中,HBV—DNA、PreSl-Ag阳性率分别为87．4％和81．5％,两者差异无统计学意义;在117例HBeAg（-）的小三阳模式血清中,HBV—DNA．PreSl-Ag阳性检出率分别为74．4％和69．2％,两者差异无统计学意义。在266例HBV—DNA阳性患者血清中,PreSl-Ag阳性和HBeAg阳性检出率分别为74．4％、60．2％,两者差异具有统计学意义,P〈0．01。结论PreSl-Ag与HBV—DNA检测结果-致性较好,较HBeAg能更灵敏地反映体内HBV的复制状况,可与HBV—DNA互相补充,在临床诊断和治疗HBV感染中有重要意义。     

反义基因转移表达及抗乙型肝炎病毒的作用

目的观察重组逆转录病毒载体－包装细胞系统介导反义基因转移表达和抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法将ＨＢＶａｙｗ１４０２－２９０６片段和２８３９－１９８６片段反向插入重组逆转录病毒载体质粒，分别转染ＰＡ３１７包装细胞，分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和２．２．１５细胞。结果转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。ＨＢＶ反义基因重组逆转录病毒感染２．２．１５细胞后第３天，表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）表达量减少，感染后第５天，ＨＢＶ抗原表达抑制率达高峰。ｐｒｅＳ／Ｓ片段反义基因转移后，ＨＢｓＡｇ表达抑制率为７１％，ＨＢｅＡｇ抑制率为２３％；ｐｒｅＣ／Ｃ片段反义基因转移后，ＨＢ－ｓＡｇ表达抑制率为２３％，ＨＢｅＡｇ抑制率为５９％。结论逆转录病毒载体－包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞内转移和表达，并对ＨＢＶ复制和表达均有抑制作用。     

硫代磷酸寡脱氧核苷酸体外抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 了解三螺旋形成寡核苷酸（ＴＦＯ）、反义寡核苷酸（ＯＤＮａｓ）抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）作用。设计合成针对ＨＢＶ核心启动子１７３４ｎｔ＝１７５４ｎｔ及前Ｃ、前基因组ＲＮＡ５’端起始区的２１聚硫代磷酸ＴＦＯ（ＴＦＯ２１）及２１聚硫代磷酸ａｓ（ＯＤＮａｓ２１）。在２２．１．５细胞观察了各寡核苷酸的抗ＨＢＶ作用。结果 ＴＦＯ２１、ＯＤＮａｓ２１处理的２２．１．５细胞ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及ＨＢＶＤＮＡ     

髓样细胞分化蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的机制研究

目的探讨髓样细胞分化蛋白（MyD88）对乙型肝炎病毒复制的抑制作用及其机制。方法以连接了MyD88全长序列的腺病毒为载体感染HepG2.215细胞,免疫荧光法确认Ad5-MyD88的感染效率后,以无关蛋白GFP作为对照,用ELISA、Real-time PCR、Northern blotting、Southern blotting分别检测上清中的HBsAg和HBeAg的含量及HBV RNA、DNA的表达观察MyD88对HBV复制抑制作用的影响。结果与GFP相比,感染了带有MyD88序列腺病毒的HepG2.215细胞上清中HBsAg、HBeAg含量、细胞内RNA及Core particle DNA的水平全面下降。结论 MyD88可降低HepG2.215细胞内HBV的复制水平;MyD88在抑制HBV复制过程中有着一定的作用。     

乙型肝炎病毒前S1抗原与HBVDNA定量检测相关性分析及临床应用价值

目的探讨乙型肝炎（乙肝）患者前S1（Pre S1）抗原检测和乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测以及乙肝病毒血清标志物（＂乙肝五项＂）之间的关系,同时研究Pre S1抗原和HBV DNA在乙型肝炎诊断中的重要性。方法对537例乙肝患者血清用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定Pre S1抗原和HBV血清学标志物,用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）法进行HBV DNA检测,并对检测数据采用χ2检验进行比较分析。结果 537例乙肝患者血清中,HBV DNA总阳性率为52.70%;前S1抗原总阳性率为49.35%,两者间比较差异无统计学意义（χ2=1.21,P〉0.05）,而且Pre S1抗原和HBV DNA检测的符合率为93.62%。在HBV DNA阳性乙肝患者中Pre S1抗原检测阳性率为89.05%,HBeAg检测阳性率为37.46%,两者间差异有统计学意义（χ2=30.79,P〈0.01）。结论 Pre S1抗原与HBV DNA具有高度相关性,并且能够比HBeAg更敏感地反映乙肝病毒的复制情况,Pre S1抗原可作为血清标志物检测的重要补充,更适合在无条件进行HBV DNA检测的基层医院开展。