炎症应激通过激活mTOR通路诱导THP-1巨噬细胞泡沫化的实验研究

目的研究脂多糖(LPS)诱导的炎症应激是否通过激活m TOR通路,增加SCAP/SREBP2表达,干扰SCAP/SREBP2负反馈调控,增加THP-1巨噬细胞对非修饰低密度脂蛋白胆固醇(LDL)摄取,导致泡沫细胞形成。方法诱导分化成功的THP-1源性巨噬细胞在无血清培养基中培养4 h后,分为对照组(5 mg·L~(-1)LDL)、炎症刺激组(5 mg·L~(-1)LDL+200μg·L~(-1)LPS)、炎症+雷帕霉素组(5 mg·L~(-1)LDL+200μg·L~(-1)LPS+10μg·L~(-1)Rapamycin)。以上各组细胞培养24 h后收获。油红O染色法检测各组细胞内脂质沉积情况,Real-time PCR法检测LDLr、SREBP2、SCAP、S6K1和m TOR mRNA水平,Western blot法检测LDLr、S6K1、mTOR蛋白表达,激光共聚焦法检测SCAP在内质网与高尔基体间的转位情况。结果油红O染色发现,炎症应激增加THP-1巨噬细胞内脂质沉积,雷帕霉素抑制炎症应激诱导的脂质聚积。Real-time PCR检测显示,炎症应激上调THP-1巨噬细胞LDLr、SREBP2、SCAP、S6K1和mTOR mRNA水平(P<0.05),雷帕霉素减少炎症应激诱导的LDLr、SREBP2、SCAP、S6K1和mTOR mRNA水平升高(P<0.05)。Western blot检测发现,炎症应激上调LDLr、S6K1和m TOR蛋白表达(P<0.05),雷帕霉素减少炎症应激诱导的LDLr、S6K1和mTOR蛋白表达水平升高(P<0.05)。激光共聚焦检测发现,炎症应激增加SCAP/SREBP2从内质网转位到高尔基体,雷帕霉素则抑制炎症应激诱导的SCAP/SREBP2复合物从内质网转位到高尔基体。结论炎症应激通过激活mTOR通路,上调SCAP/SREBP2表达,致SCAP/SREBP2复合体转位至高尔基体异常增加,LDLr表达上调,致使胆固醇聚积于细胞内,泡沫细胞形成。雷帕霉素能够逆转炎症应激诱导mTOR通路激活,减少细胞内胆固醇沉积,提示炎症应激状态下,mTOR可能是泡沫细胞形成的关键通路。     

罗格列酮对人单核巨噬细胞THP-1中胆固醇代谢的影响机制研究

目的:研究罗格列酮(RG)对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的人单核巨噬细胞THP-1源性泡沫细胞中胆固醇代谢的影响机制。方法:将THP-1巨噬细胞分为空白对照组、oxLDL(100 mg.L-1)组和oxLDL(100 mg.L-1)+RG(10μmol.L-1)组,后2组先加oxLDL培养48 h,最后1组再加RG培养48 h,采用高效液相色谱法检测每组细胞内游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)的含量,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法分别检测每组细胞中三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ABC)A1、ABCG1 mRNA及蛋白的表达情况。结果:与空白对照组比较,oxLDL组FC、CE含量明显升高,ABCA1、ABCG1 mRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.01);与oxLDL组比较,oxLDL+RG组FC、CE含量明显降低,ABCA1、ABCG1 mRNA及蛋白表达均明显升高(P<0.01)。结论:RG可能通过上调THP-1巨噬细胞ABCA1、ABCG1的表达,减少FC在细胞内的蓄积,促进细胞内胆固醇代谢,进而抑制动脉粥样硬化的形成。     

木樨草素通过抑制miR-142-3p降低LPS诱导的肺泡巨噬细胞损伤

摘要：目的:探讨木樨草素对脂多糖（LPS）诱导的肺泡巨噬细胞损伤的影响及其可能作用机制。方法:采用1 mg·L-1的LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞NR8383建立细胞损伤模型,并用不同剂量(0.025,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4μg·ml-1)的木樨草素处理NR8383细胞。实验分为对照组、LPS组(1 mg·L-1)、LPS(1 mg·L-1)+木樨草素低、中、高剂量组(0.1,0.3,0.9μg·ml-1)、LPS(1 mg·L-1)+anti-miR-NC组、LPS(1 mg·L-1)+miR-142-3p inhibor组、LPS(1 mg·L-1)+木樨草素(0.9μg·ml-1)+miR-142-3p mimic组;采用MTT法检测木樨草素对NR8383细胞存活率的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）的水平;qRT-PCR法检测miR-142-3p的表达量;Western blot检测半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（Caspase3）、Cleaved-Caspase3蛋白表达量。结果:随着木樨草素浓度的升高,LPS组细胞存活率升高,而对照组细胞存活率无明显变化;与对照组比较,LPS组细胞凋亡率、TNF-α和IL-1β的水平、miR-142-3p的表达量、Caspase3、Cleaved-Caspase3蛋白表达升高（P<0.05）;与LPS组比较,LPS+木樨草素低、中、高剂量组细胞凋亡率、TNF-α和IL-1β的水平、miR-142-3p的表达量、Caspase3、Cleaved-Caspase3蛋白表达降低（P<0.05）,且呈剂量依赖性（P<0.05）;与LPS+anti-miR-NC组比较,LPS+miR-142-3p inhibor组细胞凋亡率、TNF-α和IL-1β的水平、Caspase3、Cleaved-Caspase3蛋白表达降低（P<0.05）;与LPS+木樨草素组比较,LPS+木樨草素+miR-142-3p mimic组细胞凋亡率、TNF-α和IL-1β的水平、Caspase3、Cleaved-Caspase3蛋白表达升高（P<0.05）。结论:木樨草素通过抑制miR-142-3p表达可抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞凋亡,改善炎症反应。     

氨基胍对脂多糖诱导的大鼠肺表面活性物质和肺泡巨噬细胞的影响

目的观察氨基胍(aminogunidine,AG)对脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)时程性变化的影响和对肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)的影响,探讨AG对肺损伤组织的保护作用及其机制。方法试验一:健康♂SD大鼠随机分为对照组、模型组和AG治疗组。模型组、AG治疗组静脉注射LPS(5mg·kg-1)复制内毒素性肺损伤模型。LPS3h和6h后腹腔注射AG(100mg·kg-1,AG治疗组)和生理盐水(对照组及LPS组)。原位杂交法(ISH)和Western blot法分别测定肺组织肺表面活性物质蛋白A(SP-A)mRNA及蛋白水平;留取肺泡灌洗液(BALF),测定BALF中的总磷脂(TPL)和总蛋白(TP)。试验二:体外分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,以LPS(终浓度10mg·L-1)损伤巨噬细胞,观察AG对肺泡巨噬细胞的影响。结果与对照组比较,大鼠肺损伤后SP-A mRNA及蛋白表达在LPS6h、9h后明显下降;BALF中TPL明显减少,TP增多。肺损伤3h用AG治疗3h后,SP-A mRNA阳性细胞表达及蛋白明显增强,BALF中TPL较LPS组相同时间点明显上升,TP降低,病理显示肺损伤减轻。体外实验显示,与正常对照组相比,LPS处理巨噬细胞后,细胞培养上清中NO、TNF-α、IL-6和LDH浓度明显增高,AG明显减少LPS所致的LDH和NO的释放,降低TNF-α和IL-6浓度。结论肺损伤后早期给予AG可通过增强肺表面活性物质表达减轻内毒素性肺损伤。AG可抑制LPS对巨噬细胞的作用。     

地拉卓对人类单核细胞株源性巨噬细胞摄取乙酰化低密度脂蛋白的影响

目的 观察地拉卓(血管扩张及抗血小板药)对人类单核细胞株(THP-1)源性巨噬细胞摄取乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的影响.方法 以不加入地拉卓为对照组,以分别加入50、100μmol·L-1地拉卓为实验组;用细胞摄取Ac-LDL及Northern印迹方法,观察地拉卓对THP-1源性巨噬细胞受体摄取Ac-LDL以及对巨噬细胞清道夫受体-A mRNA表达的影响.结果 与对照组比较,巨噬细胞对Ac-LDL结合量和降解量随地拉卓浓度的增加而被明显抑制(均P<0.01);巨噬细胞ScR-A mRNA表达随地拉卓浓度的增加而减弱.结论 地拉卓抑制THP-1源性巨噬细胞对Ac-LDL结合和降解的作用是通过抑制ScR-A mRNA的表达来实现,其对动脉粥样硬化形成早期可能具有抑制作用.     

脂多糖对B类I型清道夫受体表达的调节

目的观察脂多糖（LPS）对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞B类I型清道夫受体（sR-BI）表达和胆固醇流出的影响,并探讨核因子-κB（NF-κB）信号途径在此过程中的作用。方法THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞以LPS单独或NF-κB抑制剂对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基甲酮（TPCK）预处理后再加入LPS处理。Western blot检测sR．BI及核内NF-κBp65蛋白质的表达,液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出,高效液相色谱分析细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量。结果LPS抑制sR-BI蛋白质的表达,而增加核内NF-K-κB65蛋白质的表达,LPS使泡沫细胞细胞内胆固醇流出减少,细胞总胆固醇、游离胆固醇与胆固醇酯增加。TPCK预处理后,LPS的这种作用被部分抑制。结论NF-κB信号途径介导LPS对sR—BI表达及细胞内胆固醇流出的抑制作用。     

香青兰总黄酮对RAW264.7巨噬细胞泡沫化及炎症反应的调控作用北大核心CSCD

目的研究香青兰总黄酮(total flavonoids of Dracocephalum moldavica L.,TFDM)对氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)泡沫化及炎症的影响,进一步阐明TFDM抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的作用机制。方法体外培养RAW264.7巨噬细胞,采用ox-LDL刺激诱导使其成为泡沫细胞,TFDM(25、50、100 mg·L^(-1))及辛伐他汀(10μmol·L^(-1))进行干预,油红O染色法观察胞内脂滴的聚集情况,CCK-8法检测细胞活力,活性氧试剂盒测定ROS的生成,实时荧光定量PCR测定细胞中NF-κB、NLRP3、caspase-1、IL-18和IL-1βmRNA的表达,免疫蛋白印迹法检测巨噬细胞中IκBα、NF-κB p65、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、IL-1β以及IL-18蛋白的表达,ELISA法检测TNF-α和IL-10的表达。结果TFDM可以减少泡沫巨噬细胞的形成,降低炎症因子IL-1β、IL-18和TNF-α的表达,增加抑炎因子IL-10的表达;并且下调NF-κB p65、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1蛋白的表达,上调IκBα的蛋白表达。结论TFDM能够减轻巨噬细胞的泡沫化,抑制炎症因子的表达,从而可能延缓动脉粥样硬化的发展进程。其作用机制可能是通过抑制NF-κB途径,减少ox-LDL诱导的RAW264.7细胞中炎症介质的产生。     

赤芍801对小鼠巨噬细胞COX-1和COX-2活性、mRNA及蛋白表达的影响

目的研究赤芍801(propyl gallate,PrG)对环氧酶(cy-c looxygenase,COX)活性、mRNA及蛋白表达的影响。方法采用基于小鼠腹腔巨噬细胞的COX-1和COX-2体外筛选模型,用钙离子导入剂(calc ium ionophore A23187)短时刺激小鼠腹腔巨噬细胞,测定培养上清液中的6酮--前列腺素F1α(6-keto-PGFlα)的量反映COX-1活性;用脂多糖(lipopolysac-charide,LPS)长时间刺激细胞,测定培养上清液中的前列腺素E2(PGE2)的量反映COX-2活性。半定量RT-PCR法检测PrG对LPS刺激的Raw小鼠巨噬细胞COX-1、COX-2 mRNA表达的影响。W estern b lot法检测PrG对LPS刺激的Raw小鼠巨噬细胞COX-1、COX-2蛋白表达的影响。结果PrG体外10,5μmol.L-1浓度下不影响6-keto-PGFαl生成(P>0.05),而在1,0.5,0.1,0.05μmol.L-1浓度下则诱导6-keto-PGF1α生成(P<0.01),并呈较好的剂量依赖性。PrG体外1,10μmol.L-1可抑制PGE2生成(P<0.05)。PrG不同浓度对LPS刺激的Raw小鼠巨噬细胞COX-1、COX-2 mR-NA表达无明显影响。PrG(100,10,1μmol.L-1)浓度下可抑制COX-2蛋白表达,但对COX-1蛋白表达无影响。结论在0.05~10μmol.L-1浓度范围内,PrG低浓度时促进6-keto-PGF1α生成,高浓度时抑制PGE2生成,提示其高浓度时抑制COX-2,低浓度时激活COX-1;不同浓度PrG对COX-1、COX-2 mRNA表达均无明显影响。PrG(1~100μmol.L-1)浓度下可抑制COX-2蛋白表达,但对COX-1蛋白表达无影响。     

瘦素对THP-1细胞泡沫化过程中ACAT-1表达的影响

目的：研究单核或巨噬细胞转分化和泡沫细胞形成过程中瘦素对人酰基辅酶A1胆固醇酰基转移酶(ACAT-1)表达的影响。方法：在体外模拟动脉粥样硬化(AS)形成过程中，运用放射性同位素标记底物法、逆转录聚合酶链反应、蛋白质免疫印迹法检测ACAT-1 mRNA和蛋白表达水平。结果：单核或巨噬细胞转分化过程中ACAT-1酶活性、蛋白及mRNA水平均升高。巨噬细胞转变为泡沫细胞过程中ACAT-1表达水平无明显变化。高瘦素血症可明显增强单核或巨噬细胞转分化和泡沫细胞形成过程中ACAT-1表达。结论：高瘦素血症可能通过增强ACAT-1表达导致动脉粥样硬化提前发生。     

葛根素对巨噬细胞基质金属蛋白酶9及其组织抑制物1表达的影响

目的 观察葛根素对巨噬细胞分泌和表达基质金属蛋白酶9(MMP-9)及其组织抑制因子1(TIMP-1)的影响.方法 将人单核细胞系THP-1来源的巨噬细胞与不同浓度的葛根素进行培养,采用RT-PCR和ELISA方法 分别检测巨噬细胞的MMP-9、TIMP-1的基凶和蛋白质表达.结果 葛根素对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导THP-1细胞MMP-9 mRNA及其蛋白质表达作用呈浓度依赖性地减少MMP-9 mRNA及其蛋白的表达,但对TIMP-1的表达无影响.结论 葛根素可以通过调节巨噬细胞分泌MMP-9途径发挥稳定动脉粥样硬化斑块的作用.     

Oxidized LDL upregulated ATP binding cassette transporter-1 in THP-1 macrophages

INTRODUCTIONOxidized lipid signaling in macrophages is centralto the pathogenesis of atherosclerosis[1]. Exposure ofmacrophages and other vascular cells to oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) leads to complex changesin gene expression that are collectively thought to influ-ence the development of the atherosclerotic lesion[2].Using two-dimensional gel electrophoresis, the overallprotein map in U937 control cells and U937 foam cellswas obtained. Compared with U937 cells, 37 spots…     

格列本脲对巨噬细胞载脂蛋白E分泌的影响

目的： 通过研究格列本脲对巨噬细胞载脂蛋白E(apo E)分泌的影响，评价格列本脲在2型糖尿病治疗中的应用价值。方法：培养THP 1单核细胞并诱导其分化成为THP 1巨噬细胞；通过负载胆固醇制备巨噬细胞源性泡沫细胞。将格列本脲与THP 1巨噬细胞和泡沫细胞一起孵育， 孵育结束时分别通过酶联免疫测定和Northern blot测定格列本脲对细胞apo E的产生、分泌以及apo E基因表达的影响。结果：格列本脲明显减少THP 1巨噬细胞的apo E分泌(P＜0.01)，对巨噬细胞源性泡沫细胞亦表现出同样作用，同时不改变巨噬细胞和泡沫细胞内apo E含量和apo E mRNA表达水平。 结论：格列本脲影响巨噬细胞apo E的净分泌，这可能不利于2型糖尿病患者血管壁的脂质代谢，尤其不宜于治疗已经存在血脂异常的糖尿病患者。     

格列本脲对泡沫细胞形成的影响

目的:研究格列本脲(glibenclamide)对THP-1单核巨噬细胞形成泡沫细胞的影响及机制。方法:体外培养人THP-1单核细胞系,由佛波酯(PMA)作用使其分化为巨噬细胞,后者再由乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)进行脂质负荷转变为泡沫细胞。不同质量浓度的格列本脲单独或与Ac-LDL共同作用于上述巨噬细胞,以放射性同位素标记底物法检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)活性的变化,油红O染色法检测泡沫细胞的形成,酶比色法检测细胞中的总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量。结果:格列本脲使脂质负荷的巨噬细胞转变为泡沫细胞的数目减少,并明显抑制脂质负荷前后巨噬细胞中ACAT酶活性;随着格列本脲剂量增加,脂质负荷前后的巨噬细胞中胆固醇酯含量逐渐降低,呈剂量依赖性趋势。结论:格列本脲抑制泡沫细胞形成,其作用机制可能与其抑制ACAT酶活性和细胞中胆固醇酯含量有关。     

Atorvastatin inhibits ABCA1 expression and cholesterol efflux in THP-1 macrophages by an LXR-dependent pathway

The effect of atorvastatin on adenosine triphosphate (ATP)-binding cassette transporter A1 (ABCA1) expression and cholesterol efflux remains controversial. In an effort to clarify this issue, ABCA1 expression and apolipoprotein AI (apoAI)-mediated cholesterol efflux after atorvastatin treatment were investigated in THP-1 macrophages. Atorvastatin from 2 microM to 40 microM dose-dependently inhibited ABCA1 expression in human monocyte-derived macrophages and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-stimulated THP-1 monocytes. ApoAI-mediated cholesterol efflux was reduced in PMA-stimulated THP-1 cells treated with atorvastatin, this effect was abolished with acetylated low-density lipoprotein (LDL) pretreatment. Atorvastatin treatment also dose-dependently reduced liver X receptor alpha (LXRalpha) expression and Rho activation. Rho activation by farnysylpyophosphate (FPP) and lysophosphatidic acid (LPA) did not salvage, but further depressed, the cholesterol efflux and ABCA1 expression in the presence of atorvastatin. Without atorvastatin, Rho activation by mevalonate, FPP, and LPA diminished apoAI-mediated cholesterol efflux, and Rho activation by GTPgammaS also decreased ABCA1 messenger ribonucleic acid (mRNA) by 16%. Furthermore, Rho inhibition by C3 exoenzyme increased ABCA1 mRNA by 48% despite a 17% decrease in apoAI-mediated cholesterol efflux. LXRalpha agonists (T01901317 and 22(R)-hydroxycholesterol) prevented any reductions in cholesterol efflux or ABCA1 expression associated with atorvastatin treatment. Furthermore, Western blot analysis demonstrated the reciprocal inhibition of Rho and LXRalpha. In conclusion, atorvastatin decreases ABCA1 expression in noncholesterol-loaded macrophages in an LXRalpha- but not Rho-dependent pathway; this effect can be compromised after acetylated LDL cholesterol loading.     

甲壳低聚糖对THP-1源性巨噬细胞脂质转运相关基因表达的影响

目的观察甲壳低聚糖(COS)对离体培养的THP-1源性巨噬细胞脂质转运相关基因表达的影响,以初步探讨COS降低血脂的可能分子机制。方法离体培养人THP-1单核细胞,诱导分化成巨噬细胞后,用100μg/mL的COS处理THP-1源性巨噬细胞6,12,24,48 h,运用半定量RT-PCR方法检测其LDL受体、SR-BⅠ、ABCA1和CD36mRNA表达水平的变化。结果COS处理THP-1源性巨噬细胞24和48 h后,LDL受体mRNA的表达与对照组比较分别下调了15.6%(P<0.05)和30.7%(P<0.01);处理6,12,24,48 h后,SR-BⅠmRNA的表达与对照组比较分别上调了14.7%,23.0%,14.6%(P<0.05)和33.9%(P<0.01);处理6和12 h后,ABCA1 mRNA的表达与对照组比较分别上调了12.6%和14.5%(P<0.05);处理6和12 h后,CD36 mRNA的表达与对照组比较分别下调了25.5%和10.2%(P<0.05)。结论通过细胞离体培养实验表明,COS具有的降低血脂作用可能与其能上调巨噬细胞中AB-CA1和SR-BⅠmRNA表达水平以及降低LDL受体和CD36 mRNA水平有关。     

血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂用于脓毒症大鼠的实验研究

目的观察血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂氯沙坦对内毒素诱导的脓毒症大鼠的干预效果。方法 SD大鼠30只随机分成生理盐水对照组(Control组,n=10)、脓毒症组(LPS组,LPS 12 mg·kg-1,iv,n=10)和氯沙坦组(LOS组,氯沙坦50 mg·kg-1 ip,30 min后LPS 12 mg·kg-1 iv,n=10)。LPS注射6 h后抽血检测一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)及IL-1β、TNF-α血浆浓度,随即处死大鼠,分离胸主动脉,测定各组胸主动脉核因子κB抑制蛋白(inhibitor ofNF-κB,IκB)mRNA和蛋白的表达。结果 LPS组NO、MDA、IL-1β及TNF-α血浆浓度较对照组明显升高(P<0.01),经LOS干预后上述指标明显降低(P<0.01);大鼠胸主动脉IκB mRNA和蛋白在LPS组中的表达较对照组均明显降低(P<0.01),而LOS组中IκB的mRNA和蛋白表达较LPS组明显回升(P<0.01)。结论血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂氯沙坦对内毒素诱导的脓毒症大鼠有抗炎作用。