不同的冻存方法对脐血CD34~+细胞的影响

目的 :研究不同冻存方法对脐血CD34+ 细胞的影响 ,探讨脐血CD34+ 细胞先分离后冻存的可能性 ,以寻找脐血保存的更好方法。方法 :对 31份脐血采用全脐血直接冻存 ,分离为单个核细胞冻存 ,和分离为CD34+ 细胞冻存 ,3种不同的冻存方法 ;用造血祖细胞培养技术、活细胞染色技术、流式细胞技术等方法研究冻存前后脐血造血祖细胞活性的变化。结果 :冻存后细胞活度下降 ,集落形成率下降 ,以全脐血冻存组为甚 ;CD34+ CD38- 比例冻存后增高。结论 :先分离后冻存法可行 ,且具有减小冻存体积 ,对造血祖细胞损伤较小的特点 ;早期造血祖细胞可能更能耐受冻存处理     

多种细胞因子组合对脐血CD34+细胞的体外扩增

目的 探讨不同细胞因子组合在无血清、无基质条件下对脐血干／祖细胞的调控作用。方法 将SCF、Flk2／Flt3配体(FL)、TPO、IL-6及IL-6受体的可溶性形式(sIL-6R)进行不同组合扩增脐血CD34^ 细胞。结果 ①SCF FL ／-TPO组合能有效快速扩增脐血CD34^ 、CD34^ Thy-1^ 、CD34^ CD33^ 及长期培养启始细胞(LTC—IC)；②该组合同时加入IL-6及sIL-6R后，脐血干／祖细胞显著增殖；单独加入IL-6(不含sIL-6R)时，早期CD34^ 细胞和LTC—IC含量无明显增加，而且CFU-Mix、BFU—E的扩增不如CFU—GM明显；③通过细胞凋亡早期膜变化标记FITC—Annexin—V检测细胞凋亡率，加入Flt3L和／或IL-6 sIL-6R后Annexin-V阳性细胞由15．2％～19．1％降至2．8％～3．5％。结论 在SCF TPO Flt3L IL-6 sIL-6R组合的无基质、无血清悬浮体系中，脐血既能产生大量定向祖细胞，又能保持一定数量的早期造血细胞，这一体外培养体系具有重要的临床意义。     

脐血CD34+细胞体外扩增和分化调节的研究

目的探讨脐血体外扩增的最佳造血生长因子组合及时间.方法脐血CD34+细胞培养于含不同造血生长因子组合的无血清培养液.对其有核细胞数(NC)、表面抗原以及集落形成能力进行监测.结果同对照组相比,扩增组的NC和CD34+细胞均有不同程度的扩增,扩增高峰分别为第10d和第6d;其中含SCF、IL-3、IL-6、TPO、Flt3-L、G-CSF及Epo的E组扩增的细胞数最多.第6d,CD34+细胞、NC及CFC总数分别扩增了9.90、101.80和31.18倍,第10d分别累积扩增了3.56、357.42和73.11倍.而D组(含SCF、IL-3、IL-6、TPO及Flt3-L)扩增的细胞中CD34+及CD34+CD38-含量最高.提示E组细胞分化较D组明显.结论体外扩增可望解决单份脐血造血干/祖细胞数量不足的问题,但扩增中应注意其过度分化,扩增时间以6～10d为宜.     

不同组合方式的细胞因子对人骨髓AC133+和CD34+细胞增殖的影响

目的：探讨细胞因子不同的组合方式对人骨髓CD34⁺富集细胞及AC133⁺富集细胞体外扩增潜能的影响。方法：常规富集人骨髓CD34⁺及AC133⁺细胞,应用本研究组设计并已经证实的细胞因子组合方式,对人骨髓CD34⁺及AC133⁺富集细胞进行体外对照培养,分别观察CD34⁺和AC133⁺富集细胞的扩增情况;应用甲基纤维素半固体培养法,观察不同组别培养7、14、21d CD34⁺和AC133⁺富集细胞的集落形成情况及细胞凋亡率。结果：AC133⁺细胞实验组在相同条件下细胞扩增倍数以及集落生成数目上均明显高于CD34⁺细胞实验组,相同条件下细胞凋亡率明显低于CD34⁺细胞实验组。结论：AC133⁺细胞包含有更多原始的造血干细胞,AC133作为造血干细胞抗原标记明显优于CD34。     

造血细胞生长因子对脐血CD34+细胞短期体外扩增的作用

目的 探讨造血细胞生长因子(HGF)的不同组合对脐血CD34 细胞短期体外扩增的作用．方法 用免疫磁珠法分高纯化脐血CD34 细胞，培养于无血清培养液中。加入不同的细胞因子，于第4，7，10，14天检测CD34 细胞百分率和有核细胞(NC)总数。结果 和对照组相比，各组的NC扩增倍数随着培养时间的延长虽不同程度的增加，干细胞在FL、TPO，GM-CSF、SCF、IL-6、G-CSF、EPO和IL-3等因子作用下，NC扩增倍数在培养第14天达高峰，为328．96倍；而CD34 细胞扩增倍数在培养第7天达最高峰，但在FL、TPO、GM-CSF、SCF，IL-6、G-CSF等因子作用下，CD34 细胞扩增倍数最大，7d后达25．23倍，而后随着培养时间的延长而逐渐下降。结论 脐血CD34 细胞在HGF作用下，扩增时间以7-10d为最佳。     

脐血CD34~+细胞体外短期培养扩增研究

为寻找更有效的体外扩增脐血CD34 + 细胞的造血细胞因子组合 ,采集健康产妇脐带血 ,用免疫磁珠法分选CD34 + 细胞。采用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种具有早期作用的细胞因子的不同组合进行脐血CD34 + 细胞短期无血清液体培养 ,观察培养前后有核细胞、CD34 + 细胞、CD34 + /CD38- 细胞、CFU GEMM、CFU GM和BFU E数量的变化。结果在 3种不同的细胞因子组合中 ,同时应用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子培养 7d的扩增效果最好。突出的发现是在这种条件下CD34 + /CD38- 细胞亚群达到平均 1 97.9倍的扩增效果。提示 :SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子是脐血CD34 + 细胞体外扩增理想的细胞因子组合     

脐血CD34+细胞体外扩增的实验研究

目的：探讨用体外扩增脐血造血干细胞进行成人脐血移植的可能性。方法：从１５份新鲜脐血标本中纯化ＣＤ３４＋细胞，将其接种于含２０％的胎牛血清（ＦＢＳ）的ＩＭＤＭ培养基中，分别加入由Ｆｌｔ３配体（Ｆｌｔ３　ｌｉｇａｎｄ，ＦＬ）、干细胞因子（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ，　ＳＣＦ）、血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，　ＴＰＯ）及白细胞介素６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１，ＩＬ－６）组成的三组细胞因子组合（Ａ组：ＦＬ＋ＴＰＯ；Ｂ组：ＦＬ＋ＳＣＦ＋ＴＰＯ；Ｃ组：ＦＬ＋ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＩＬ－６）培养扩增１４ｄ。结果：①各组对各阶段造血细胞均有扩增效果，其中Ｂ、Ｃ组优于Ａ组（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）；②　经体外１４ｄ的培养扩增后，单份脐血可产生足够量的造血干细胞用于成人脐血移植。结论：脐血ＣＤ３４＋细胞经体外扩增可用于成人脐血移植。     

脐血CD34+细胞向巨核细胞的分化扩增及基因的表达变化

目的研究脐血CD34+细胞向巨核细胞的诱导分化及体外扩增,并观察此过程中巨核细胞特异性基因表达的变化。方法免疫磁珠法分离获得CD34+细胞培养在无血清无基质培养基中,采用TPO+SCF+IL 3+IL 6、 TPO+SCF+IL 3、 TPO+SCF三种不同因子组合对其诱导分化及扩增。收集3、7、10、14?d的扩增产物,运用荧光显微镜检测巨核细胞的表面标志;流式细胞术（FCM）检测巨核细胞的凋亡;对巨核细胞进行DNA含量检测以及荧光定量PCR检测特异性基因表达的变化。结果分离获得的CD34+细胞在体外可以有效扩增,随培养时间的延长,CD34+/CD41+细胞数第7天达最高值,之后逐渐下降;而CD41+、CD42b+、CD61+细胞随培养时间的延长表达量逐渐增高。DNA含量检测发现,随着培养天数的增加,多倍体细胞所占的百分比增加。三种因子组合中TPO+SCF+IL 3+IL 6组扩增效率最高。荧光定量PCR显示转录因子GATA 1、NF E2、TXS、GPIIb和HPRT在第7天表达量最高,之后下降。凋亡转录因子APAF 1随培养天数的延长表达量增加。结论脐血CD34+细胞在体外可向巨核细胞诱导分化及扩增,其基因表达的变化也支持这一结论。     

脐血CD34+细胞向内皮细胞定向诱导分化的实验研究

目的探讨人脐血CD34+细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型.方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34+单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34+和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达.结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34+ 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小.CD34+细胞培养3 d后有明显集落形成,7 d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构.经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%.免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达.而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态.结论 MACS法分离脐血CD34+细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达.     

脐血CD+34细胞体外扩增新进展

造血干细胞(hematepoietic stein cell，HSC)是各种血细胞和免疫细胞的始祖，具有极重要的生理功能。脐带已经成为近年来研究的热点，但单份脐血中造血干细胞理论上不少，但实际上数量往往不足以支持成人的造血重建，需要体外加以扩增。影响脐血CD34^ 细胞体外扩增的因素有很多，现就几种关键因素对脐血CD34^ 细胞体外扩增作用的研究新进展综述如下。     

不同细胞因子对脐血CD34+细胞扩增的影响

目的探讨不同细胞因子促进脐血CD34 细胞扩增的效应,为下一步的临床应用奠定基础。方法采用EasySep免疫磁珠阳性选择系统分离脐血中CD34 细胞,在无血清、无基质细胞培养体系中添加不同细胞因子培养2周,分组:A组,SCF FL TPOB组,SCF FL TPO IL-3C组,SCF FL TPO G-CSF。结果CD34 细胞数目于培养后7d达到峰值,3组间差异无显著性;B组扩增至14d时细胞总数达(384.40±17.48)倍,显著高于另外2组。扩增7d后的脐血细胞经体外培养可形成造血集落。结论体外扩增脐血CD34 细胞理想的细胞因子组合为SCF TPO FL,以7d为宜。     

GM-CSF诱导人脐血CD34+造血干细胞上CXCR3的表达

目的：研究GM-CSF诱导人脐血CD34^ 造血干细胞上CXCR3的表达。方法：采用流式细胞仪，实时定量逆转录PCR（RT-PCR）分析，及其配体γIP-10和Mig诱导的趋化和粘附作用分析。结果：CXCR3也表达在受GM-CSF刺激后的CD34^ 造血干细胞上，但它在新鲜分离的CD34^ 造血干细胞上不表达。应用实时定量逆转录PCR技术检测新鲜分离的CD34^ 造血干细胞有较低水平的CXCR3 mRNA表达，而GM-CSF能上调CXCR3的表达。用抗CXCR3单克隆抗体（mAb)能阻断γIP-10和Mig诱导的造血干细胞趋化作用，证实γIP-10和Mig是通过CXCR3而发挥作用的。γIP-10和Mig通过CXCR3不仅可诱导趋化作用而且还可诱导GM-CSF刺激后的CD34^ 造血干细胞粘附和聚集作用，而抗CXCR3 mAb能阻断γIP-10和Mig这些功能，但不能阻断SDF-1α的作用。γIP-10和Mig能提高整合素（CD49a和CD49b)的表达，这在GM-CSF刺激后CD34^ 造血干细胞的粘附作用中发挥重要作用。结论：在细胞因子/趋化因子微环境中，CXCR3-γIP-10和-Mig受体配体复合物及GM-CSF对CD34^ 造血干细胞分化成淋巴干细胞和髓系干细胞以及后来的免疫/炎症细胞的生理和病理过程起特别重要作用。这些过程包括CD34^ 造血干细胞的迁移、再定位、分化和成熟。     

体外培养与扩增对脐血CD34+细胞及HLA抗原表达的影响

采用免疫组织化学方法．观察脐血细胞体外培养与扩增前后ＣＤ３４~＋细胞的比例以及ＨＬＡ抗原的表达。结果表明：脐血ＣＤ３４~＋细胞的百分比以及ＨＬＡ抗原的表达于体外培养前后无显著性变化（Ｐ＞０．０５）,而在细胞因子的联合作用下,经一定时间的扩增后,ＣＤ３４~＋细胞百分比下降（Ｐ＜０．０１）,ＨＬＡ抗原的表达有一定程度的提高。提示：体外扩增对脐血ＣＤ３４~＋细胞的比例以及ＨＬＡ抗原的表达有一定的影响,而未加细胞因子的体外直接培养则不产生明显影响。     

骨髓增生异常综合征中骨髓CD34~+、CD34~-细胞凋亡和增殖的实验研究

目的:分析骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓CD34+细胞和CD34-细胞凋亡和增殖情况,从该角度探讨MDS的发病机制。方法:流式细胞术分析20例高危MDS、20例低危MDS患者及10例正常对照者骨髓CD34+细胞的比例,CD34+细胞和CD34-细胞凋亡、增殖的百分率,计算各组中的凋亡/增殖(A/P)比。结果:(1)MDS患者CD34+细胞的比例明显高于对照组,其中高危组CD34+细胞的比例明显高于低危组(P<0.05),而低危组与对照组比较无显著差异;(2)CD34+,CD34-细胞的凋亡率在MDS低危组中均为最高,明显高于MDS高危组和对照组,在低危组中,CD34-细胞的凋亡率(80.36±1.82)%明显高于CD34+细胞(54.75±2.18)%(P<0.05),而在高危组中,CD34+,CD34-细胞的凋亡率无显著差异;(3)CD34+细胞的增殖率在MDS高危组中最高,明显高于低危组和对照组,而CD34-细胞的增殖率在MDS高危和低危组间无显著差异,在高危组中,CD34+细胞的增殖率(50.67±3.37)%明显高于CD34-细胞的(30.99±1.96)%(P<0.05);(4)无论CD34+,CD34-细胞的A/P值在MDS低危组中均明显高于高危组和正常对照组,而在MDS各亚组中,CD34-细胞的A/P值明显高于CD34+的A/P值(P<0.05)。结论:CD34+细胞百分率随MDS危险度增加而逐渐增加,在低危组中以CD34-细胞的凋亡占主导,随着病情进展,在高危组中则以CD34+细胞的增殖占主导,提示异常的凋亡和增殖在MDS的发生和发展中起重要作用。     

CD34+HPC来源的树突状细胞体外扩增和功能研究

目的研究脐血CD34^ HPC体外扩增诱导产生功能性树突状细胞(DCs)的有效方案。方法Ficoll分离脐血获得单个核细胞。免疫磁珠阳性分选CD34^ HPC,^sH^-TdR检测DCs激发异体T细胞增殖的能力。MTT法检测特异性CTL的杀伤能力。结果SCF FL GM—CSF IL-4诱导生成的DCs激发T细胞增殖和特异性CTL的杀伤能力均高于其他组。结论SCF FL GM—CSF IL-4可有效扩增CD34^ HPC并诱导产生功能性DCs。     

G-CSF动员的外周血与骨髓CD34+细胞黏附分子的表达

目的：研究黏附分子在外周血干细胞动员机制中的作用。 方法：应用流式细胞仪检测粒细胞集落刺激因子G-CSF动员的外周血细胞与骨髓CD34⁺细胞表达的黏附分子非常延迟抗原4(VLA-4)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)和L-选择素(CD62L)。 结果：G-CSF动员后的外周血CD34⁺细胞表达的VLA-4、LFA-1与骨髓CD34⁺细胞相比明显减少,CD62L无明显改变。 结论：黏附分子VLA-4及LFA-1降低可能是G-CSF动员造血干细胞进入外周血过程中的一个重要环节。     

Effect of intracranial transplantation of CD34+ cells derived from human umbilical cord blood in rats with cerebral ischemia

As a source of transplantable stem cells, the CD34^＋ subpopulation in human umbilical cord blood （HUCB） has been used extensively to treat some hematopoietic system diseases. However, whether CD34^＋ cells hold the therapeutic potential to cerebral ischemia is unknown. The purpose of this study was to observe the recovery of neural function after transplantation of CD34^＋ cells derived from HUCB into ischemic cerebral tissue in rats.     

血小板第4因子对脐带血CD34+细胞增殖及归巢相关功能影响的研究

目的探讨血小板第4因子(PF4)对脐带血(UCB)CD34 细胞增殖及归巢相关功能影响。方法采用免疫荧光标记流式细胞仪测定、结晶紫染色测定、Transwell实验等方法。结果(1)PF4在体外能通过抑制UCB CD34 细胞凋亡增强细胞生存能力,在本研究建立的FST无血清扩增培养体系中加入PF4可在一定程度上增加CD34 细胞扩增倍数。(2)PF4能够明显上调CD34 细胞CD49d、CD49 e、CD54表达,提高CD34 细胞的黏附能力。(3)PF4能够明显提高CD34 细胞CXCR-4的表达和SDF-1诱导迁移率。结论PF4能够应用于UCB CD34 细胞体外扩增,保持扩增的CD34 细胞的黏附和迁移能力。     

人脐血CD34+细胞体外Dexter基质细胞培养后细胞表面分子变化的动态观察

目的动态观察人脐血CD34 细胞Dexter基质细胞培养后细胞表面分子的变化情况.方法应用MACS磁珠分离系统分离脐带血CD34 细胞,按照Dexter法行脐血基质细胞培养,观察不同时间基质细胞的生长状态及细胞表面分子的变化情况.结果脐血基质细胞在生长情况、细胞形态与骨髓基质细胞有不同之处,但其细胞表面分子的表达特点却与骨髓基质细胞有类似之处.结论脐血CD34 细胞在生长因子的辅助下能促进基质细胞集落的形成,有望成为新的基质细胞来源.