大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的 探讨大鼠脑微血管内皮细胞培养方法.方法 5～7d龄SD大鼠脑皮质用胶原酶消化得到脑微血管段后,接种于培养瓶进行原代培养.培养的细胞采用倒置显微镜进行形态学观察,免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原,MTT法测定细胞活力.结果 倒置显微镜下细胞呈单层“铺路石样”排列的典型特征;Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测得阳性细胞率达95％...     

两种方法分离新生大鼠颅骨成骨细胞纯度和活性的比较

目的比较预消化组织块培养法与传统组织块培养法分离的新生大鼠颅骨成骨细胞纯度和活性的差异。方法无菌条件下取新生大鼠颅骨骨片,分传统法和预消化法进行培养。预消化法先以0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA预先消化,再按传统组织块培养法培养,观察细胞移出时间,采用Gomori钙钴法对原代细胞及纯化后细胞进行鉴定,对比两种方法获得的成骨细胞纯度。并测定第1、2代成骨细胞培养第10d胞浆内碱性磷酸酶活性。结果预消化法约第3d开始细胞自骨片移出,传统法约第5d开始细胞移出。两种方法分离的原代细胞碱性磷酸酶染色阳性率分别为(87.83±2.34)%以及(82.88±3.14)%,差异有统计学意义(P<0.05)。纯化后成骨细胞染色阳性率分别为(90.71±3.15)%以及(90.17±2.97)%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法获得的第1、2代成骨细胞培养第10d碱性磷酸酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论预消化组织块培养法细胞移出时间早,且所分离的原代细胞中成骨细胞纯度高。经纯化后成骨细胞纯度和活性与传统组织块培养法相似。     

大鼠体外多器官细胞共培养模型的建立

目的 建立大鼠体外多器官细胞共培养方法.方法 采用胶原酶消化法、支气管灌洗分离法、两步消化法等方法分离大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞和真皮成纤维细胞,用锥虫蓝染色法检测细胞分离成活率,用单层贴壁法分别培养;采用飞片法,将5种细胞的飞片放入同一培养皿,用体积分数为10%的FBS DMEM培养基培养7 d,用噻唑蓝(MTT)比色法比较原代细胞在单独培养和共培养时的生长情况.结果 建立的大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞、真皮成纤维细胞分离方法稳定,细胞分离成活率均达90%,其中胶原酶消化法培养肝细胞的存活率达90.3%,两步消化法培养肾细胞的细胞存活率达91.9%,心肌细胞的胶原酶消化法细胞存活率达93.0%.3～15 d的心肌细胞搏动频率比较,差异无统计学意义(P>0.05),差速贴壁法培养的肺泡巨噬细胞存活率可达90.8%,以胶原酶消化法培养的原代真皮细胞存活率达92.7%,细胞生长状态良好.5种原代细胞的多器官细胞共培养结果显示,共培养时细胞生长增殖情况良好,单独培养与共培养细胞生长曲线基本重合.结论 所建立的大鼠多器官细胞共培养方法是成功的.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

[目的]建立分离纯化、培养、扩增骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)鉴定的方法.[方法]采用密度梯度离心及贴壁培养相结合的方法分离、培养、扩增MSCs,并用流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD44、CD105. [结果]培养48 h后即可见呈集落生长的细胞,72 h后可见少量贴壁MSCs细胞,7 d后贴壁细胞明显增多,梭形栅栏样分布,融合度达70%以上.第3代原代培养细胞表面标志CD44+、CD105+在95%左右,CD34的表达率甚低.[结论]联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法,可以获得纯度较高的骨髓MSCs     

星形胶质细胞培养方法的改进

目的改进大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养方法,为研究星形胶质细胞的生物学作用提供实验模型。方法新生1～3d的大鼠,无菌操作下取双侧大脑皮质,机械吹打使细胞分散成悬液,差速粘附处理以去除成纤维细胞成分,细胞悬液原代培养9～14d,待细胞融合成单层并铺满瓶底后,4次消化传代,GFAP免疫组化染色鉴定星形胶质细胞。结果这种改进的星形胶质细胞培养方法,分离培养出星形胶质细胞,纯化率达95%以上。结论采用本实验改进的方法,培养的大鼠星形胶质细胞生长良好,纯度高,为后续实验对星形胶质细胞的生物学作用研究奠定实验基础。     

Wistar大鼠晶体上皮细胞原代培养及鉴定

目的 探讨Wistar大鼠晶体上皮细胞原代培养方法，在形态学方面及晶体蛋白的特异性表达方面，对原代和第二代细胞进行鉴定。方法 在无菌条件下，取新生Wistar大鼠乳鼠晶体，解剖镜下剔除粘附的虹膜及悬韧带；室温条件下，于终浓度0．08％的胰蛋白酶液中消化5～10min后离心，用199培养液调细胞至适当浓度，37℃5％CO2条件下培养，3～4d换液1次；待细胞长成连续单层后，以1：2或1：3传代。结果 原代及第二代细胞形态呈典型的上皮细胞表型，从第三代起细胞形态发生了较大变化，提示细胞已开始分化。以Northern印渍杂交对培养细胞晶体蛋白的特异性表达进行了鉴定，发现原代及第二代细胞内仅存在α晶体蛋白mRNA。结论 原代和第二代细胞尚未进入分化状态，可用作进一步实验的材料。     

1,25二羟维生素D3通过抑制mTOR通路而激活自噬以促进大鼠成骨细胞增殖和分化

目的 探讨1,25二羟维生素D3[1,25(OH)2D3]对大鼠原代成骨细胞培养的第4代细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的作用及其对成骨的影响.方法 由新生SD大鼠颅骨获取原代成骨细胞,用培养的第4代细胞进行研究,分为对照组(control)、雷帕霉素组(rapamycin,RAPA)(20nmol/L)、MH...     

新生大鼠心肌细胞原代培养

目的探讨酶法分离新生大鼠心肌细胞过程中的各种影响因素,对Simpson经典方法进行改进,提高原代心肌细胞存活率及搏动率。方法采用低浓度的胰酶消化3～4次后,再用低浓度的Ⅱ型胶原酶消化一次,用短时间的2次差速贴壁法分离培养心肌细胞。结果在分离培养新生鼠心肌细胞过程中,胰酶和胶原酶合用,并改变差速贴壁时间,得到高存活率和高纯度的心肌细胞,细胞搏动率高,持续时间久。结论分离培养大鼠心肌细胞时,低浓度的胰酶和胶原酶合用,并用2次差速贴壁,可提高原代心肌培养的存活率和纯度,使细胞搏动良好。     

新生大鼠海马神经元细胞体外培养方法改良研究

目的探讨改良的新生大鼠海马神经元细胞体外培养方法,为新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病研究奠定基础。 方法采用本研究自行设计的改良新生大鼠海马神经元细胞的体外培养方法,进行新生大鼠海马神经元细胞的体外培养。判断新生大鼠原代海马神经元细胞体外培养成功的标准为：荧光显微镜下,可见微管相关蛋白(MAP)2在海马神经元细胞体和树突中表达。该改良方法具体为：①以L-多聚赖氨酸和鼠尾胶原作为神经元细胞体外培养的生长基质,分离出生24 h内新生SD大鼠海马结构。将其运用单一胰蛋白酶水浴振荡消化后,吹打成细胞悬液,将海马神经元细胞以适当的密度种植于含10%胎牛血清DMEM培养基中,贴壁培养4 h后,更换为Neurobasal维持培养基继续培养,以后每3 d更换1/2培养液。②采用抗MAP2-5-异硫氰酸荧光素(anti-MAP2-FITC)免疫荧光法,对所获得的海马神经元细胞进行鉴定。 结果①新生大鼠海马神经元细胞的体外培养结果显示,新生大鼠海马神经元细胞于培养30 min时,大部分细胞贴壁生长,培养2 h后,细胞贴壁明显,少数细胞开始长出突起。于培养5 d后,神经元突起进一步增多,并形成神经细胞网络,培养7 d后,神经元细胞分化更加成熟,神经元细胞之间的突起联系更加紧密,可见密集的神经细胞网络。海马神经元细胞体外培养至第21天后,神经元细胞开始退化、变性,细胞体皱缩,残留细胞体痕迹,周围光晕消失,折光性减弱,突起融合而粗大杂乱,神经细胞网络粗大老化。②anti-MAP2-FITC免疫荧光法对所获得的海马神经元细胞进行鉴定的结果显示,在所有细胞中,免疫荧光染色MAP2阳性新生大鼠海马神经元细胞纯度达96.3%。 结论通过上述改良方法培养获得的新生大鼠海马神经元细胞生长状态良好,并具有较高的纯度,可为进一步进行新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病的研究提供实验条件。     

MTT法观察微囊藻毒素-LR对原代大鼠肝细胞的双向毒性作用

[目的]系统性探讨微囊藻毒素-LR(MC-LR)引起肝细胞毒性效应的量效和时效关系特点. [方法]采用胶原酶灌注法建立原代大鼠肝细胞模型,并通过抗大鼠细胞角蛋白 (CK18)的特异性抗体来进行免疫荧光染色观察细胞纯度.对分离培养得到的原代肝细胞分别给予10-5～10-12mol/l的MC-LR,在给药后的24、48、72和96h后分别采用MTT法观察细胞存货率的改变情况. [结果]分离培养所得细胞均为肝实质细胞,细胞纯度为100%;高剂量MC-LR(μM水平)能引起细胞死亡或凋亡,而低剂量MC-LR(nM～pM水平)则具有促进细胞增殖的效应,双效性作用的分界浓度10-7mol/L左右. [结论]MC-LR对原代培养肝细胞的毒性效应上表现为双向性.     

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

目的:建立人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方法:用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞,流式细胞仪检测其免疫表型;用不同的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化,并对其进行鉴定。结果:改良的hUCMSCs培养方法培养细胞纯度更高,在相同的培养时间内,改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍,是传统组织块法的20～30倍,细胞呈长梭形生长;高表达CD73、CD90、CD44、CD105,不表达CD31、CD45、CD34;茜素红染色及油红O染色证实了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论:建立了hUCMSCs的培养新方法,证实了hUCMSCs的增殖能力和多向分化潜能,为其治疗应用提供支持。     

Observation of the activity of factor VIII in the endometrium of women pre- and post-insertion of three types of IUDs.

The endometrial materials were obtained from 90 women who had been randomly inserted with three types of IUDs (Stainless steel ring, SS; copper T 220, TCu 220, and levonorgestrel-releasing device, LNG). An immunoperoxidase reaction, PAP method, with the antiserum of Factor VIII as the primary antibody, was carried out to detect the Factor VIII activity in the endometrial endothelium pre- (control) and post-insertion of the IUDs. The results revealed that: 1. There was a generalized lower Factor VIII activity in the endometrium of women post-insertion of IUDs (except LNG). 2. Comparison of the Factor VIII activity in the endometrium of women using different types of IUDs showed that the TCu type and the SS type decreased the activity significantly whereas the activity remained unchanged after 3-6 months' use of the LNG-IUD. The different types of IUDs seemed to influence the coagulation regulatory system in different ways; the lower Factor VIII activity, the more tendency to bleeding. 3. The Factor VIII activity in the endometrium of women using IUDs was lower in all phases of the menstrual cycle including the proliferative phase when the Factor VIII activity is normally high. It cannot be excluded that this could be a contributing factor to IUD-induced bleedings.     

大鼠脂肪源性干细胞分离培养的实验研究

目的研究分离、培养、鉴定大鼠脂肪源性干细胞的实验方法。方法提取大鼠双侧腹股沟处脂肪组织,进行原代培养及流式细胞检测仪的鉴定。用MTT法检测不同原代细胞接种密度的细胞分裂增殖率的变化,并观察第1^第13代细胞分裂增殖的特点。结果大鼠脂肪源性干细胞的生长呈大量细胞集落,表面标记物CD44、CD105、CD49d表达阳性,CD106表达阴性。不同的原代细胞接种密度会影响细胞分裂增殖,以1×106/ml细胞密度接种时细胞的增殖速率高于其它对照组。该细胞株经多次传代后仍能保持较强的分裂增殖能力。结论大鼠脂肪源性干细胞分离培养方法简便,不同的原代细胞接种密度会影响细胞分裂增殖,细胞经多次传代后仍能保持较强的分裂增殖能力。     

24例甲型H1N1流行性感冒病例报告

目的 研究24例甲型H1N1流行性感冒(简称流感)确诊患者的临床表现及实验室检查结果,并总结其特点.方法 分析总结了24例确诊患者流行病学资料、临床表现、实验室和影像学检查.并对患者T细胞亚群进行评价研究.结果 患者年龄从6岁至65岁,平均年龄26岁,年龄25岁以下15例.22例(22/24,91.7%)患者来自美国和加拿大疫区.常见症状和体征包括:发热22例(22/24,91.7%);咽痛22例(22/24,91.7%);咳嗽20例(20/24,83.3%),其中干咳14例(14/24,58.3%)、咯痰6例(6/24,25.0%);流涕6例(6/24,25.0%);头痛7例(7/24,29.2%);喷嚏、鼻塞各2例(2/24,8.3%);16例患者行CT检查,其中6例患者发现肺部炎症(6/16,37.5%);肌肉酸痛者4例(4/24,16.7%);腹泻者1例(1/24,4.2%);结膜炎1例(1/24,4.2%).实验室检查:检测CD4时,23例患者中18例降低(18/23,78.3%),其波动范围122～691细胞/μl(正常值为706～1125细胞/μl),平均值408细胞/μl.CD4/CD8比值仍在正常范围内.在治疗5～7 d后,14例患者复查CD4、CD8,其中CD4治疗前、后均值分别为(436.29±189.06)细胞/μl、(976.71±332.96)细胞/μl,配对t检验结果示:t=-5.416,P<0.05;CD8治疗前、后均值分别为(323.64±176.47)细胞/μl、(703.14±211.77)细胞/μl,配对t检验结果示:t=-5.319,P<0.05.22例患者测定了治疗前、后白细胞及淋巴细胞数值,白细胞治疗前为(5.13±1.47)×10~9/L,治疗后(6.25±1.37)×10~9/L,配对t检验结果示:t=-2.900,P<0.05;淋巴细胞治疗前(1.16±0.43)×10~9/L,治疗后(2.30±0.37)×10~9/L,配对t检验结果示:t=-6.819,P<0.05.治疗前、后白细胞、淋巴细胞、CD4、CD8比较,差异有统计学意义.CD4/CD8比值治疗前后分别为1.44±0.41、1.40±0.26,配对t检验结果示:t=0.507,P>0.05.二者之间差异无统计学意义.所有患者均应用达菲(奥司他韦,Oseltamivir)抗病毒治疗.患者病程在3-13 d之间,平均7.3 d,体温在起病后3～4 d均恢复正常,病毒核酸在1～10 d(平均4.5 d)阴转.结论 甲型H1N1病毒感染可引起以发热为常见的呼吸道疾患,具有自限性;病程中存在着T细胞亚群的变化,但目前尚无证据表明其变化可预测患者的病情预后.     

以发热伴关节肿痛为特征的组织细胞坏死性淋巴结炎1例报道

目的方法结果结论27岁女性，因间断性发热20+ d，膝关节肿痛7 d入院。患者持续发热，最高体温达40.1°C，双膝关节肿痛，双手及两大腿可见大量散在红色针尖样皮疹，淋巴结大、脾大，双手指间关节及双膝关节肿痛，淋巴结局限于双侧腋窝，质地软，局部压痛，活动度好。左侧腋窝淋巴结病理结果示：碎块状淋巴结组织，结构不完整，淋巴滤泡存在，滤泡减少或消失区见弥散成片组织细胞、免疫母细胞及少量小淋巴细胞增生，核分裂易见，其间有片状大小不等坏死灶，胞核崩解，并见较多纤维素样坏死血管，伴出血。免疫组化示CD3（弥漫+）；CD20（滤泡+）；CD79α（滤泡+）；CD68（+）；EMA（-）；ALK（-）；CD15（少量细胞+）；CD30（+），CD4（-），CD5（+）；CD10（-）；bcl-2（+）；CD21（+）；粒酶B(-)；TIA-1（-）；EBV（-）Ki-67（+）。结合临床及免疫组化标记结果，明确为组织细胞坏死性淋巴结炎。患者停用抗菌药物，使用5% 葡萄糖100 mL+氢化可的松琥珀酸钠200 mg静滴3 d 后未见发热，腋窝淋巴结逐渐缩小。后改为甲泼尼龙8 mg/d，每日2次，每两周减一片，至最后停止使用，随访两年，多次复查血常规、肝肾功能在正常范围内，双侧膝关节不肿，可以自由行走，全身淋巴结无肿大。     

IL-15 is superior to IL-2 in the generation of long-lived antigen specific memory CD4 and CD8 T cells in rhesus macaques

Using tetanus toxoid (TT) and influenza (Flu) immunization of rhesus macaques as a model, the effect of IL-2 and IL-15 on the generation and maintenance of antigen specific memory T cells was evaluated following primary and secondary immunization. Daily cytokine administration expanded primarily effector but not memory cells, while spacing cytokine administration to q3-7 days markedly enhanced TT and Flu specific memory responses. Following primary immunization, TT specific CD4 and influenza matrix protein (Flu-MP) specific CD8 effector responses were enhanced by IL-2 administration but CD8 specific memory responses were no different from cytokine non-treated monkeys. In contrast, expansion of Flu specific CD8 cells with IL-15 was only modest but resulted in significantly elevated levels of memory cells at 6 months. IL-15 also significantly enhanced early and late TT specific CD4 responses. The highest levels of primary effector and memory T cells were observed following alternate administration of both IL-2 and IL-15. Following booster immunization, however, only IL-15 appeared able to enhance CD8 T cell responses while IL-2 or IL2/IL-15 administration were less effective.     

经典干细胞标志物CD34、PDGF-βR、VEGF-R_2在早孕蜕膜组织中的表达研究

目的研究经典干细胞标志物CD34、PDGF-βR、VEGF-R_2在早孕6～8周蜕膜组织中的表达。方法提取6～8周早孕期人工流产术蜕膜组织(n=16),消化后选用CD34、PDGF-βR、VEGF-R_2单克隆抗体进行荧光染色,分别采用单染、双染及三染法,应用流式细胞仪技术分析上述经典干细胞标志物的表达及其相互关系。结果 6～8周早孕期蜕膜组织细胞中,(1)单染法证实CD34~+细胞为(0.81±1.07)%,PDGF-βR~+细胞为(9.94±7.36)%,VEGF-R_2~+细胞为(0.90±1.19)%;(2)双染法证实CD34~+/VEGFR2~-细胞(0.59±0.61)%,CD34~+/VEGF-R2~+细胞(0.16±0.10)%;(3)三染法证实CD34~+/VEGFR2~+/PDGF-βR~+细胞(0.09±0.06)%,CD34~+/VEGFR2~-/PDGF-βR~+细胞(0.15±0.13)%。结论早孕6～8周蜕膜组织中存在经典干细胞标志物CD34、PDGF-βR、VEGF-R_2阳性表达的细胞,存在少量的双阳性表达及三阳性表达的细胞。早孕蜕膜组织中存在干细胞参与其发育过程。     

沥青烟致小鼠肺损伤及细胞周期改变的研究

目的研究沥青烟致癌和致突变作用的机制。方法用沥青烟对小鼠进行不同剂量(55、165 mg/m~3)和不同时间(30、60 d)的染毒,观察小鼠肺组织病理形态改变,并用流式细胞仪进行小鼠肺组织细胞DNA含量的检测和细胞周期的分析。结果随着沥青烟染毒时间和剂量的增加,小鼠肺组织病变表现为不同程度的不典型增生和原位癌；同时小鼠肺组织细胞各周期指数发生变化,G_1期细胞数下降,S期阻滞,进入G_2/M期的细胞减少,细胞增殖指数(PI)增加,异倍体指数(DI)升高,与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。染毒相同时间时,55 mg/m~3和165mg/m~3剂量组的PI均高于对照组,165 mg/m~3剂量组的DI高于55mg/m~3剂量组,差异均有统计学意义(P＜0．05或P＜0．01)。相同染毒剂量下,60 d处理组的DI[(1．16±1．51)×10~(-2)、(1．20±2．30)×10~(-2)]均高于30 d处理组[(1．14±0．88)×10~(-2)、(1．16±1．47)×10~(-2)],差异有统计学意义(P＜0．05)。结论沥青烟所致小鼠肺组织产生的癌前病变可能与细胞周期的改变有关。     

Cell cycle arrest and differential gene expression in HT-29 cells exposed to an aqueous garlic extract

Epidemiological data show an inverse correlation between garlic consumption and the risk for colon cancer. To examine this relationship, HT-29 human adenocarcinoma cells were cultured in the presence and absence of an aqueous garlic extract. Garlic treatment resulted in a fraction of cells detaching from the culture flasks. These cells remained viable. Flow cell cytometry showed that untreated cells exhibited a normal distribution among phases of the cell cycle, with 12% of cells at the G2/M boundary. Of the garlic-treated cells remaining attached to the flask, 27% were present at the G2/M boundary. Treated cells that detached from the flask were found almost exclusively (89%) at the G2/M boundary. RNA fingerprinting and microarray analysis showed that expression of the gene for menin was twice as high in control cells as in detached treated cells. In contrast, expression of genes for epidermal growth factor receptor and integrin-alpha6 was nearly twice as high in detached treated cells as in control cells. These changes in gene expression were consistent with an arrest of the cell cycle at the G2/M boundary. Garlic's arrest of the cell cycle in human adenocarcinoma cells may explain in part its anticarcinogenic properties.     

肝癌患者外周血CD4^＋／CD25^＋调节T细胞分析

目的探讨肝癌患者外周血CD4^＋／CD25^＋调节T细胞（Treg）水平的变化特点及其临床意义。方法采用流式细胞仪检测63例原发性肝癌患者和30例健康人外周血CD4^＋／CD25^＋调节T细胞水平,并进行水平比较和分层分析。结果肝癌组外周血CD4^＋／CD25^＋调节T细胞水平（14．06±2．34）％,明显高于健康对照组（6．05±1．57）％（P〈0．05）;外周血CD4^＋／CD25^＋调节T细胞水平与肝癌病理类型无相关性（P〉0．05）;与临床分期密切相关,Ⅰ＋Ⅱ期亚组（8．31±1．43）％与健康对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）,而与Ⅲ期亚组（13．68±2．31）%、Ⅳ期亚组（18．50±2．98）％比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论肝癌患者外周血CD4^＋／CD25^＋调节T细胞水平明显升高,且与肿瘤的发生发展密切相关,可作为评估肝癌患者预后的一项指标。