树突状细胞与实验性变态反应性脑脊髓炎

自身免疫性疾病的激发和自身反应性T细胞的激活与维持的机制尚不十分清楚。作为有力的抗原呈递细胞(APC)的树突状细胞(DC)，兼有抗原传递以及初级致敏T细胞的作用，可以破坏自身忽略并诱发进展的自身反应性T细胞。在自身免疫性疾病中，不同类型的树突状细胞在诱导Th1／Th2细胞的反应中发挥了重要作用。特定的细胞因子可以诱导免疫源性的树突状细胞向耐受源性的树突状细胞分化。     

“补肾生髓”法通过Notch信号通路调节DCs介导的CD4+ T细胞分化及对EAE的干预作用研究

目的：研究“补肾生髓”法方药（BSD）对通过调节树突状细胞（Dendritic cells,DCs）Notch信号通路对CD4+ T细胞分化及实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）模型小鼠发病的干预作用。 方法：主动免疫法诱导2D2小鼠EAE后,磁珠分选收集脾脏和淋巴结中 CD4+ T 细胞,体外分离培养及诱导 C57BL/6 （C57）小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）成熟,分组干预后,与CD4+ T 细胞共培养后,被动注射至C57小鼠体内,观察小鼠发病情况。实验分组为：对照（Control）组、BSD组、阳性药物γ分泌酶抑制剂（gamma-secretase inhibitor,GSI）组。采用Western blot检测各组DCs Notch通路蛋白表达情况,采用流式细胞术分析各组中CD4+ T 细胞分化情况, 结果：BSD可抑制DCs Notch1,Jagged1,MAML蛋白水平,通过DCs诱导CD4+T细胞Treg分化增多,Th17分化减少,并改善被动免疫诱导的小鼠EAE症状评分。 结论：BSD可通过抑制DCs Notch信号通路活化,减少DCs介导的CD4+T细胞分化,进而缓解EAE残疾症状。     

沙利度胺对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠CD4+T细胞凋亡的影响

目的探讨沙利度胺对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）大鼠髓鞘、轴突的保护作用以及CD4+T细胞凋亡的影响。方法将30只雌性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组和药物组,每组10只。利用豚鼠脊髓匀浆皮下注射方法制作EAE模型,自造模日起SD大鼠腹腔注射60mg/kg沙利度胺或无菌溶剂,共15d;至免疫诱导的第20天统一处死。坚牢蓝（LFB）染色、甘氨酸银染色分别观察髓鞘、轴突的损伤情况,免疫组化法检测星形胶质细胞、CD4+T细胞变化,流式细胞术检测外周血CD4+T细胞凋亡情况。结果与模型组比较,药物组髓鞘脱失、轴突丢失均有所缓解,星形胶质细胞增生反应明显减轻;而外周血凋亡CD4+T细胞比例明显升高,CD4+T细胞比例及中枢浸润CD4+T细胞水平均较低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论沙利度胺可减轻EAE大鼠髓鞘及轴突损伤,可能与促进CD4+T细胞凋亡有关。     

树突状细胞在实验性变态反应性脑脊髓炎病程进展中作用的研究

目的：研究树突状细胞在实验性变态反应性脑脊髓炎病程进展中的作用。方法：诱导实验性变态反应性脑脊髓炎模型，采用直接免疫荧光法观察树突状细胞在外周淋巴结和中枢神经系统中分布及数量的变化。结果：免疫后第4、7、9天外周淋巴结树突状细胞数量逐渐增加，免疫后第9天脑、脊髓中才出现树突状细胞浸润。免疫后第15天外周淋巴结及中枢神经系统中树突状细胞数量均达高峰，第23天其数量减少。实验性变态反应性脑脊髓炎组与对照组差别显著。结论：树突状细胞在实验性变态反应性脑脊髓炎的发生、发展、转归，尤其在触发发病中起着重要作用。     

雷帕霉素通过上调TGF-β/smad信号通路减轻小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎

目的观察雷帕霉素对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的治疗作用,并研究相关机制。方法建立C57BL/6小鼠 EAE模型,免疫成功后将小鼠分为试验对照组,雷帕霉素小剂量组（0.3 mg/kg/d）和雷帕霉素大剂量组（1 mg/kg/d）。应用Knoz 评分观察小鼠的临床评分,免疫组化法观察IL-17浸润情况,流式细胞仪观察外周Treg细胞的分化情况,ElISA法观察小鼠细胞 因子的变化情况,Western blot法观察p-smad2和p-smad3表达情况。结果大剂量雷帕霉素可以明显改善EAE小鼠的神经功能 缺损评分,在发病初期,高峰期及缓解期大剂量雷帕霉素组评分分别为（0.14±0.38）,（0.43±1.13）和（0.14±0.37）,而实验对照组 分别为（1.14±0.69）,（2.14±1.06）和（2.2±0.75）;大剂量雷帕霉素组中可IL-17炎性细胞在在中枢神经系统的浸润为（43±1.83）, 而实验对照组为（153.5±7.02）;大剂量雷帕霉素可以抑制IL-12,IFN-γ,IL-17和IL-23炎性细胞因子同时诱导IL-10和TGF-β抗 炎性细胞因子;大剂量雷帕霉素组外周Treg 细胞为（10.17±0.68）,较实验对照组（3.52±0.32）明显增多（P<0.05）;雷帕霉素和 TGF-β具有协同免疫抑制作用,体外实验发现雷帕霉素和TGF-β共同作用淋巴细胞后Treg细胞为（13.66±1.89）,较单用雷帕霉 素（6.23±0.80）或单用TGF-β（4.87±0.85）均明显增多（P<0.05）;雷帕霉素可以上调p-smad2 和p-smad3 的表达,并呈剂量依赖 关系。结论雷帕霉素通过上调p-smad2 和p-smad3表达来促进Treg细胞分化,进而改善EAE的神经功能缺损评分。     

沙利度胺抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎与促进Treg细胞中枢募集有关

目的研究沙利度胺对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的治疗作用及神经免疫机制。方法采用豚鼠脊髓匀浆免疫诱导SD大鼠制作EAE模型。在免疫诱导当天开始,分别给予15、30、60mg/kg沙利度胺,溶剂组给予无菌溶剂,空白对照组不予给药,每日监测行为学评分,至免疫诱导的第20天统一处死。常规病理染色检测中枢炎症水平,流式细胞术检测中枢CD4+T细胞浸润水平以及CD4+CD25+Treg细胞比例,Elisa检测血清INF-γ与TNF-α蛋白浓度。结果与溶剂组比较,给予15mg/kg沙利度胺大鼠EAE行为学评分、中枢炎症程度、CD4+T淋巴细胞浸润水平,血清INF-γ浓度均有下降趋势但差异无统计学意义（P＞0.05）,而TNF-α浓度下降差异有统计学意义（P＜0.05）。给予30、60mg/kg沙利度胺均可使行为学评分下降,中枢炎症减轻,中枢CD4+T细胞浸润减少,血清INF-γ,TNF-α浓度降低。流式细胞术还发现沙利度胺可促进中枢Treg比例上调,差异有统计学意义。结论沙利度胺对大鼠EAE的治疗作用可能与促进Treg细胞向中枢募集有关。     

C57BL/6J小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立及其病理特征

目的 探讨C57BL/6J小鼠建立实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的可能性及其发病特点.方法 使用PLP139-151抗原及其C57BL/6J小鼠自制脑脊髓匀浆(spinal cord homogenate,SCH)免疫C57BL/6J小鼠,使用完全福(氏)免疫佐剂为免疫佐剂,并在尾静脉注射百日咳杆菌,建立EAE模型,与经典的PLP139-151免疫的SJL/J小鼠EAE模型进行对比.结果 PLP139-151免疫C57BL/6J小鼠仅有一只小鼠表现为尾部张力明显降低;自制SCH免疫C57BL/6J小鼠可见明显脱髓鞘改变.与PLP139-151免疫SJL/J小鼠组相比发病率较低(P<0.05),神经功能评分比较没有明显差异(P>0.05),但发病时间长于PLP139-151免疫SJL/J小鼠组(P<0.05).结论 SCH免疫C57BIJ6J小鼠的EAE动物模型,主要表现为急性单相病程,从临床表现和病理学特点来看符合人类MS的病理特点,值得在以后的研究中进一步研究探讨.     

补肾益髓胶囊对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠大脑内BDNF和Nogo A的影响

目的 观察补肾益髓胶囊对EAE小鼠大脑内脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）和勿动蛋白（Nogo A）表达的影响，探讨本方促进EAE小鼠轴突损伤修复再生的可能机制。方法 小鼠背部皮下注射抗原MOG_35-55，诱导EAE模型。每天观察小鼠的体质量变化和神经功能评分，发病第18天（发病急性期）和第40天（发病缓解期）取小鼠大脑，HE染色观察其病理改变，用免疫组化（immunohistochemistry， IHC）法测定小鼠大脑中BDNF和Nogo A的变化。结果 补肾益髓胶囊明显减轻病灶部位的炎性细胞浸润，明显增加不同时间点BDNF在大脑皮层（P<0.01）、脑室下（P<0.01）及侧脑室旁（P<0.01）的表达，并且可以减少Nogo A在大脑上述不同部位的表达（P<0.05，P<0.01）。结论 补肾益髓胶囊的神经保护作用机制可能与其能够促进神经营养因子BDNF及降低抑制因子Nogo A的表达相关。     

二次免疫诱导大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型的建立

目的　建立一种新的可靠的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠模型制备方法,为人类多发性硬化实验研究提供理想模型。方法　用豚鼠全脊髓生理盐水匀浆 完全福氏佐剂制成免疫抗原,主动免疫Wistar大鼠,14 d后用豚鼠全脊髓生理盐水匀浆 不完全福氏佐剂再次免疫。结果第1次免疫后7 d左右,所有大鼠出现食量、活动减少;在第2次免疫后6-15 d,部分大鼠出现肢体无力、瘫痪,脑组织切片HE染色可见炎性细胞浸润和白质丰富区广泛肿胀变性。结论二次免疫诱导Wistar大鼠EAE病情严重,发病率高,病情及病理更接近人类多发性硬化症。本方法操作简单,对非敏感动物制备EAE模型也有较满意的效果。     

Fasudil对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠致脑炎性T细胞的免疫调节作用

目的：探讨法舒地尔(Fasudil)修饰的脾单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的疗效及可能的分子机制。方法：雌性C57BL/6小鼠采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35–55诱导,建立主动免疫EAE模型,免疫后第9天制备脾MNCs,和/无Fasudil培养。作用72 h后收集上述细胞,检测T细胞亚群的变化、Rho激酶(Rho kinase,ROCK)活性和细胞因子水平;以5×107个细胞/只小鼠腹腔注射诱导,建立被动转移EAE模型,并将小鼠分为PBS-MNCs组和Fasudil-MNCs组,每组8只。观察各组小鼠临床评分和体质量变化。结果：免疫第9天EAE小鼠脾致脑炎性MNCs可通过被动转移实验诱导EAE模型的建立,而体外Fasudil修饰的MNCs不能诱导EAE的发生;与PBS-MNCs组相比,Fasudil-MNCs组小鼠体质量减轻较少(P<0.05)。体外实验显示：Fasudil处理的MNCs ROCK活性降低(P<0.01);Fasudil可抑制IFN-γ和IL-17的CD4+T细胞比例(IFN-γ：P<0.01;IL-17：P<0.05),并增强TGF-β和IL-10的CD4+T细胞分泌(均P<0.001);此外,Fasudil可降低细胞因子IL-17水平(P<0.001)和增强细胞因子IL-10分泌(P<0.05)。结论：Fasudil介导的细胞治疗通过抑制辅助性T细胞1(helper T cell 1,Th1)和Th17炎性反应,促进Th2免疫调节作用,影响EAE的发生和发展。     

SPK1基因转染脂肪间充质干细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的治疗效果及对辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的影响

目的考察SPK1基因转染脂肪间充质干细胞(ADMSC)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的治疗效果及对辅助性T细胞17/调节性T细胞(Th17/Treg)平衡的影响。方法采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白_35-55对小鼠进行EAE诱导,将44只小鼠随机分为4组:空白对照组(NC组)、模型组(EAE组)、ADMSC组和ADMSC-鞘氨醇激酶1(SPK1)组。在免疫后40 d时,对小鼠进行脑与脊髓的病理学观察、脑组织Th17/Treg相关炎症指标检测、脑和脊髓组织中白细胞介素17和叉头框蛋白P3蛋白表达检测以及脾脏免疫细胞的流式细胞术分析。结果免疫后40 d时,EAE组小鼠脑和脊髓组织发生严重炎性细胞浸润髓鞘脱失严重,ADMSC组与ADMSC-SPK1组脱髓鞘和轴突损伤得到改善;与EAE组比较,ADMSC组和ADMSC-SPK1组的脑组织IL-17A(Z=1.021,P=0.017;Z=1.193,P=0.009)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(Z=2.540,P=0.004;Z=3.005,P=0.006),与ADMSC组比较,ADMSC-SPK1组的脑组织IL-1...     

补肾活血方对激素性股骨头坏死大鼠BMSCs分化影响的研究

目的 探讨补肾活血方含药血清对激素性股骨头坏死大鼠股骨近端骨髓间充质细胞体外分化的影响.方法 建立激素性股骨头坏死大鼠模型后,提取股骨近端骨髓单个核细胞,随机分为4组培养,空白血清对照组(A组)、补肾活血方含药血清低(B组)、中(C组)、高(D组)浓度组,分别加入重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)诱导下的骨髓间充质细胞的培养体系,观察各组的细胞形态学、细胞内ALP含量及TGF-β基因表达.结果 补肾活血方含药血清能增强rhBMP-2的活性,促进股骨近端骨髓体外成骨细胞的分化增殖(P＜0.01),促进分化中的骨髓间充质细胞表达TGF-β1 mRNA(P＜0.01).结论 补肾活血方通过增强rhBMP-2活性及TGF-β1 mRNA的表达在骨坏死的修复中起关键作用.