原代和传代兔关节软骨细胞糖胺多糖合成的动态观察

背景：软骨细胞体外培养时常发生失分化,传代软骨细胞的失分化程度是确定软骨细胞体外扩增操作时间的重要依据,对组织工程修复软骨效果有重要意义。 目的：观察不同接种密度下,软骨细胞合成糖胺多糖的能力。 设计、时间及地点：单一样本观察,细胞学体外实验,于2007-01/05 在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。 材料：1月龄新西兰大白兔5只,雌雄不拘。 方法：无菌手术切取兔双膝关节软骨,采用0.4% Pronase酶和0.25 g/L Ⅱ型胶原酶消化分离关节软骨细胞,体外培养。待细胞融合时,换无血清培养液。于换液后12,24,36,48,60 h分别抽取上清液测量糖胺多糖质量浓度。传代2次,重复上述过程。 主要观察指标：①倒置显微镜观察细胞形态。②传代对软骨细胞生长的影响。③P0,P1,P2代细胞上清液糖胺多糖质量浓度的差异。 结果：P2代以内,软骨细胞形态无明显变化,但P2代细胞内空泡状颗粒增多。传代后,细胞融合时间缩短,但是上清液糖胺多糖质量浓度随传代逐渐下降(P < 0.001),且P0,P1,P2代之间两两比较差异有显著性意义(P < 0.001)。换液60 h后,P1代软骨细胞糖胺多糖质量浓度较P0代下降24%,P2代较P0代下降74%。换液后时间越长,上清液糖胺多糖质量浓度越大(P < 0.001)。换液后时间与传代之间存在交互效应,时间越长,传代细胞与原代细胞上清液糖胺多糖质量浓度相差越大(P < 0.001)。　 结论：在体外单层培养条件下,原代软骨细胞糖胺多糖合成能力最强,传代后很快大幅下降。细胞融合后连续检测上清液糖胺多糖质量浓度是研究软骨细胞分化的有效方法。     

兔软骨细胞与骨髓基质细胞的平面共培养：两者培养比例筛选

背景：骨髓基质细胞一定条件下可以分化为软骨细胞,但目前还缺少将软骨与骨髓基质细胞平面共培养的深入探讨。 目的：拟明确骨髓基质细胞与软骨细胞共培养时比例的选择、细胞增殖活性、软骨特异性蛋白表达的规律,用于细胞移植的最佳时间和传代次数。 方法：软骨细胞与骨髓基质细胞的分离培养,传代后分为5组：单纯软骨细胞组;共培养组,软骨细胞与骨髓基质细胞7∶3,5∶5,3∶7组;以及单纯骨髓基质细胞组。传代至第4代(G4),倒置相差显微镜观察各组细胞在不同传代时期的细胞形态,MTT实验检测细胞增殖活性,甲苯胺蓝与阿利新蓝染色,细胞免疫化学法检测Ⅱ型胶原的表达。 结果与结论：共培养各组在各个时期细胞表型正常。G1~G3代细胞增殖活跃,G4代细胞增殖能力下降。共培养各组甲苯胺蓝与阿利新蓝染色以及Ⅱ型胶原表达在G2和G3代均较高。综合各指标认为,以软骨细胞与骨髓基质细胞的比例为5∶5,3∶7组为最佳。软骨细胞与骨髓基质细胞平面共培养,保持了软骨细胞的形态和蛋白表达特性,如进行细胞移植,选取软骨细胞与骨髓基质细胞5∶5或3∶7的比例为最佳。     

威灵仙干预体外培养兔膝关节软骨细胞增殖及转化生长因子β1 mRNA基因的表达

背景：有研究显示,威灵仙能够维持和促进软骨细胞合成蛋白多糖与Ⅱ型胶原,并可能通过抑制白细胞介素1水平的增高保护关节软骨,延缓骨关节炎的发展。 目的：在以往研究基础上,观察中药威灵仙对体外培养兔膝关节软骨细胞增殖及转化生长因子β1 mRNA基因表达的影响,探讨其治疗骨关节炎的作用及可能机制。 方法：取新西兰白兔膝关节软骨,剪碎后,采用酶消化法原代分离培养软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定后,取处于对数生长期第3代细胞随机分组,实验组分别加入0.01,0.05,0.1,0.5,1.0 g/L威灵仙培养基,对照组仅加入普通培养基进行培养。倒置显微镜下观察原代培养的软骨细胞形态变化及甲苯胺蓝染色鉴定, MTT法检测不同质量浓度威灵仙对软骨细胞增殖影响,RT-PCR法检测转化生长因子β1 mRNA表达。 结果与结论：原代软骨细胞呈圆球形,悬浮状态,24 h后大部分细胞贴壁;传代后软骨细胞生长速度加快,融合成片,外观呈典型“铺路石”状;传4代后逐渐出现长梭形软骨细胞,传代培养至6代时,呈成纤维细胞样外观,生长速度明显减慢,传代周期延长。软骨细胞经甲苯胺蓝染色后细胞外基质可见蓝色异染颗粒,细胞核染成深蓝色。不同质量浓度威灵仙均能促进软骨细胞增殖,尤以0.5 g/L增殖效果明显,且增殖高峰出现在威灵仙干预后的第3天。0.05,0.1,0.5,1.0 g/L威灵仙均能促进软骨细胞转化生长因子β1 mRNA 表达,4组组间比较差异无显著性意义(P > 0.05),但作用的高峰为0.5 g/L组。威灵仙能促进软骨细胞增殖及转化生长因子β1 mRNA的表达,提示这可能是其治疗骨关节炎的作用及可能机制之一。     

与软骨细胞共培养和条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的比较**

背景：骨髓间充质干细胞体外转化很大程度上依赖于合适的培养条件。 目的：比较与软骨细胞共培养和条件培养液2种不同的诱导方案诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特点。 方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳软骨细胞，采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养及条件培养液诱导成软骨的方法，诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。以MTT法及流式细胞仪检测细胞活性及周期，糖胺多糖、甲苯胺蓝以及免疫组化染色检测细胞生物学特性，以RT-PCR法检测诱导后的软骨细胞Ⅱ型胶原RNA表达情况。 结果与结论：采用共培养方式诱导的软骨细胞，其生物学特性与采用条件培养液诱导的软骨细胞相比，前者优于后者，如分泌糖胺多糖的能力以及基质分泌量均较高。提示共培养方式诱导的软骨细胞更接近正常软骨细胞，更有利于作为组织工程软骨的种子细胞。     

高密度细胞培养对兔关节软骨细胞糖胺多糖合成的作用

背景: 软骨细胞体外培养时常发生失分化，合成糖胺多糖的能力下降，延缓软骨细胞的失分化速度是组织工程学需要解决的重要课题。 目的：观察不同接种密度下，软骨细胞合成糖胺多糖的能力。 设计、时间及地点：对比观察细胞学实验，于2007-01/05 在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。 材料：1月龄新西兰兔5只。 方法：采用0.4% Pronase酶和0.025% Ⅱ型胶原酶消化分离双膝关节关节软骨细胞，来源于同一只兔的软骨细胞分为两部分，一部分以2×104/cm2接种，传代时仍以相同密度接种。另一部分在细胞贴壁后,人工降低细胞密度至2×103/cm2培养。倒置显微镜下观察细胞形态和增殖情况。原代和传1代细胞于细胞融合后换液。 主要观察指标：换液后12，24，36，48，60 h以改良Alcian blue 染色沉淀法测定糖胺多糖质量浓度。 结果：原代高密度培养组关节软骨细胞为多边形，轮廓清晰，三四天即可见集落形成，集落周边细胞较中心瘦长，为长多边形，传1代细胞形态无明显变化。低密度培养细胞早期散在分布，7 d左右形成集落，细胞形态与高密度培养无明显差异。原代低密度培养软骨细胞长到融合所需时间较原代高密度培养细胞所需时间长。原代低密度培养组上清液中糖胺多糖质量浓度显著低于原代及传1代高密度培养组软骨细胞(P < 0.001，P < 0.05)，且时间越长，质量浓度相差越大。　 结论：与低密度培养相比，平面高密度培养可提高软骨细胞合成糖胺多糖的能力，明显减缓软骨细胞的失分化速度，提示高密度培养更有利于软骨细胞维持表型，是软骨平面培养的较好方式。     

骨关节炎软骨细胞的体外分离培养

背景：由于体外分离培养骨关节炎患者软骨细胞存在难度，同时软骨组织中因富含大量的基质, 且软骨细胞分布于其中的软骨陷窝中, 因此与其他细胞相比, 软骨细胞的分离更为困难。 目的：从骨关节炎行人工膝关节置换者的关节软骨中分离软骨细胞，并改良其酶消化法分离软骨组织，观察软骨细胞的生物学特性。 设计、时间及地点：对比观察，实验于2007-04/2008-03在解放军第三军医大学烧伤研究所实验室完成。 对象：标本取材于解放军第三军医大学西南医院关节外科中心同期收治的10例人工膝关节置换患者软骨组织（> 3 cm）。 方法：切取原发性骨关节炎患者关节软骨，将软骨剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的碎块，以Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶消化分离关节软骨细胞,同期对比用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶消化法消化软骨后的收获细胞数及细胞成活率，分离细胞进行原代和传代培养。 主要观察指标：以倒置相差显微镜观察体外培养软骨细胞形态；以甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行软骨细胞鉴定；四甲基偶氮唑盐法测定骨关节炎细胞增殖情况。 结果：改良的Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶法，对原代关节软骨细胞的分离取得了优良而稳定的效果，与传统的胰蛋白酶消化法相比，收获细胞数为3.72×106，细胞存活率为97.5%，二者相比有显著性差异（P < 0.05）。体外培养观察软骨细胞贴壁和生长均较缓慢。原代和传代后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝异染反应均较弱。软骨细胞增殖和生长缓慢。 结论：Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶分离骨关节炎患者软骨细胞的技术简单且易操作, 分离培养的软骨细胞符合骨关节炎时软骨退变的表现, 可为骨关节炎的病因研究及软骨细胞移植治疗骨性关节炎提供实验基础。     

第1代骺板软骨细胞离心管内培养生成软骨组织的观察★

目的：骺板软骨细胞聚集体离心管内培养能生成具有良好组织结构和较高含量的软骨基质特异性成分，然而应用这一技术一般均以原代软骨细胞为种子细胞。观察第1代骺板软骨细胞高数量聚集离心管培养生成软骨组织的可行性及其生物学特点,并对此技术进行初步评价。 方法：实验于2006-07/2007-04在四川大学华西医院科研楼组织工程实验室完成。自4周龄新西兰大白兔骺板按三步酶消化法分离软骨细胞，行单层传代培养，取第1代细胞，以5×105个细胞/管接种于15 mL离心管内，离心沉降聚集，连续培养2周。大体、倒置相差显微镜观察软骨细胞形态；光学显微镜观察软骨的组织学结构；透射电镜观察了解细胞及细胞外基质的超微结构。 结果：①第1代骺板软骨细胞经离心管培养能形成软骨，随时间的延长，生成的软骨组织体积逐渐增大，到第2周时直径为1.5~2.0 mm，高为0.8~1.4 mm。②外周组织结构类似于骺软骨的生发层或软骨膜，由多层细胞构成，随时间的延长而减少。其中心为肥大软骨细胞，且随培养时间的延长而增多。2周时，软骨组织甲苯胺蓝染色呈强的红色异染反应，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性，番红“O”染色呈强阳性。③细胞核内以常染色质为主，且分布均匀，细胞周围及细胞间质结构稀疏、排列紊乱，缺乏紧密的胶原网络结构。 结论：高数量第1代骺板软骨细胞聚集离心管培养能形成软骨组织，有独特的超微结构，富含软骨特异性蛋白基质。     

关节软骨损伤后体外培养软骨细胞的功能变化

背景：关节软骨损伤可以影响软骨细胞功能,诱发创伤性骨关节炎。 目的：观察关节软骨损伤后体外培养的软骨细胞功能的变化。 方法：通过酶消化法分离培养高能量、低能量撞击后和正常兔膝关节透明软骨细胞,观察创伤能量对软骨细胞生存能力的影响;检测软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原能力,检测细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平,检测细胞合成白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的表达。 结果与结论：高能量和低能量关节软骨损伤后,软骨细胞的存活率下降,原代细胞的贴壁细胞数量减少,贴壁时间延长,生长曲线下移,细胞甲苯胺蓝染色异染反应减弱,Ⅱ型胶原免疫组化染色强度减弱,软骨细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平上升,细胞培养液中白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的质量浓度升高,其中高能量组效果更为显著(P < 0.05)。说明关节软骨损伤后软骨细胞的功能受到影响,受损程度与创伤强度及炎性细胞因子的表达相关。     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

背景：骨髓基质干细胞的多向分化性不利于向软骨细胞单一方向分化,植入体内后成骨系细胞分泌的骨形态发生蛋白作用于非定向分化的前体细胞,使其向成骨细胞分化,而已定向分化的细胞则不受骨形态发生蛋白的影响,形成相应的组织。 目的：体外诱导犬骨髓基质干细胞定向分化为软骨细胞,探讨体外诱导成软骨的方法和条件。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2005-03/2006-01在中山大学组织工程实验室完成。 材料：选取4个月龄雄性家犬1只,骨髓基质干细胞取自犬肋骨。 方法：自犬肋骨取骨髓2.0~3.0 mL行体外原代骨髓基质干细胞分离培养。8~11 d细胞接近融合时,加入胰酶消化,用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM合成培养液终止消化,收集细胞悬液,离心后,用培养液悬浮细胞,按1∶3接种传代。取第3代细胞培养扩增,换液时加入10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子2 mL,换液2次后,再加入 1 mg/L转化生长因ß1 2 mL诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化。 主要观察指标：行甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。 结果：骨髓基质干细胞体外行原代和传代培养至P4代生长良好,经碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因ß1扩增诱导的细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;II型胶原免疫组织化学检测阳性,显示被诱导的骨髓基质干细胞具备软骨细胞特性。 结论：应用碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因ß1体外可以诱导犬骨髓基质干细胞分化为软骨细胞,诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞。     

脂肪干细胞与软骨细胞共培养的实验研究

背景：有研究发现关节软骨微环境可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。 目的：验证软骨细胞能否诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,以便成为组织工程构建关节软骨可能的新方法。 设计、时间及地点：随机对照细胞实验,于2007-09/2008-07在南京大学生物医药生物技术国家重点实验室完成。 材料：清洁级成年新西兰大白兔,雌雄不限,体质量1.5~2.0 kg。 方法：分离培养原代新西兰大白兔脂肪干细胞和软骨细胞,分别种植于6孔板和插入式细胞培养皿共培养2周后,胰酶消化终止。脂肪干细胞分别行油红O染色、碱性磷酸酶检测和甲苯胺蓝染色法鉴定。 主要观察指标：倒置显微镜观察共培养前后脂肪干细胞的形态变化。甲苯胺蓝染色法检测共培养后脂肪干细胞的蛋白多糖的表达水平。免疫细胞化学检测共培养后脂肪干细胞的Ⅱ型胶原的表达水平。反转录-聚合酶链反应检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录水平。 结果：脂肪干细胞分别经油红O染色、碱性磷酸酶染色和甲苯胺蓝染色法鉴定证实,分离的细胞具有多向分化能力,是脂肪来源的间充质干细胞。共培养1周后部分脂肪干细胞变圆,2周时其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高。 结论：与软骨细胞共培养后,脂肪干细胞可以被诱导成软骨样细胞。     

同种异体鼻中隔四方软骨修补鼻中隔穿孔：9例报告

目的：探讨应用同种异体鼻中隔四方软骨修补鼻中隔穿孔的效果。 方法：选择2004-01/2008-10在中南大学湘雅三医院耳鼻咽喉-头颈外科就诊的鼻中隔穿孔患者9例，用鼻中隔黏膜下矫正术的方法分离鼻中隔穿孔周围的黏软骨膜，取同种异体鼻中隔四方软骨固定于鼻中隔黏软骨膜下，完全覆盖鼻中隔穿孔。 结果：9例患者术后48 h内鼻腔无活动性出血，抽出湿润烧伤膏纱条后未见移植四方软骨移位，穿孔部位封闭。术后随访观察6~18个月，异体鼻中隔两侧面已被移行上皮完全覆盖，表面光滑。植入的同种异体鼻中隔四方软骨未见排异现象，无再穿孔。 结论：同种异体鼻中隔四方软骨修补鼻中隔中、小穿孔简单、有效，无不良反应，作为一种方法可供临床参考。     

大鼠膝关节软骨不同染色方法的差异

背景：国内外学者对关节软骨对软骨进行了大量研究,需要用不同的染色方法对研究结果进行分析,但将多种染色方法同时应用于软骨研究及探讨染色机制的较少。 目的：探讨不同染色方法对大鼠膝关节软骨染色的优缺点。 方法：取正常大鼠膝关节软骨,行苏木精-伊红、番红O、阿尔辛蓝、甲苯胺蓝、番红-阿尔辛蓝、番红-固绿染色,观察软骨结构。 结果与结论：苏木精-伊红、番红O、甲苯胺蓝染色均可观察到潮线,分别为蓝色、红色和蓝色,番红O和甲苯胺蓝染色强度朝潮线方向增强,番红O染色对潮线的观察优于其他染色方法。苏木精-伊红染色关节软骨4层结构清晰,软骨细胞呈柱状排列,基质呈均匀呈嗜碱性染色。番红O染色显示4层结构层次清楚,基质深层染色最红。阿尔辛蓝染色显示,pH 1.0时软骨细胞周边部分被阿尔辛蓝强烈染色,pH 2.5时阿尔辛蓝染色较深。甲苯胺蓝染色显示组织结构层欠清,胞核染色清晰,胞浆几乎不着色,基质呈淡蓝紫色。番红-阿尔辛蓝染色显示软骨表面及基质呈不均一的红色,深层颜色较深,软骨细胞周围蓝染;番红-固绿染色显示软骨基质呈均匀的红色,软骨下骨呈绿色,软骨组织与骨组织分对比鲜明。提示上述各种方法均可观察到软骨的四层结构,但以番红O染色显示软骨各层和潮线结构最佳;苏木精-伊红染色观察软骨细胞形态变化较其他方法清楚。     

组织块培养法扩增人脂肪源性干细胞的生物学特征鉴定

背景：组织块培养法分离人脂肪源性干细胞并进行体外培养,培养体系简单,节约时间,较好地保持了干细胞的生物学特性,并据此向多方向诱导分化,为组织工程学种子细胞的临床应用提供理论依据和参考路线。 目的：观察组织块培养法分离的人脂肪源性干细胞的基本生物学特性、表面抗原特点及其向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化潜能。 方法：取健康人腹部皮下脂肪组织,组织块培养法分离出脂肪源性干细胞,进行体外培养,观察其形态特征。流式细胞仪检测第3代脂肪干细胞的细胞周期及表面抗原。取第3代人脂肪干细胞,分别用成骨和成脂诱导培养液诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,Von Kossa染色、油红O染色定性鉴定。 结果与结论：原代及传代的人脂肪干细胞形态均类似成纤维细胞,生长能力旺盛。第3代人脂肪干细胞中,超过88%的细胞都处于G0/G1期。第3代脂肪干细胞表面抗原表达：CD29、CD44、CD90、CD105表达阳性,CD34、CD45、CD106表达阴性。人脂肪干细胞经成脂诱导后21 d,油红O染色阳性;成骨诱导培养后,茜素红染色和Von Kossa染色阳性。因此,实验证实人脂肪源性干细胞能向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化。     

动物源性骨软骨支架复合骨髓间充质干细胞/软骨细胞修复兔膝关节骨软骨复合缺损

摘要 背景：以往支架材料修复骨软骨的实验大都存在骨软骨耦合界面修复不良的情况。 目的：观察骨髓间充质干细胞/软骨细胞复合动物源性骨软骨支架修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性。 方法：将新西兰大白兔随机抽签分为实验组、对照组、空白组,制作单侧膝关节骨软骨复合缺损后,实验组于骨缺损处植入自体骨髓间充质干细胞/诱导分化的软骨细胞与同种异体动物源性骨软骨复合支架,对照组于骨缺损处植入同种异体动物源性骨软骨支架、空白组未植入任何材料。术后4,8,12周行大体观察、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色。 结果与结论：实验组大体观察见复合缺损区完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合,苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色见软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好,甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分优于对照组、空白组(P < 0.05)。说明诱导分化的自体软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养复合动物源性骨软骨支架所构建的细胞-支架复合体能成功修复兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损,是一种理想的骨软骨复合缺损修复方法。 关键词：动物源性;支架;骨髓间充质干细胞;软骨细胞;修复;缺损 中国组织工程研究与临床康复, 2011,15 (12): 2265-2269.     

褪黑素与复方倍他米松治疗大鼠实验性膝骨性关节炎的研究

背景：骨性关节炎（OA）是以关节软骨被侵蚀为特征的关节慢性疾病,由于缺乏血管和神经分布,因此,关节软骨组织的自我修复能力较差。 目的：评估联合应用褪黑素和复方倍他米松对雄性大鼠骨关节炎关节软骨的的影响,从而探讨褪黑素和复方倍他米松的联合应用在骨性节关炎发病机制中的作用。 方法：雄性SPF级SD大鼠40只,通过在大鼠膝关节腔注射4% papain（木瓜蛋白酶）溶液0.2ml制作骨性关节炎模型和采用持续光照的方法建立大鼠去松果体模型。实验随机分为4组：Ⅰ组：正常对照组(n=10);Ⅱ组：骨性关节炎组（n=10）;Ⅲ组：Ⅱ组 持续24h光照组（n=10）;Ⅳ组：Ⅲ组 给予褪黑素和复方倍他米松治疗（n=10）。成功建立模型1周后,Ⅳ组左膝关节腔注射浓度为20mg/ml褪黑素溶液0.2ml,每周4次,复方倍他米松0.1ml,每周1次,共4周。后应用ELISA测取大鼠2Am和2Pm的血清褪黑素含量,并处死全部老鼠,同时切取股骨髁进行大体观察,之后脱钙制片,行HE和甲苯胺蓝染色观察 (均采用Mankin法进行评分)。 结果：（1）大体观察：Ⅰ组软骨表面光滑,有弹性且边缘规整;Ⅱ组软骨表面凹凸不平,失去原有的光泽,存在软骨软化现象及软骨下骨外露,Ⅲ组较Ⅱ组严重;Ⅳ组软骨软化现象消失及软骨剥脱,软骨下骨外露减少。（2）HE染色观察：Ⅰ组软骨细胞大小一致,排列规整;Ⅱ组软骨细胞排列紊乱,局部可见簇聚现象,Ⅲ组较Ⅱ组严重;Ⅳ组软骨细胞排列较规则,炎性细胞侵润明显较少。（3）甲苯胺蓝染色观察：Ⅰ组：甲苯胺蓝染色均匀, 软骨基质呈淡紫色,细胞核呈深蓝色,关节软骨结构层次清晰,潮线完整,无失染现象;Ⅱ组：软骨细胞排列及层次结构较紊乱,有明显失染现象,部分区域软骨细胞大小不一,可见大量簇聚现象;Ⅲ组：观察结果与Ⅱ组相似,但簇聚现象及基质失染现象较Ⅱ组明显;Ⅳ组：与Ⅱ、Ⅲ组比较,软骨细胞排列及结构较整齐,失染现象减轻,软骨弥散性细胞明显减少。同时,4组HE和甲苯胺蓝染色的Mankin评分比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。 结论：20mg/ml褪黑素溶液0.2ml联合7mg/ml复方倍他米松溶液0.1ml关节腔注射治疗4周后能够抑制软骨病变发展。 关键词：骨性关节炎;褪黑素;复方倍他米松;关节软骨; 中图分类号：R684.3 文献标识码：A     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞作为种子细胞在组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要。 目的：以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成。 材料：SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14 d。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力。 结果：与密度梯度离心法相比,全骨髓贴壁法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合素家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性。 结论：采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法。经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞。     

离心管内培养第1代骺板软骨细胞作为软骨移植材料的可行性

目的：作者前期研究已证明，第1代骺软骨细胞可在离心管内形成富含软骨特异性蛋白基质的软骨组织。本实验进一步观察第1代骺板软骨细胞在离心管内培养形成的软骨组织特征，并与半月板、骺板及关节软骨组织进行比较。 方法：实验于2006-07/2007-04在四川大学华西医院科研楼组织工程实验室完成。取4周龄新西兰大白兔四肢骺板分离软骨细胞，行单层传代培养，取第1代细胞行无支架离心管培养，观察其形成的软骨组织特征,另取6周龄新西兰大白兔股骨髁关节软骨、胫骨近端骺板及半月板，与离心管培养软骨一并行透射电镜观察，比较其软骨细胞及细胞外基质结构。 结果：第1代骺板软骨细胞经无支架离心管培养能形成软骨。离心管内培养形成的软骨具有独特的超微结构，与骺板及关节软骨有一定的相似性，而与半月板有明显区别。4种细胞都有各自不同的细胞及细胞外基质特征。 结论：第1代骺板软骨细胞在离心管内培养形成的软骨组织具有与骺板及关节软骨相似的微观结构。     

脱细胞猪小肠黏膜下层支架复合软骨细胞构建组织工程软骨*☆

背景：关节软骨损伤后无论是否施加干预,都难以达到满意的修复效果。 目的：观察以猪自体软骨细胞为种子细胞复合脱细胞猪小肠黏膜下层构建组织工程软骨的可行性。 方法：将培养至第3代的猪膝关节软骨细胞接种于小肠黏膜下层膜上,复合培养48 h,构建细胞-载体复合物,光学显微镜、扫描电镜观察软骨细胞在小肠黏膜下层膜上的生长情况。 结果与结论：苏木精-伊红染色见细胞在小肠黏膜下层基质层表面呈单层或复层生长;免疫组织化学染色结果显示软骨细胞与小肠黏膜下层表面之间形成一条连续阳性表达条带;扫描电镜见软骨细胞在支架孔隙内贴壁良好生长。