应用抑制性消减杂交筛选失血性休克所致大鼠心肌差异表达基因

目的：失血性休克可导致大鼠心肌的缺血，缺氧，进而对心肌细胞造成严重损伤，本实验将利用抑制性消减杂交技术（Suppression subtractive hybridization SSH)研究失血性休克大鼠心肌的差异表达基因，以期通过基因线索寻找其损伤机制，方法：建立失血性休克大鼠模型，选其心肌，提取总RNA，构建cDNA文库，应用抑制性消减杂交技术筛选其差异表达基因，通过反向Northern杂交验证差异表达基因阳性克隆，并进行测序分析，登陆Genbank寻找同源性基因。结果：获得42个阳性结果，25个为高表达基因，17个为低表达基因，其中发现5个新的cDNA片段，结论：SSH技术是一种高效的筛选差异基因的方法，本实验发现失血性休克可导致大鼠45S rDNA基因转录起始区域，鼠半胱氨酸富含蛋白61及鼠血清诱导激酶等基因的差异表达，今后的工作中我们将进一步研究它们与失血性休克所致损伤的关系。     

人膀胱癌异质性表型相关基因的筛选与鉴定

目的 筛选和鉴定膀胱肿瘤异质性生物学表型相关的基因。方法 以已建立的两株同一来源、不同生物学表型的膀胱移行细胞癌细胞系为材料,采用抑制性削减杂交技术筛选差异表达的基因片段,构建cDNA文库;挑取克隆进行筛选,获得差异表达片段,测序并与Genbank比对,Northernblotting验证差异片段在两株细胞系的不同表达。结果 建立了两个消减文库,分别含有168和206个白色克隆,白色克隆含有约200～700bp的插入片段,对这些克隆进行筛选,获得35个差异表达基因片段,其中15个对应于细胞骨架蛋白、细胞代谢酶基因等已知基因,另外19个为未知功能基因,1个为新EST片段,注册Genbank（注册号为DR008207）。结论 抑制性消减杂交技术是筛选、克隆差异表达基因的有效手段;keratin7、Vimentin等细胞骨架蛋白的不同表达,与细胞形态的表型差异有关;DDH等代谢基因的不同。与细胞的药物敏感性差异相关;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。     

猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的:构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库.方法:15只成年家猫随机分为正常对照组、视神经压迫4周组和视神经压迫8周组(n=5),压迫4周组和压迫8周组猫利用球囊植入法建立慢性视神经损伤模型.取各组动物视神经,TRIzol法提取总RNA,SMART技术合成cDNA,随后利用抑制消减杂交方法分离受压4周和8周视神经中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取300个白色克隆进行菌落PCR鉴定.结果:菌落PCR扩增显示每个文库80%的克隆中均有200～800 bp的插入片段.结论:成功构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆慢性视神经损伤相关差异表达基因奠定了基础.     

人肺癌高低转移细胞株差异表达基因的筛选

目的 筛选高低转移能力人肺癌细胞株PG-BE1和PG-LH7间差异表达基因.方法 进行两次抑制性消减杂交,第一次以PG-BE1细胞株为实验方、PG-LH7株为驱动方构建正向消减文库;第二次以PG-LH7株为实验方、PG-BE1为驱动方构建反向消减文库.筛选出来的阳性克隆进行测序,并在Gene Bank数据库中进行同源性比较.结果 2个消减文库共得到122个阳性克隆,随机选取10个克隆测序并进行同源性分析,发现其中9条序列来自于已知基因,另外1条序列为新的基因序列标签.结论 成功构建了高低转移力人肺癌细胞株的双向消减杂交文库.     

抑制差减杂交方法筛选辐射诱导细胞恶性转化模型中的差异表达基因

目的:筛选辐射诱导的支气管上皮细胞恶性转化模型中的差异表达基因.方法:应用抑制差减杂交方法(SSH)构建辐射诱导的细胞转化模型差异表达基因的cDNA文库.对差减文库进行PCR筛选,对得到的差异片段进行测序及BLAST分析;对部分筛选出来的差异表达基因使用荧光定量PCR方法检测并确认其变化;将新的序列表达标签(EST)登录到GenBank上.结果:在80个进行测序的克隆中,得到确定序列的共73个.在转化细胞中表达下降的序列41条,BLAST比较分析结果:得到已知序列6条;未知基因的EST序列20条;空载体序列7条;8条为重复测定序列.在转化细胞中表达上升的序列32条,BLAST分析:已知序列14条;未知基因的EST序列9条;重复测定的序列9条.对其中的部分基因改变进行荧光定量PCR检测,结果表明辐射转化组中MY06、HACE1、ZNF143、HNRPH1的表达量明显增加(与对照组相比,转化组中的mRNA分别增加了3.49、29.38、12.99、5.00倍);而PCBP2、RPL15、TCERG1的表达量下降(与对照组相比,转化组中的mRNA分别减少了1.89、48.77、11.95倍).将得到的29个未知序列登录到GenBank,序列ID:EB643220～EB643248.结论:利用抑制差减杂交方法成功建立了恶性转化细胞模型差异表达cDNA文库,包含大量功能未知的新基因;ZNF143表达增加,其与细胞的增殖与分裂有关,TCERG1作为转录辅助激活因子在mRNA转录和后期的修饰过程中起到重要的作用,PCBP2是一个Polyc连接蛋白,具有蛋白翻译调节功能,这些基因在辐射致癌中尚无研究报道.     

应用抑制消减杂交克隆支气管哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因

目的 探讨嗜酸细胞在支气管哮喘发病中的分子机制。方法 提取1名哮喘发作病人嗜酸细胞总RNA为实验子,治疗后作为对照的嗜酸细胞的RNA为驱动子。检测子、驱动子的总RNA由SMART cDNA合成方法合成双链cDNA,进而由抑制消减杂交方法获得消减杂交产物。消减杂交产物克隆到T载体建立消减文库,对部分克隆进行杂交筛选及序列比对。结果 消减杂交文库挑取400个克隆进行PCR扩增,阳性率约为80%。部分阳性克隆经2轮杂交筛选及序列对比后获得6个差异片段,涉及与编码炎症介质、细胞信号传导、能量代谢和细胞凋亡相关的基因。结论 抑制消减杂交技术有效地克隆了支气管哮喘发作期和缓解期嗜酸细胞差异表达的基因,为阐明嗜酸细胞在支气管哮喘发病中的分子机制奠定了良好的基础,并为临床防治支气管哮喘、寻找新的药物和方法提供了依据。     

应用抑制消减杂交技术克隆人大肠癌转移相关新基因

目的 克隆新的大肠癌转移相关基因,为进一步阐述大肠癌转移的分子机制提供线索。方法 利用抑制消减杂交技术,以1对来自同一亲本、转移能力不同的大肠癌细胞株SW620和SW480为研究对象,构建2种大肠癌转移促进基因和转移抑制基因的cDNA消减文库。随机挑取文库克隆进行差异筛选,对所得的差异片段进行测序和同源性分析,利用Northern Blot对新基因的表达情况进行验证。结果 两种消减文库分别含有235和232个白色克隆,90%以上的白色克隆含有插入片段。随机挑取约200个阳性克隆进行差异筛选。共获得29个差异片段。测序及同源分析发现15个为未知基因,GenBank登陆号为CD485499-CD485513。其中与5号染色体序列同源的基因有6个。结论 抑制消减杂交技术是筛选、克隆大肠癌转移相关新基因的有效手段;5号染色体上可能存在多个与大肠癌转移相关的新基因位点;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。     

应用限制性显示技术筛选K562细胞脱核前后差异表达基因

目的 应用限制性显示（RD）PCR技术筛选细胞松弛素B（CytochalasinB,CB）诱导K562细胞脱核前后的差异基因,探讨CB诱导细胞脱核的分子机制。方法 用CB（终浓度为10μg／ml）处理K562细胞24h。分别提取对照组和处理组细胞总RNA,将两组等量的细胞总RNA纯化为mRNA,反转录为cDNA,利用RD-PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、筛选CB处理前后差异表达的基因。对筛选出的差异表达基因进行克隆、测序,在GenBank检索进行序列同源性分析。结果 筛选及克隆了7个差异表达基因,其中水通道蛋白1（AOP1）基因经反转录PCR验证在CB诱导脱核的K562细胞中表达上调。结论 AQP1基因在CB诱导K562细胞脱核过程中特异性高表达,提示其可能与细胞脱核及增殖抑制密切相关。     

用抑制性消减杂交方法筛选人肾癌相关基因

目的 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌差异表达基因文库并进行差异表达基因筛选.方法 以肾癌细胞株RLC-310和肾近曲小管细胞株HK-2互为实验组和对照组,提取mRNA,应用抑制性消减杂交技术进行正反两向消减杂交,获得人肾癌细胞差异表达基因文库,结合反向Northern斑点印迹杂交,筛选差异基因克隆,并进行测序分析.结果 正向和反向文库共包含1200多个阳性克隆,经斑点杂交筛选后,对213个差异克隆进行测序并经BLAST分析,得到144个差异表达基因,与肾癌相关的高表达基因67个,低表达基因77个,其中新EST 14个,未知功能基因21个;对测序基因进行聚类分析发现与细胞生长、黏附、凋亡等肿瘤细胞生物学行为相关.结论 该文库质量可靠,所筛选出的差异基因和新的基因为进一步筛选肾癌特异性相关基因,绘制肾癌差异基因表达谱,最终阐明肾癌发生、发展、转移机制提供了实验材料和研究靶点.     

Screening of Differently Expressed Genes in Human Prostate Cancer Cell Lines with Different Metastasis Potentials

In order to screen the genes differentially expressed in two human prostate cancer cells with different metastasis potentials,suppression subtractive hybridization(SSH) was done twice on human prostate cancer cell line with high potential of metastasis PC3M-1E8 and its synogenetic cell line PC3M-2B4 with low metastasis potential.In the first subtraction PC3M-2B4 was used as tester and PC3M-1E8 as driver and the forward subtractive library was constructed.In the second one the tester and driver were interchanged and the reverse subtractive library was constructed.The screened clones of both libraries were sequenced and Gene Bank homology search was performed.Some clones were confirmed by quantitative real-time PCR.The results showed that two subtractive libraries containing 238 positive clones were constructed.Analysis of 16 sequenced clones randomly picked from two libraries showed that 4 differentially expressed gene fragments were identified as new EST with unknown functions.It was concluded that two subtractive libraries of human prostate cancer cell lines with different metastasis potentials were constructed successfully.     

Suppression subtractive hybridization for identifying differentially expressed genes in renal cell carcinoma

Objective To construct a renal cell carcinoma (RCC) cDNA subtractive library using suppres sion subtractive hybridization.Methods Polyadenylated RNA ［Poly (A)(+) RNA］ was isolated from tissues of RCC and norm al kidney, and single- strand cDNAs and double-strand cDNAs were synthesized in turn. RCC cDNAs were divided into two groups and ligated to the specific adaptors l and 2, and then h ybridized with normal kidney cDNA twice with two rounds of suppression PCR. Sec ond round PCR products were cloned to T/A plasmid vectors to set up the subtract ive library. One hundred clones were randomly picked to perform enzyme digest a nalysis, and some underwent sequence analysis and Northern blot to identify RCC specifically expressed genes. SMART RACE procedure was operated to clone full l ength novel RCC specifically expressed genes.Results A human RCC subtractive library with high subtractive efficiency was successfull y set up. The amplified library contains 350 positive clones. Random analysis of 100 clones with enzyme restriction showed that 85 plasmids in the clones cont ained 50-400 bp inserts. Sequence analysis was performed for 10 clones. All t he 10 sequences were unknown before and derived from 6 unique, novel genes among which the cDNA insert RCC18 had five copies. Northern blot analysis showed tha t RCC18 cDNA was highly expressed in RCC, but no signal could be detected in nor mal kidney. Using SMART RACE technique, we obtained the full length of the nove l gene RCC18.Conclusions The constructed cDNA subtractive library of human RCC is a highly efficient one and lays a solid foundation for large scale screening and cloning new and speci fic oncogenes or tumor suppressor genes of RCC. The novel specifically expresse d genes provided an important clue for studying the mechanisms of occurrence and development of RCC.     

人毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因cDNA文库的构建

目的 构建毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的消减cDNA文库。方法 分别提取凝集性生长和非凝集性生长状态下毛乳头细胞中的总RNA，应用SMART cDNA合成技术和抑制性消减杂交技术分离毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的cDNA片段并建立消减cDNA文库；利用PCR对随机挑选的100个白色菌落进行插入片段的验证，对其中证实有插入片段的30个克隆进行cDNA斑点杂交验证。结果 所构建的消减cDNA文库扩增后得到320个阳性克隆，随机挑选的100个阳性克隆中95％的均有长度在100—600bp的插入片段，cDNA斑点杂交验证显示27个(90．0％)克隆为阳性。结论 结合SMART cDNA合成技术，应用抑制性消减杂交成功地构建了毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因消减cDNA文库，为进一步筛选和克隆毛乳头细胞凝集性生长相关基因奠定了基础。     

结直肠癌中O-型糖基化相关差异基因的筛选及分析

目的 通过鉴定得出正常和异常O-型糖基化结肠癌细胞之间的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,即O-型糖基化相关差异基因,并探讨其促进肿瘤发生发展的潜在机制。方法 运用单色标记表达谱芯片技术对经Cosmc表达质粒或其空白对照质粒稳定转染的LS174T Tn（+）细胞进行检测,采用RNA杂交获得基因表达谱数据,通过Wegstalt平台的基因通路富集（gene set enrichment analysis,GESA）方法行GO基因本体（gene ontology,GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）肿瘤相关通路分析,R语言行热图聚类分析,STRING在线软件对蛋白网络进行差异及整合分析。结果 通过分析获得了1 474个符合条件的DEGs,其中有502个基因上调,972个基因下调;GO分析显示DEGs主要参与细胞外基质组织及生长因子活性相关的生物学过程;KEGG分析DEGs主要富集在磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）和Wnt等经典信号通路上。结论 本研究首次着眼于结肠癌细胞中由O-型糖基化引起的转录组学变化,有助于揭示O-型糖基化修饰的结直肠癌分子特征,并为科学研究和临床治疗提供新的方向。     

食管癌相关基因片段的筛选与鉴定

目的 :从已构建的中国人食管癌特异的消减cDNA文库中 ,初步筛选与鉴定食管癌相关基因片段。方法 :随机挑选 48个片段作反Northern印迹杂交分析 ,将杂交信号有差别的 15个片段送测序公司进行测序 ,用Gen BankBlast程序检索 ,以同源性很小的cDNA片段作为新基因的候选基因 ,观察其在食管癌组织和正常食管粘膜组织中的表达情况。结果 :所获得的 7个序列中 :3y5 9与已知基因同源性很小 ,且 3y5 9在 30例食管癌及其配对正常食管粘膜组织中 ,19例 (6 3.3 % )表达有差别 ,11例 (36 .7% )表达无差别 (P <0 .0 5 )。 3y88与已知基因geminin基因部分同源。另外 5个片段 3y2 0 ,3y14,3y90 ,3y91和 3y92分别与核糖体蛋白RpL7a,TLH2 9蛋白驱动子 ,Hsp70 /Hsp90 organizingprotein ,Keratin6 (KRT6C)和内膜蛋白等已知基因序列高度同源。结论 :3y5 9可能是与食管癌的发生、发展有关的新的候选基因。首次发现 ,geminin基因 ,核糖体蛋白RpL7a,TLH2 9蛋白驱动子 ,Hsp70 /Hsp90 organizingpro tein ,Keratin6 (KRT6C) ,内膜蛋白等已知基因可能与食管癌的发生发展有关     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法采用新近建立的抑制消减杂交方法,哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料,分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取100个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,90％的克隆中均有200～600bp的插入片段,这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

Identification of differentially expressed genes in omental adipose tissues of obese patients by suppression subtractive hybridization

To identify differentially expressed genes between obese individuals and normal control, we have undertaken suppression subtractive hybridization （SSH）. Omental adipose tissues were obtained via abdominal surgery for appendicitis in both 13 obese subjects[BMI （body mass index） 〉 30 kg/m（2）] and 13 normal subjects （BMI 〉 18 and 〈 25 kg/m（2））.     

乳腺癌相关差异表达基因的筛选及分析

目的构建乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织差异表达的cDNA消减文库,筛选乳腺癌相关基因并进行分析。方法应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术对15对乳腺癌组织及正常癌旁乳腺组织进行差异基因的消减,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,采用数字表法随机挑选克隆经PCR鉴定后,对200个阳性克隆插入片段的序列进行测定及同源性分析。结果建立了乳腺癌差异表达片段cDNA消减文库;通过测序和同源性分析,得到173个差异表达基因,其中26个与肿瘤发生发展相关;26个基因中有15个已被文献明确报道在乳腺癌组织或细胞中有差异表达。结论应用SSH技术成功建立了乳腺癌差异表达基因cDNA消减文库,为乳腺癌的发病机制研究及寻找潜在的治疗靶点提供了有力的支持。     

Identification of differentially expressed genes in anagen dermal papilla by suppression subtractive hybridization

Background We constructed a cDNA subtractive library of dermal papilla cells (DPCs) in anagen with suppression subtractive hybridization (SSH) technique and clone differentially expressed genes related to DPCs in anagen. Methods Total mRNA was isolated from DPCs of anagen and telogen follicles. Moreover, singlestrand (ss) and double-strand (ds) cDNAs were synthesized in turn using SMART PCR cDNA synthesis technology, ds cDNAs then were digested with Rsa I and divided into two groups, and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2R, respectively. After cDNAs were hybridized with each other twice and underwent two rounds of nested PCR. PCR products were ligated with arms of T/A plasmid vectors to set up the subtractive library. Selected clones were demonstrated by reverse Northern blot and sequenced. The acquired sequence data were aligned against the Genbank nucleotide database. Results cDNA subtractive library of DPCs in anagen follicles was set up successfully with high subtractive efficiency, Thirty-five genes were identified in this study with 22 known functional genesand 13 unknown functional genes. Conclusions All results confirm the effectiveness and sensitivity of SSH in detecting differentially expressed genes from a small amount of clinical samples. Information about such alterations in gene expression could be useful for elucidating the genetic events in hair follicle growth regulation.     

人小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达基因的克隆研究

目的 构建小细胞肺癌多药耐药细胞(H446/CDDP)差异表达消减cDNA文库.方法 ①以H446/CDDPcDNA为实验方(Tester),小细胞肺癌细胞H446 cDNA为对照方(Driver),应用抑制消减杂交(SSH)技术结合T/A克隆技术构建小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达消减cDNA文库.②通过斑点杂交筛选、测序及同源性分析获取H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段.结果 成功构建了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP差异表达消减cDNA文库,获得21个H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段,经测序及同源性分析表明它们分别代表6个已知基因(同源性为96%～100%).结论 SSH技术是筛选新的功能基因的有效方法;获取的6个差异表达基因可能参与了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP的耐药形成,进一步的功能研究有利于了解它们在小细胞肺癌多药耐药机制中所发挥的作用.