兔子宫平滑肌细胞的原代培养与鉴定

目的研究子宫平滑肌细胞(MSMC)的培养方法及一些生物学特性。方法运用酶消化后组织贴块法及胶原酶Ⅰ消化法进行兔子宫平滑肌细胞的培养,并用倒置生物显微镜、HE染色进行形态学观察和用免疫组化对培养细胞进行鉴定。结果运用此两种方法成功培养了兔子宫平滑肌细胞,培养的细胞呈典型“峰-谷”样生长,HE染色观察细胞呈梭形,胞浆丰富,核大圆形或椭圆形。免疫组化S-P法检测a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(a-SMActin)表达强阳性。经传代纯化,纯度达99%以上,细胞生长特性未见异常改变。结论酶消化后组织贴块法及胶原酶Ⅰ消化法培养的兔子宫平滑肌细胞生长稳定性好,培养与纯化能同步进行,方法简便,经济。     

两种方法分离新生大鼠颅骨成骨细胞纯度和活性的比较

目的比较预消化组织块培养法与传统组织块培养法分离的新生大鼠颅骨成骨细胞纯度和活性的差异。方法无菌条件下取新生大鼠颅骨骨片,分传统法和预消化法进行培养。预消化法先以0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA预先消化,再按传统组织块培养法培养,观察细胞移出时间,采用Gomori钙钴法对原代细胞及纯化后细胞进行鉴定,对比两种方法获得的成骨细胞纯度。并测定第1、2代成骨细胞培养第10d胞浆内碱性磷酸酶活性。结果预消化法约第3d开始细胞自骨片移出,传统法约第5d开始细胞移出。两种方法分离的原代细胞碱性磷酸酶染色阳性率分别为(87.83±2.34)%以及(82.88±3.14)%,差异有统计学意义(P<0.05)。纯化后成骨细胞染色阳性率分别为(90.71±3.15)%以及(90.17±2.97)%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法获得的第1、2代成骨细胞培养第10d碱性磷酸酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论预消化组织块培养法细胞移出时间早,且所分离的原代细胞中成骨细胞纯度高。经纯化后成骨细胞纯度和活性与传统组织块培养法相似。     

人子宫肌瘤细胞原代培养方法的比较研究

目的:比较体外培养人子宫肌瘤细胞组织块法和胶原酶消化法的优缺点,探索子宫肌瘤细胞原代培养的最佳方法,为在子宫肌瘤生理和病理等方面的研究提供一种更有效、简便的细胞培养技术。方法:采用组织块法和胶原酶消化法对人子宫肌瘤组织进行体外培养,运用光学倒置显微镜、HE染色观察细胞生物学特性,免疫荧光法进行细胞鉴定。结果:倒置显微镜及HE染色观察两种细胞的形态均多成梭形,平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色均呈阳性。结论:组织块培养法与胶原酶消化法作为人子宫肌瘤细胞体外培养的两种方法,均可成功建立子宫肌瘤细胞有限细胞系。通过比较发现,消化法虽相较于组织块法方法稍复杂,但具有短期内可获得大量细胞且细胞纯度较高的优势。     

不同培养方法对牙周膜细胞生物学特性的影响

目的探讨酶消化法和组织块法是否影响牙周膜细胞的特性。方法培养牙周膜细胞,检测克隆形成能力及细胞周期分析,Stro-1的表达,实时定量RT-PCR检测。结果酶消化法培养的PDLCs+G2M明显高于组织块法的PDLC;酶消化法培养的PDLC克隆形式能力明显高于组织块法培养的PDLC;酶消化法培养的PDLC Stro-1的表达明显高于组织块法培养的PDLC;酶消化法培养的PDLC成骨标志物的表达明显高于组织块法培养的PDLC。酶消化法培养的牙周膜细胞具有更强的增殖能力和间充质干细胞含量更多,成骨标志物表达更强。结论酶消化法和组织块法影响牙周膜细胞的某些特性。     

4种不同方法培养小鼠阴道粘膜干细胞的比较

目的探讨4种不同方法体外分离、培养小鼠阴道粘膜干细胞(VMSCs)所得结果的差异,确定最适合体外培养VMSCs的方法。方法选择组织块培养法、胰酶消化培养法、胶原酶消化培养法、胰酶和胶原酶混合培养法对小鼠VMSCs进行原代培养,并通过HE染色、SP免疫组化法鉴定VMSCs,分析4种方法的优劣。结果 4种培养法中,胶原酶消化培养法细胞生长很差,无法得到VMSCs;组织块培养法培养时间较长,培养出的细胞包含成纤维细胞较多;单纯胰酶消化培养法,可获取较单一的VMSCs,但细胞活性相对较差;只有胰酶、胶原酶混合培养法,在适当的比例和浓度时,可发挥最佳作用,获取数量多、较纯的VMSCs。且经HE染色、免疫组化法鉴定结果均显示培养出的细胞即是VMSCs。结论 4种方法中有3种体外分离培养VMSCs的方法,均可得到VMSCs,其中以胰酶、胶原酶混合培养法效果最佳。     

大鼠体外多器官细胞共培养模型的建立

目的 建立大鼠体外多器官细胞共培养方法.方法 采用胶原酶消化法、支气管灌洗分离法、两步消化法等方法分离大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞和真皮成纤维细胞,用锥虫蓝染色法检测细胞分离成活率,用单层贴壁法分别培养;采用飞片法,将5种细胞的飞片放入同一培养皿,用体积分数为10%的FBS DMEM培养基培养7 d,用噻唑蓝(MTT)比色法比较原代细胞在单独培养和共培养时的生长情况.结果 建立的大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞、真皮成纤维细胞分离方法稳定,细胞分离成活率均达90%,其中胶原酶消化法培养肝细胞的存活率达90.3%,两步消化法培养肾细胞的细胞存活率达91.9%,心肌细胞的胶原酶消化法细胞存活率达93.0%.3～15 d的心肌细胞搏动频率比较,差异无统计学意义(P>0.05),差速贴壁法培养的肺泡巨噬细胞存活率可达90.8%,以胶原酶消化法培养的原代真皮细胞存活率达92.7%,细胞生长状态良好.5种原代细胞的多器官细胞共培养结果显示,共培养时细胞生长增殖情况良好,单独培养与共培养细胞生长曲线基本重合.结论 所建立的大鼠多器官细胞共培养方法是成功的.     

三种血管平滑肌细胞的体外培养

目的建立原代大鼠主动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法。与人、牛血管平滑肌细胞及A7R5大鼠血管平滑肌细胞株形态比较。方法健康SD大鼠1只,处死后分离中膜组织,剪细后加入培养液,在孵箱中适宜温度培养,培养后的细胞进行传代。观察细胞的生长形态及生长规律。并对细胞中表达的平滑肌肌动蛋白a(a-SMA)进行检测,鉴定所培养的细胞。同时观察人、牛血管平滑肌细胞及A7R5大鼠血管平滑肌细胞株生长形态。结果细胞a-SMA表达丰富,牛原代血管平滑肌细胞形态较为舒展,人血管平滑肌细胞培养较难生长,A7R5形态较为单一,生长稳定,易于培养。结论用组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞是一种稳定、简便可行的实验方法。     

20例人早孕绒毛滋养细胞的体外培养

目的建立快速、有效的绒毛滋养细胞体外培养的方法。方法采用0．25％胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法消化绒毛组织,用胰蛋白酶消化传代体外培养,通过光镜对培养出的细胞进行形态评价;用细胞角蛋白和波形蛋白单克隆抗体检测细胞纯度。结果联合消化法的细胞生长迅速,接种6～8d可以传代,原代细胞生长时间明显缩短,所得细胞纯度达95％。结论联合消化法是一种较有效的人早孕绒毛滋养细胞培养方法。     

人子宫平滑肌细胞的原代培养及应用

目的掌握人子宫平滑肌细胞原代培养的方法,可以籍之开展一系列的研究工作.比如进行体外药物实验,研究细胞的增殖与遗传,了解平滑肌细胞的动力学效应等许多方面.而且该方法目前在国内未见成功报道.方法用剪切胶原酶消化法分离人子宫平滑肌细胞.用DMEM和胎牛血清进行培养.传一代时用desmin和α-action单抗进行鉴定.结果经实验该法成功率高,纯度高,细胞活力好.结论用该法可以成功进行人子宫平滑肌细胞的原代培养.     

两种人早孕绒毛滋养层细胞的原代培养方法

目的:比较两种不同方法进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养的异同。方法:分别用组织块培养法和3种酶联合消化法(Ⅳ型胶原酶、低浓度胰酶及DNaseⅠ)、Ficoll 400梯度密度离心法对人早孕绒毛滋养层细胞培养。结果:两种方法进行早孕滋养层细胞的培养均获得成功,其生长率比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:组织块培养法简单易行,但细胞数量少,生长缓慢,难以完成后续实验;3酶联合消化、Ficoll 400梯度密度离心法相比较而言,可获得数量更多的活力好、纯度较高的具有不同分化功能的滋养层细胞,为进一步研究其侵袭、增殖能力等生理、病理作用提供了坚实的基础。     

膀胱无细胞基质复合阴道平滑肌细胞修复兔阴道缺损

目的探讨膀胱无细胞基质（BACM）复合阴道平滑肌细胞修复兔阴道缺损的可行性,寻求理想的阴道修复材料。方法将24只成年新西兰雌兔按随机数字表法分3组,每组8只,A组用于制备BACM和阴道无细胞基质（VACM）,分别在B、c两组新西兰兔获取1cm^2阴道前壁组织,分离培养兔阴道平滑肌细胞,免疫组化染色鉴定。以1×10^7个细胞／cm。种植于BACM和VACM上,体外培养5d后形成VACM-平滑肌细胞复合物[对照组（C组）]和BACM-平滑肌细胞复合物[实验组（c组）],用于修复兔中段阴道缺损,于移植后3、6、12周观察阴道修复情况。结果制备的BACM和VACM均为白色透明状,HE染色和扫描电镜观察为规则排列的网状胶原纤维,无细胞碎片;体外培养的阴道平滑肌细胞为梭形,呈典型的“峰和谷”样,免疫组化染色示仪-肌动蛋白阳性,种植到BACM和VACM上5h后,均可见部分细胞黏附于无细胞基质上,随时间推移,细胞逐渐增多并伸展成梭形,实验组和对照组移植后3周均可见基质表面已形成完整的上皮层,部分平滑肌细胞长入,移植后6周形成多层复合上皮,平滑肌束明显增多,移植后12周其组织结构与正常阴道组织结构相似,阴道造影证实修复部位阴道宽敞,未见明显狭窄和瘢痕形成,两组组织修复再生情况一致。结论BACM和VACM复合阴道平滑肌细胞修复阴道缺损的组织再生规律基本相同,但BACM来源广泛,具有良好的组织相容性,是一种较好的修复阴道缺损的支架材料。     

大鼠肾细胞分离制备及培养方法的比较

目的比较胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法和胶原酶、胰蛋白酶两步消化法(简称两步消化法)对大鼠肾细胞分离效果及细胞产量的影响,以及不同培养基(MEM、RPMI1640)、鼠龄(乳鼠、成年鼠)对细胞产量、质量、增殖率和乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的影响。方法分别对两组Wistar大鼠(乳鼠和成年鼠)用三种不同的消化方法制备大鼠肾组织细胞悬液,分别在MEM培养液和RPMI1640培养液中原代培养,培养48小时之后第一次传代,观察细胞质量,计算细胞产量,MTT法检测传代细胞24~48小时之间的增殖率,生化分析仪检测传代细胞第1~7天培养液中LDH漏出量。结果胶原酶消化法和两步消化法的肾细胞产量显著高于胰蛋白酶消化法(P<0.01),两步消化法的细胞质量优于胶原酶消化法,MEM培养液和RPMI1640培养液对细胞产量、增殖率和LDH漏出量的影响均无显著性差异,乳鼠的肾细胞产量显著高于成年鼠(P<0.01)。结论两步消化法对于肾细胞的分离制备尤为适合,MEM培养液和RPMI1640培养液均适于肾细胞的培养,乳鼠比成年鼠更适合肾细胞的制备。     

阿魏酸对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用研究

目的研究阿魏酸对血管平滑机细胞增殖的影响。方法采用贴块法培养人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMC);台盼兰染色法检测药物对细胞的毒性;以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察药物对血清诱导的VSMC增殖及生长的影响;以Bradford法检测细胞总蛋白含量变化;用5溴-2脱氧尿苷(BrdU)免疫酶联吸附法观察对DNA合成的影响。结果阿魏酸可逆性的延迟细胞对数生长期,影响细胞生长;有效抑制细胞的增殖活性,当阿魏酸终浓度为100μmol/L时,对细胞增殖的抑制率达到61.32%;引起细胞总蛋白的合成及BrdU的DNA掺入量下降,影响细胞周期。结论阿魏酸有效抑制血清诱导的VSMCs增殖,对以VSMCs异常增殖为靶标的动脉粥样硬化等心脑血管疾病的预防和治疗具有积极作用。     

辛伐他汀对血小板源生长因子诱导的肺血管平滑肌细胞内粘着斑及肌动蛋白细胞骨架组装的影响及意义

目的观察辛伐他汀（simvastatin）对血小板源生长因子（platelet—derived growth factor—BB，PDGF—BB）诱导的增殖细胞内粘着斑（focal adhesion，FA）蛋白及肌动蛋白细胞骨架动态组装的影响，旨在探讨辛伐他汀抑制血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖和迁移与细胞骨架变化的关系。方法以体外培养的SD大鼠血管平滑肌细胞为基础，[^3H]—TdR掺入量测定DNA合成，透射电镜观察细胞的表型状态，采用免疫细胞化学和荧光细胞化学法，观察辛伐他汀对血小板源生长因子诱导的肺血管平滑肌细胞增殖细胞内粘着斑蛋白及肌动蛋白细胞骨架组装的影响。结果血小板源生长因子受刺激后（对照组），血管平滑肌细胞[^3H]-TdR掺入量明显增加，电镜示细胞超微结构出现表型变化，血管平滑肌细胞中增殖细胞内粘着斑蛋白中的桩蛋白（paxillin）体积增大、数量增加，血管平滑肌细胞内F—actin数量明显增加，呈纵向平行排列，α—SM—actin体积缩小、数量减少。辛伐他汀可明显抑制这些生物学效应（药物干预组）。结论辛伐他汀可以抑制血小板源生长因子介导的血管平滑肌细胞内增殖细胞内粘着斑蛋白中的桩蛋白，F—actin，α-SM-actin的动态组装，进而发挥抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移的能力。     

子宫腺肌病病灶细胞的培养与鉴定

目的原代培养及鉴定子宫腺肌病病灶细胞,为研究子宫腺肌病发病机制与药效学提供新的理想实验模型。方法采用胶原酶消化法对人子宫腺肌病细胞进行原代培养,并采用免疫细胞化学技术鉴定。结果成功培养了6例子宫腺肌病细胞并均经免疫细胞化学法鉴定证实,成功率为75％;第1代与第8代细胞的生长曲线基本一致。结论胶原酶消化法培养的子宫腺肌病细胞性能稳定,后续研究可选择3～6代细胞作为药物干预模型,细胞传代后4—5天加药物干预,选择24小时作为药效学作用的检测时间点。     

余甘子中水溶性鞣质的抗动脉粥样硬化作用机制研究

目的在细胞水平证实中药余甘子(Phyllanthus Emblica L.)的两个可溶性鞣质成分Phy-13(beta-1-O-galloyl-3,6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-d-glucose)和Phy-16(1,6-di-O-galloyl-beta-d-glucose)是否具有抗动脉粥样硬化作用。方法人脐动脉内皮细胞ECV-304经ox-LDL(50 mg/l)诱导,MDA试剂盒检测Phy-13和Phy-16作用后内皮细胞培养上清液中丙二醛(MDA)的水平,MTT法检测动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖,细胞计数仪计数单核细胞和内皮细胞的黏附。结果Phy-13和Phy-16能减少内皮细胞MDA的生成,减少ox-LDL诱发的单核细胞和内皮细胞黏附,并能对抗ox-LDL诱导的动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖。结论Phy-13和Phy-16能够对抗ox-LDL诱导的动脉粥样硬化,这可能是余甘子治疗动脉粥样硬化相关疾病的重要机制之一。     

New categorization of human vascular endothelial cells by pro- vs anti-proliferative phenotypes

AIM: To integrally understand the effects of human vascular endothelial cells (VECs) on the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs). METHODS: Various kinds of human VECs of different origins were co-cultured with human aortic smooth muscle cells, a representative of human VSMCs. To exclude the irrelevant effects due to growth competition between VECs and VSMCs, the proliferation of VECs had previously been arrested via a low-dose gamma ray irradiation. To discriminately analyze the proliferation of VSMCs from that of VECs, the former cells were labeled with red fluorescent dye while the latter cells were labeled with green fluorescent dye before performing co-culture experiments. After 4 d, total cells were harvested and subjected to flow cytometric analyses. Decrements in red fluorescence intensities due to proliferation-mediated dilutions were measured and mathematically processed using a specific software to quantitatively evaluate the proliferation of VSMCs. The findings obtained from the flow cytometry-based analyses were further validated by microscopic observations. RESULTS: Commercially available primary cultured human VECs exclusively promoted VSMC proliferation regardless of their tissue origins and we termed these pro-proliferative VECs as “type-I”. By contrast, VECs freshly generated from human bone marrow-derived endothelial progenitors cells or human pluripotent stem cells including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells suppressed VSMC proliferation and we termed these anti-proliferative VECs as “type-II”. Repetitive subcultures as well as oxidative stress induced “type-II VECs to type-I” conversion along with an induction of Regulator of G-protein signaling 5 (RGS5). Compatibly, anti-oxidant treatments suppressed both the subculture-dependent “type-II to type-I” conversion and an induction of RGS5 gene. Immunostaining studies of clinical specimens indicated that RGS5 protein expressions in endothelial layers were low in normal arteries but they were up-regulated in pathological arteries including hypertension, atherosclerosis and autoimmune vasculitis in a dose-dependent manner. Overexpression and knockdown of RGS5 caused that “type-II to type-I” and “type-I to type-II” phenotype conversions of VECs, respectively. CONCLUSION: Human VECs are categorized into two types: pro-proliferative RGS5^high VECs (type-I) and anti-proliferative RGS5^low VECs (type-II).     

自然流产胚胎绒毛细胞培养方法比较

目的:探讨自然流产胚胎绒毛细胞培养的简单有效方法。方法:取57例早期自然流产胚胎绒毛组织分别采用改良组织块培养法和酶消化法进行培养。结果:改良组织块培养法培养成功51例(89.5%),酶消化法培养成功42例(73.7%),两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:改良组织块培养法用于自然流产胚胎染色体诊断简单可行,成功率高。