人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经元的实验研究

目的 探讨人脐血干细胞定向分化为多巴胺(DA)能神经元的最佳诱导条件.方法 体外分离、原代培养人脐血干细胞,流式细胞仪检测其表面标志,分别以EGF bFGF、ATRA、ATRA EGF bFGF、纹状体条件培养液、纹状体星形胶质细胞条件培养液对其进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态的变化.应用免疫荧光染色技术检测DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 比较各组对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用,纹状体星形胶质细胞条件培养液＞纹状体条件培养液＞ATRA EGF bFGF组＞ATRA组＞EGF bFGF组＞对照组.结论 纹状体组织对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用优于其他各组,并且此作用可能主要源于纹状体的星形胶质细胞.     

影响大鼠胚胎多巴胺能神经元原代培养因素的研究

目的　试图通过方法改进获得高纯度原代多巴胺能神经元 ,并研究 Matrigel及多聚左旋赖氨酸(poly- l- lysine,PL L )等不同基质对于大鼠胚胎 13d中脑黑质神经元突起生长的不同作用。　方法　无菌技术取得孕 13d SD大鼠胚胎 ,采用改进的取材方法 ,得到胎鼠腹侧中脑细胞 ,以较高密度 (1× 10 5 / cm2 )分别种入由 Matrigel及 PL L作为基质的塑料培养皿中。体外培养 5 d后 ,对培养物进行 TH免疫细胞化学染色 ,测量 TH免疫反应突起的长度并计算 TH免疫反应神经元占细胞总数的比例。　结果和结论　 1.采用改进的方法 ,能够得到高纯度的多巴胺能神经元 (多巴胺神经元占培养细胞总数的比例为 15 % ) ;2 .与 PL L相比 ,Matrigel能有效地促进多巴胺能神经元突起的生长 ,但不能特异地促进中脑培养细胞的存活     

低氧环境下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞的分化

背景：有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化是神经干细胞移植治疗帕金森病的关键所在。 目的：观察低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑源性神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。 方法：体外分离培养孕12 d胚鼠腹侧中脑组织,制成单细胞悬液,在含碱性成纤维细胞生长因子和B27的无血清培养基中培养并传代,分别置于常氧(体积分数21%O₂)或低氧(体积分数3%O₂)环境下增殖5~7 d后,接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,或含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12+1 µg/L胶质源性神经营养因子。 结果与结论：低氧环境下分化10~12 d,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组,在胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

尼古丁抑制脂多糖诱导的原代多巴胺能神经元变性及相关机制

目的: 观察尼古丁对脂多糖(LPS)诱导的胎鼠中脑小胶质细胞激活的影响及对其白介素6(IL-6)分泌的影响,以探讨尼古丁对中脑多巴胺(DA)能神经元的保护机制.方法: 取孕14d SD大鼠,胎鼠中脑腹侧区组织,混合培养中脑神经元-胶质细胞,Elisa检测细胞不同时间点分泌IL-6的水平;免疫细胞化学术检测小胶质细胞特异的钙结合蛋白(Iba1)和标记DA能细胞的酪氨酸羟化酶(TH)的阳性细胞数.结果: 经LPS激活的小胶质细胞胞体增大,活化标记物Ibal表达上调;DA能细胞的数目减少,突起受损.Elisa方法测定显示10ng/ml LPS致小胶质细胞在8、24和72h分泌IL-6的量均增高;在尼古丁(100μmol/L)预处理组,小胶质细胞的激活被抑制,TH免疫阳性的多巴胺能神经元的数量增加,LPS+尼古丁组分泌IL-6的量减少,在不同时间点(8、24和72h)与LPS组比较差异均有统计学意义.结论: 尼古丁可抑制小胶质细胞的激活,保护多巴胺能神经元,抑制小胶质细胞炎性因子的释放可能是其主要保护机制.     

大鼠骨髓间充质干细胞在海马神经元培养基中的定向分化

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在大鼠海马神经元条件培养液中向神经元的分化.方法:以回收的海马神经元Neurobasal加B27作为条件培养基,DMEM加bFGF作为无血清培养基,普通Neurobasal加B27作为神经元基础培养基分别诱导第5代BMSCs 12 h和24 h;免疫细胞化学显色方法鉴定各组神经元样细胞,计数和比较各组阳性细胞阳性率.结果:经海马神经元条件培养基诱导,大鼠BMSCs能够分化为神经元样细胞,免疫细胞化学显色呈微管相关蛋白-Ⅱ(MAP-Ⅱ)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性;且阳性比例明显高于其他实验组,差异有统计学意义.结论:BMSCs在海马神经元条件培养基中可以分化为神经元样细胞,其分化效果优于传统DMEM加bFGF无血清培养基和神经元基础培养基.     

纹状体对体外培养中脑多巴胺神经元形态发育的影响

靶细胞在神经细胞的生长发育过程中起着重要的调节作用。本文通过胚胎腹侧中脑和纹状体联合培养研究纹状体对中脑多巴胺(DA)神经元形态发育的影响。纹状体(Str)和腹侧中脑(YMA)细胞悬液取自胚胎14天SD大鼠,联合培养3到14天后取出,用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化ABC法观察不同时期DA神经元的生长。与VMA单独培养相比,联合培养3天,发现细胞聚集程度较低,开始形成单层分布,培养7天TH阳性细胞数增加,多突起阳性细胞较易发现,细胞突起粗短,呈树枝状分枝。培养14天,TH阳性细胞数进一步增加,平均可达49个/25mm~2。本文对纹状体调节DA神经元生长发育的机制进行了讨论。     

BDNF、SDNF、GM_1对体外培养的多巴胺神经元的影响

本研究在体外培养的条件下研究了BDNF、SDNF、GM1对大鼠胚腹侧中脑多巴胺神经元生长发育的影响。取孕15d鼠胚腹侧中脑细胞悬液将之接种于24孔培养板中进行培养。实验分4组；对照组及分别向培养液中加入BDNF、SDNF、GM1等的三个实验组。培养7d后取出。用酪氨酸羟化酶免疫组织化学ABC法观察和比较了多巴胺神经元的生长状态。发现加入BDNF、SDNF、GM1的培养孔内的酪氨酸羟化酶阳性神经元明显增多，细胞突起的长度增加且数量增多，与单纯培养组相比均有显著性差异，但三个实验组之间无显著性差异。研究结果表明，BDNF、SDNF、GM1可促进体外培养的鼠胚腹侧中脑多巴胺神经元的存活及突起的延伸。     

一种低密度及高纯度胎鼠原代海马神经元培养方法的优化及鉴定

目的 通过将海马、皮层细胞共培养的方式建立一种低密度、高纯度、高稳定性的大鼠胎鼠原代海马神经元体外培养方法,以获取纯度更高、活力更好的原代海马神经元。方法 分离孕16～18 d SD大鼠胎鼠的海马和皮层并分别剪碎,经0.125%胰蛋白酶消化后用200目细胞筛过滤,将获得的细胞悬液以包围的形式分别接种于培养板的内层和外环上,于含10%马血清的DMEM/F12培养基中进行共同培养,4～6 h细胞贴壁后更换培养基为维持培养基培养(Neurobasal培养基+2%B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺)。通过CCK-8试剂盒检测细胞活力,利用免疫荧光染色检测海马神经元纯度。结果 海马神经元在5 d后形成纵横交错的神经网络,生长状态较好,经鉴定海马神经元的纯度高达98%,且能够稳定存活3周。结论 利用海马、皮层细胞共培养的方法可以获取高纯度、高活性、高存活率、高稳定性的胎鼠原代海马神经元,可为神经系统中海马神经元相关疾病研究提供一定的实验条件。     

大鼠大脑皮层神经干细胞培养方法比较

目的:比较不同培养基对大脑皮层神经干细胞增殖的影响,以寻找培养神经干细胞的有效方法。方法:体外分离生后24 h SD大鼠大脑皮层细胞,使用DMEM/F12+B27+bFGF、Neurobasal+B27+bFGF和Neuro-basal+B27三种培养条件,分别用悬浮培养法和贴壁培养法对细胞进行培养。免疫细胞化学技术分别以Nestin、β-TubIII和GFAP标记神经干细胞、神经元和星形胶质细胞。结果:在悬浮培养情况下,三种培养条件均诱导所培养的细胞形成神经球,经染色鉴定神经球中的细胞均表达Nestin;其中DMEM/F12+B27+bFGF培养的神经干细胞增殖速度最快(P<0.01),Neurobasal+B27培养的神经干细胞增殖效率最高(P<0.01)。在贴壁培养情况下,经染色鉴定,部分细胞表达β-TubⅢ或GFAP。结论:大脑皮层神经干细胞不适合贴壁培养,DMEM/F12+B27+bFGF条件适合大脑皮层神经干细胞体外增殖。     

Sertoli细胞对大鼠大脑皮质神经前体细胞的诱导分化作用

目的:研究Sertoli细胞对体外培养大鼠皮质神经前体细胞生长发育的促进作用,及向多巴胺能神经元分化的诱导作用.方法:将大鼠Sertoli细胞与14 d大鼠皮质神经前体细胞体外共培养,免疫细胞化学检测神经干细胞标记物巢蛋白,神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞标记物βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(GalC),及多巴胺能神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况.结果:随着共培养时间的延长,神经前体细胞中GFAP阳性细胞数量逐渐减少,而β-Ⅲ tubulin 阳性细胞数增多,并出现TH阳性神经元.结论:Sertoli细胞抑制体外培养的大鼠皮质神经前体细胞的生长,但具有显著促神经元分化作用,并能够诱导与其共培养的大鼠皮质神经前体细胞分化为多巴胺能神经元.     

大鼠胚胎中脑多巴胺神经元的分离培养与鉴定

背景：神经细胞移植治疗是最有希望治愈帕金森病的方法之一。 目的：探讨大鼠胚胎中脑多巴胺神经元分离、培养与鉴定的方法。 方法：解剖分离E14d SD大鼠胚胎中脑组织,制备单细胞悬液,以神经细胞培养液培养,观察其生长情况并进行RT-PCR和免疫组织化学鉴定。 结果与结论：在神经细胞培养液中,细胞生长良好。RT-PCR和免疫组织化学结果显示大多数细胞表达多巴胺神经元特异性分子标志。证实实验成功建立了大鼠胚胎中脑多巴胺神经元分离培养与鉴定的方法。     

GDNF激活星形胶质细胞保护PD模型大鼠黑质多巴胺能神经元

探索在胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)保护受损多巴胺(DA)能神经元过程中,星形胶质细胞的可能作用。成年大鼠右侧纹状体内注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制备Parkinson病(PD)模型。动物模型右侧黑质内注射GDNF,于注射后第7、14和21d进行动物行为学分析,行黑质节段连续冠状石蜡切片,以抗酪氨酸羟化酶(TH)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体免疫组化染色,分别显示DA能神经元和激活的星形胶质细胞,光镜观察并进行细胞计数。用免疫印迹法分析注射后第21d黑质内TH、GFAP蛋白表达量,蛋白条带用图像处理仪扫描,LabWorks软件分析处理。结果显示:动物在注射GDNF后第21d,行为学功能出现显著性恢复;TH阳性神经元数量显著增加;在检测的各时间点均可观察到大量的GFAP阳性细胞;TH、GFAP的蛋白表达量显著高于对照组。以上结果提示,黑质内注射GDNF可能通过激活了的星形胶质细胞保护PD模型大鼠黑质DA能神经元。     

纹状体星形胶质细胞诱导小鼠胚胎干细胞定向分化的研究

目的 探讨纹状体组织对胚胎干细胞向多巴胺能神经元分化的定向诱导作用，及其细胞来源和诱导方式。方法 分别用纹状体组织提取液、纹状体星形胶质细胞条件培养液和纹状体神经元条件培养液诱导胚胎干细胞定向分化，通过形态学观察和酪胺酸羟化酶(TH)免疫细胞化学检测，对细胞的分化情况进行鉴定，并对3组结果进行定量比较分析。结果 纹状体组织提取液对胚胎干细胞有明显的定向诱导作用，向多巴胺能神经元诱导分化的分化率为15％；纯化培养的纹状体星形胶质细胞条件培养液对胚胎干细胞的定向诱导作用与纹状体组织液无明显差异，分化率为15．2％；纯化培养的纹状体神经元条件培养液对胚胎干细胞向多巴胺能神经元诱导分化的作用很弱，其分化率仅为3％。结论 纹状体组织对胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化作用主要来源于纹状体中的星形胶质细胞，而这种诱导作用主要通过非接触性方式实现。     

胚鼠腹侧中脑和胚肾联合移植治疗Parkinson病的实验研究

为了提高移植多巴胺(DA)能神经元的存活率和促进神经元生长,将胚鼠腹侧中脑和胚肾联合移植入Parkinson病(PD)模型大鼠脑内,检测胚肾对移植DA能神经元的影响。先用神经毒剂6 OHDA损毁大鼠左侧中脑被盖腹侧区和黑质致密部建立PD动物模型,再将胚脑的腹侧中脑(A组)、胚脑的腹侧中脑和胚肾(B组)分别移植入左侧纹状体尾壳核,C组为空白对照。于移植后3d、1月、3月将动物处死,采用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化法观察3组动物移植部位DA能神经元的存活和生长状况。在移植部位可见B组较A组的TH阳性神经元和纤维的数量明显增多,C组的移植部位未见TH阳性神经元和纤维;A、B两组的移植针道及其周围也有TH阳性神经元和纤维;B组的TH阳性神经元数量、体积和神经纤维的密度均大于A组。移植1个月和3个月后,A、B两组大鼠的旋转行为均较C组减少(P<0. 05)。以上结果提示胚肾具有良好的神经营养作用,能促进移植DA能神经元的存活和生长。     

低氧环境下白细胞介素1β诱导中脑源性神经干细胞的分化

背景：在体外某些外来信号的调控和诱导下,神经干细胞可定向诱导分化成与受体部位细胞类型与构成相似的细胞群体,使其更容易掺入靶组织,并可满足移植所需的细胞数量,提高移植细胞的存活率。 目的：验证白细胞介素1β在低氧环境下体外诱导中脑源性神经干细胞的分化。 方法：分离孕12 d胎鼠中脑组织,培养神经干细胞、传代并鉴定。将鉴定后传代培养的中脑源性神经干细胞按分组接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和含体积分数10%胎牛血清的DMEM/ F12+白细胞介素1β培养基;分别置于常氧(体积分数21%O₂)和低氧(体积分数3%O₂)环境下诱导分化,诱导分化9-11 d后行小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶免疫细胞化学染色,检测酪氨酸羟化酶及神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率。 结果与结论：与常氧组比较,低氧组尤其是低氧+白细胞介素1β组中酪氨酸羟化酶阳性神经元的突起数目更多,且长度更为延长。孕12 d胚鼠腹侧中脑组织可以在体外培养传代、并能诱导分化成多巴胺能神经元;在低氧环境或低氧+白细胞介素1β诱导下,分化率均高于常氧组,其表型更成熟。说明在低氧或低氧和白细胞介素1β诱导下,可明显促进中脑源性干细胞分化为形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

牛膝多肽对体外培养的MPP~+诱导的大鼠多巴胺能神经元凋亡的保护作用

目的:观察牛膝多肽(achyranthes bidentatapolypeptides,ABPP)对MPP~+(1-甲基-4-苯基-吡啶离子)损伤多巴胺能神经元的保护作用。方法:原代培养大鼠胚胎中脑多巴胺能神经元,与浓度50 ng/ml的ABPP或50ng/ml神经生长因子(NGF)共同孵育6 h,加入20μmol/L MPP~+损伤多巴胺能神经元12 h。使用四甲基偶氮唑盐(methyl thiaaolyl terazolium salt color imetry,MTT)比色法测定细胞活力;采用末端标记技术(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL)检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平。结果:ABPP或NGF预处理6 h可增强多巴胺能神经元的细胞活力,抑制MPP~+损伤后多巴胺能神经元的凋亡,上调Bcl-2/Bax蛋白的表达水平。ABPP对大鼠多巴胺能神经元的保护作用优于NGF。结论:与NGF相比,ABPP发挥了更好的拮抗MPP~+对多巴胺能神经元损伤的作用,其机制可能与上调Bcl-2/Bax蛋白的表达水平相关。     

星形神经胶质细胞对PC12细胞生长发育的影响

在神经系统的生长发育过程中 ,星形胶质细胞对神经元生长发育的作用是一项重要的研究课题。本文以体外培养的 SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞与 PC12神经元按不同细胞数目比例 ( 5 0∶ 1～ 1∶ 1)共同培养 ,并用其制备的条件培养液培养 PC12细胞 ,用快速灵敏的 MTT比色法测定 PC12神经元的细胞活力 ,用光学相差显微镜观察 PC12细胞形态学变化。结果显示 ,星形胶质细胞条件培养液可增强 PC12细胞活力 ( MTT测定的 OD值由 0 .2 5 5± 0 .0 12提高到 0 .5 10± 0 .0 3 6,P<0 .0 0 1,且细胞折光性较对照组强 ) ,却不能促使 PC12神经元突起的生出。将星形胶质细胞与 PC12细胞按 3 0∶ 1～ 1∶ 1的比例共同培养时 ,既可提高 PC12细胞折光性和光晕又可促使其突起的生长 ;如按 5 0∶ 1～ 40∶ 1的比例共同培养时 ,只观察到提高 PC12细胞折光性和光晕 ,而无促使其突起生长发育的作用。本文结果提示 ,PC12神经元细胞活力的提高与星形胶质细胞分泌到条件培养液中的可溶性因子有关 ,而 PC12神经元突起生长发育可能是和与星形胶质细胞的直接接触以及二者的细胞数目比有关。     

黑质纹体系多巴胺神经元的发育与再生的关系

取不同头臀长(CRL)10～22mm(E13～18)鼠胚腹侧中脑制成悬液,分别移植至帕金森氏病模型鼠去多巴胺(DA)神经侧纹状体中。发现用CRL为10～16mm(E13～15)胚脑为供体的受移植鼠行为效应和移植区DA神经元存活情况远较以CRL为17～22mm供体为佳。用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化ABC法规察了不同胚龄(E_(13)～P_0)黑质纹体系DA神经元的形态和分布,发现CRL10～16mm(E13～15)时TH阳性细胞位于Sylvius导水管腹侧,此时DA细跑开始分化,至胚CRL17mm时TH阳性细胞已迁移至被益腹外侧,并大部分化出长突起,至出生时分化及迁移基本完成。本文讨论了DA神经元发育和其在受体脑内再生的关系。     

尼古丁对Parkinson小鼠黑质多巴胺能神经元及小胶质细胞的影响

为探讨尼古丁对多巴胺能神经元的保护作用,本研究采用尼古丁(0.25mg/kg)预处理C57BL/6J小鼠,再给予1-甲基-2-乙基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP;20mg/kg)诱导Parkinson病(PD)小鼠模型。通过行为学检测和中脑黑质致密部(SNc)的酪氨酸羟化酶(TH)以及OX-42的免疫组织化学染色,观察了尼古丁对PD小鼠的行为以及黑质多巴胺能神经元和小胶质细胞的影响。结果显示:经尼古丁预处理可以明显减轻PD小鼠的行为障碍,增加TH免疫阳性的多巴胺能神经元的数量,并且可以抑制SNc内小胶质细胞的增生。本研究结果提示,尼古丁可保护多巴胺能神经元,而抑制小胶质细胞的增生可能是其作用机制。     

无血清培养条件下诱导胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向分化的实验研究

目的 寻求无血清、无饲养层细胞存在的情况下，胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化的最佳条件。方法 采用阶段诱导的方法，在不同阶段加入不同的生长因子，对新近分离的胚胎干细胞进行分化培养。首先向无血清培养液中分别加入bFGF和LIF，实现由胚胎干细胞向神经前体细胞的定向分化，通过巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定；在此基础上，撤除bFGF和LIF，加入B27无血清培养基、IL-1后继续培养，实现由神经前体细胞向多巴胺能神经元的定向诱导分化；通过酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色对多巴胺能神经元进行鉴定。结果 有85％的细胞团呈nestin免疫阳性着色，多巴胺能神经元的分化比率为13％，较多巴胺能神经元的自然分化比率(4％)有明显提高。结论 在无血清、无饲养细胞的情况下，我们采用阶段诱导的方法，在不同的阶段加入不同的生长因子，可有效诱导多巴胺能神经元的分化，使胚胎干细胞的诱导分化过程更易于操作。