应用PCR－ASO方法对广东地区非缺失型HbH病的检测

为筛查广东地区ＨｂＨ病的基因型，用两对引物多聚酶链反应（ＰＣＲ）选择性扩增α２珠蛋白基因外显子Ⅲ３１８ｂｐＤＮＡ片段和３２７ｂｐＤＮＡ片段，从７２例广东籍，经血液学确诊为ＨｂＨ病的ＤＮＡ标本中筛查出非缺失型ＨｂＨ病１０例，占ＨｂＨ病的１３．９％；缺失型ＨｂＨ病６２例，占ＨｂＨ病的８６．１％。非缺失型ＨｂＨ病α２珠蛋白基因外显子Ⅲ３１８ｂｐＰＣＲ产物，用两对寡核苷酸探针（ＨｂＣＳ－正常和Ｈｂ广西－正常）进行斑点杂交，检出ＨｂＣＳ８例，Ｈｂ广西２例。提示广东地区ＨｂＨ病以基因缺失型为主，非缺失型ＨｂＨ病基因突变大多发生在α２基因     

非缺失型HbH病因突变类型的研究

采用选择性聚合酶链反应扩增技术及等位基因特异寡核苷酸探针斑点杂交，分析了１２例经血液学检测及基因图谱分析确认为非缺失型ＨｂＨ病的样品。结果显示，１２例非缺失型ＨｂＨ病样品中，Ｈｂ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｐｒｉｎｇ８例（６６．７％），Ｈｂ广西２例（１６．７％），２例为未知突变类型（１６．７％），对这２例未知样品的ａ２基因外显子Ⅲ及其旁侧的突变热点区域进行了扩增、克隆和测序，结果发现这２例的ａ２基因密码     

非缺失型HbH病基因突变类型的研究

采用选择性聚合酶链反应扩增技术及等位基因特异寡核苷酸探针斑点杂交，分析了１２例经血液学检测及基因图谱分析确认为非缺失型ＨｂＨ病的样品。结果显示，１２例非缺失型ＨｂＨ病样品中，ＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇ８例（６６．７％），Ｈｂ广西２例（１６．７％），２例为未知突变类型（１６．７％），对这２例未知样品的α＿２％基因外显子ＩＩＩ及其旁侧的突变热点区域进行了扩增、克隆和测序，结果发现这２例的α＿２基因密码子１２４均有ＴＣＣ→ＴＣＧ突变，其中１例的α＿２基因３＇非编码区第３６位碱基发生Ａ→Ｃ突变。     

鉴别乙型肝炎病毒野毒株及E阴性突变株的新方法

目的同时检测乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）野毒株及２种ＨＢｅＡｇ阴性突变株（Ｅ阴性突变株）。方法用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法，以人为改变核苷酸序列的２对引物，自乙型肝炎患者血清ＤＮＡ中，同时扩增出１４８ｂｐ及１０２ｂｐ两种产物，根据限制性内切酶Ｂｓｕ３６Ⅰ和ＡｆｌⅢ对ＰＣＲ产物消化后片段长度多态性的分析，鉴别ＨＢＶ野毒株Ｍ０与２种Ｅ阴性突变株Ｍ１、Ｍ２。结果突变株Ｍ１的１０２ｂｐ扩增产物经Ｂｓｕ３６Ⅰ酶切，可产生一８２ｂｐ片段；突变株Ｍ２除１０２ｂｐ产物含Ｂｓｕ３６Ⅰ酶切点外，其１４８ｂｐ产物经ＡｆｌⅢ酶切后，可产生一１１７ｂｐ片段；野毒株Ｍ０的２种产物不含上述酶切点。用该法对３４例ＨＢｅＡｇ阴性患者进行检测，结果与寡核苷酸探针杂交完全一致。结论该方法简便、准确，为ＨＢＶ变异株的检测探索了一条非放射性的新途径。     

肺炎支原体的PCR快速检测技术在临床上的应用

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增肺炎支原体特异的１４４ｂｐ ＤＮＡ片段靶基因，检测３５４例临床疑为呼吸道感染、肺炎、支气管炎病人咽拭标本，检出阳性７４例，总阳性率为２０．９％，其中儿科患者１９１例，阳性３８例，阳性率为１９．６％；老年患者８６例，阳性２０例，阳性率２３．２％；内科患者７７例，阳性１６例，阳性率２０．７％。ＰＣＲ利用体外基因复制技术，仅用１ｈ即可将极微量的ＤＮＡ样品特异地放大几百万     

应用长片段PCR技术检测α珠蛋白基因组织的异常

目的：应用长片段多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术检测α珠蛋白基因组织的异常。方法：设计一组引物分别互补于α２珠蛋白基因上游和α１珠蛋白基因下游的特异序列，应用长片段ＰＣＲ技术对７例具有正常和异常α珠蛋白基因组织个体进行分析。结果：正常的α珠蛋白基因组织（αα）扩增片段的长度为６．４ｋｂ；右侧缺失型的α珠蛋白基因组织（α－３．７）为２．６ｋｂ；而东南亚缺失型的α珠蛋白基因组织（－－ＳＥＡ）则无任何扩增片段；右侧增多型的α珠蛋白基因组织（αααａｎｔｉ３．７）的扩增片段为１０．２ｋｂ。结论：长片段ＰＣＲ技术为α珠蛋白基因组织异常的快速检测提供了一个新的方法。     

HpaⅡ—PCR检测小儿急性白血病降钙素基因高度甲基化

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合ＨｐａⅡ限制性内切酶消化法（ＨｐａⅡ－ＰＣＲ）检测５８例急性白血病（ＡＬ）患儿降钙素（ＣＴ）基因的甲基化状态。病例组待检细胞ＤＮＡ经ＨｐａⅡ消化后，再用两对ＣＴ基因特异性引物作ＰＣＲ扩增，分别产生长度为５６６ｂｐ和１．４ｋｂ特异片段。急性淋巴细胞白血病阳性率７１．４％（２５／３５），急性非淋巴细胞白血病７８．２％（１８／２３）。敏感性达１０－３。证明ＣＴ基因５′高度甲基化是白血病细胞克隆的特异标志。本课题受卫生部、四川省人民医院出国人员基金资助     

少精不育患者的雌性激素受体基因突变分析

目的 了解雄性激素受体（ＡＲ）基因突变对少精不育症发生所起的作用。方法 利用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）对３０例少精不育患者精液标本的ＡＲ基因８个外显子分别进行扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电流和聚丙烯胺的ＣＤＧＥ电泳分析,检测基因片段的插入,缺失和点突变。结果 ３０例患者中,外显子Ａ即基因转录激活区发生点突变３例,插入突变４例共７例,突变率为２３．３％。外显子Ｈ发生缺失突变１例,约占３．３％,外显子Ｇ     

ARMS法快速鉴定中国人非缺失型α地中海贫血基因型

已报道的非缺失型α地中海贫血（地贫）基因点突变类型有３０多种,迄今在中国人中只鉴定出２种突变基因,即ＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇ（ＨｂＣＳ）和ＨｂＱｕｏｎｇＳｚｅ（ＨｂＱＳ）,以ＨｂＣＳ多见,两者共占ＨｂＨ病的４５．８％～５８．９％。用聚合酶链反...     

宫颈癌组织P16基因突变分析

探讨Ｐ１６基因突变在宫颈癌发生中的作用及基突变的机制，利用点突变检测仪，水平和垂直板电泳对Ｐ１６基因的外显子１，外显子２的ＰＣＲ扩增产物作缺失和点突变发析，结果在２９例临床宫颈癌标本中的有８例发生缺失突变，４例发生点突变，突变率为４１％，其中１例外显子１为不完全缺失突变即有低于３４３ｂｐ的扩增带，Ｐ１６基因的发突变原因是因为其含有“ＣＧ”ＤＮＡ重复顺序，易发生ＤＮＡ重组及易位和重排。     

套式PCR快速诊断新生儿巨细胞病毒感染

套式ＰＣＲ用于检测新生儿及随访ＣＩＤ患儿白细胞及尿中ＨＣＭＶＤＮＡ。两对引物序列取自ＨＣＭＶＩＥＡ基因区，第一对引物扩增７２１ｂｐ片段，第二对引物扩增１６７ｂｐ片段，后者穴居于前者之中，结果３３例可疑新生患儿检出ＣＭＶ感染２１例，７例随访患儿中４例尿或血中仍有ＣＭＶＤＮＡ存在。ＰＣＲ与病毒分离相比，既快速又敏感，尿标本用于ＰＣＲ检测ＣＭＶＤＮＡ较之血本具有检出率高，标本采取及处理均简便的优点。     

江苏徐州地区丙型肝炎病毒基因型研究

为了解本地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因型分布情况，用限制性片段长度多态性分析法（ＲＦＬＰ），对１０７便丙型肝炎患者中血清ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性的９０例进行基因型分析。分型结果表明，ＨＣＶ－Ⅱ（１ｂ）占７８．９％，ＨＣＶ－Ⅲ（２ａ）型占１８．９％，ＨＣＶ－Ⅱ／Ⅲ混合型占２．２％，提示：（１）本地区ＨＣＶ流行株基因主要为Ⅱ型，同时存在Ⅲ型与Ⅱ／Ⅲ混合型。徐州地区ＨＣＶ基因型分布符合我国ＨＣＶ基因型分布的特     

鉴别乙型肝炎病毒野菌株及E阴性突变株的新方法

同是检测乙型肝炎病毒野毒株及２种ＨＢｅＡｇ阴性空株。用聚合酶链反应方法，以人为改变核苷酸序列的２对引物，自乙型肝炎患者血清ＤＮＡ中，同时扩增出１４８ｂｐ及１０２ｂｐ两种产物，根据限制性内切酶Ｂｓｕ３６０２８１和ＡｆｌⅢ对ＰＣＲ产物消化片段长度多态性的分析，鉴别ＨＢＶ野毒株Ｍ０与２种Ｅ阴性突变株Ｍ１，Ｍ２。     

白血病细胞p16基因突变分析

目的探讨ｐ１６基因突变在白血病发生中的作用及基因突变的机制。方法利用点突变检测仪、水平和垂直板电泳对ｐ１６基因的外显子１、外显子２的ＰＣＲ扩增产物作缺失和点突变分析。结果在白血病３５例临床标本中有２２例发生缺失突变，６例发生点突变，突变率约８０％。在２２例缺失突变病例中，有１０例为不完全缺失突变即有低于外显子５０９ｂｐ的扩增产物。结论ｐ１６基因含有“ＧＣ”ＤＮＡ重复顺序，易发生ＤＮＡ重组及易位和重排。在白血病发生中起重要作用     

TthDNA聚合酶在丙型肝炎病毒RNA检测中的应用

用ＴｔｈＤＮＡ聚合酶行逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增丙型肝炎病毒（ＨＶＣ）５’端非编码序列，对２６２例肝炎患者血清进行ＨＣＶＲＮＡ测定，结果ＨＣＶＲＮＡ阳性者５３例，阳性率２０．２％。凡阳性者用酶联免疫吸附法测其抗ＨＣＶＩｇＧ，其中３０例测到抗ＨＣＶ，阳性重叠率５６％（３０／５３）；ＨＣＶＲＮＡ阳性中的１５例同时用成髓细胞瘤病毒酶行传统逆转录。套式聚合酶链反应检测对照，１４例阳性，符合率达９３．３％（１４／１５）。ＴｔｈＤＮＡ聚合酶用于ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ５’端非编码序列片段具有敏感性高、特异性强、稳定性好的优点。     

少精不育患者的雄性激素受体基因突变分析

目的了解雄性激素受体（ＡＲ）基因突变对少精不育症发生所起的作用。方法利用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）对３０例少精不育患者精液标本的ＡＲ基因８个外显子分别进行扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯胺的ＣＤＧＥ电泳分析,检测基因片段的插入,缺失和点突变。结果３０例患者中,外显子Ａ即基因转录激活区发生点突变３例,插入突变４例共７例,突变率为２３３％。外显子Ｈ发生缺失突变１例,约占３３％,外显子Ｇ处发生点突变１例,约占３３％,总突变率为３００％。结论雄性激素受体基因外显子Ａ即基因转录激活区的突变是造成少精不育的重要原因。     

在HeLa细胞中表达人βIVS-Ⅱ-nt 654C→T突变基因

目的：建立一个能表达人βＩＶＳ－Ⅱ－ｎｔ６５４Ｃ→Ｔ突变基因（β６５４基因）的ＨｅＬａ细胞模型。方法：应用长片段多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术从一例β６５４突变基因纯合子的基因组ＤＮＡ中扩增出β６５４基因全长片段，重组进ｐｃＤＮＡ３．１真核表达载体质粒中。经ＤＮＡ测序证明序列中确实含有β６５４突变后，将重组表达质粒用脂质体方法转化ＨｅＬａ细胞，用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测β６５４突变基因在转染细胞中表达的ｍＲＮＡ。结果：该重组表达质粒能在ＨｅＬａ细胞中转录β６５４突变基因，并剪接成正常和异常两种ｍＲＮＡ（对应于１８３ｂｐ和２５６ｂｐ两种ＲＴ－ＰＣＲ产物），而对照组无扩增条带出现。结论：重组表达质粒转化的ＨｅＬａ细胞能表达β６５４基因。     

应用限制性内切酶分析PCR产物快速诊断Hb CS基因突变

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）选择性扩增包括ＨｂＣＳ突变（ＴＡＡ→ＣＡＡ）位点在内的ａ２珠蛋白基因片段，利用与该点突变密切相关的天然Ｔｒｕ９１位点和由ＰＣＲ引物介导出和人工ＨｉｎｆＩ位点的变化可识别ＨｂＣＳ突变等位基因和野生型等位基因。ＰＣＲ产物直接经Ｔｒｕ９１或ＨｉｎｆＩ消化及电泳分析后即可对样品ＤＮＡ中是否存在ＨｂＣＳ空变及其基因型作出诊断。此法简便、省时，可用于基因筛查和产前诊断。     

聚合酶链反应用于进行性脊髓性肌萎缩的诊断

目的了解儿童期发作的进行性脊髓性肌萎缩（ＳＭＡ）患者的运动神经元存活基因（ＳＭＮ）的缺失，探讨聚合酶链反应限制性片段长度多态性（ＰＣＲＲＦＬＰ）技术用于检测ＳＭＡ疾病的诊断价值。方法应用ＰＣＲＲＦＬＰ技术对１０例拟诊为ＳＭＡ患者、６个家系的２０例非ＳＭＡ成员及３０例正常人的ＳＭＮ基因外显子７和８进行了检测。结果１０例ＳＭＡ可疑患者中９例（９０％）有ＳＭＮ基因缺失，其中仅外显子７或８缺失各为１例。家系其他成员及对照组均无ＳＭＮ端粒基因缺失。结论用ＰＣＲＲＦＬＰ法对高度可疑ＳＭＡ的病例进行诊断，具有较高敏感性和特异性，简便易行     

不同片段的Dig－HBV－DNA探针在检测血清HBV－DNA的比较

本文运用分子克隆技术、随机引物法用非放射性Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记制备ｐＢＲ３２２－ＨＢＶ－ＤＮＡ全基因探针（７．５ｋｂ）、单纯ＨＢＶ－ＤＮＡ全基因探针（３．２ｋｂ）及经ＢｇＬⅡ限制性内切酶切割后片段ＨＢＶ－ＤＮＡ探针（２．４ｋｂ）。通过检测１３０份血清ＨＢＶ－ＤＮＡ，比较三种探针的敏感度和特异性。